蛋白激酶Cβ异构体在恐惧调节中的作用

摘要

钙和磷脂依赖性蛋白激酶（PKC）是突触传递和神经元功能的多功能调节器。这种酶家族调节神经递质的释放(Malenka等人，1986年;尼科尔斯，1998年;史蒂文斯和沙利文，1998年)，控制膜的电气性能(霍夫曼和约翰斯顿，1998年;Manseau等人，1998年)，调节神经递质受体功能(Roche等人，1996年;Macek等人，1998年;Suen等人，1998年)，并调节成熟神经元的基因表达。(Roberson等人，1999年). PKC活性的调节与突触可塑性和学习记忆有关海兔属(Sacktor等人，1988年;拜恩和坎德尔，1996年;Manseau等人，1998年),赫米森达(法利和舒曼，1991年;亚莫阿和克劳，1996年),果蝇属(Choi等人，1991年;Mihalek等人，1997年)和蜜蜂(穆勒，1999年)在小鸡身上留下印记(Sheu等人，1993年). 此外，在眨眼条件反射的研究中，PKC与哺乳动物模型系统的学习和记忆有关(范德泽等人，1997年)，空间学习(Paylor等人，1991年,1992;科伦坡等人，1997年)，条件性味觉厌恶(Yaoshima和Yamamoto，1997年)和条件性回避(Jerusalinsky等人，1994年).

在哺乳动物中，PKC酶家族是非常异质的，由11种已知同工酶组成，分为三个主要亚群：传统的[α，βI，βII和γ(Coussens等人，1986年;Parker等人，1986年)]、新的[δ、ε、η和θ(Ono等人，1987年;Osada等人，1990年,1992;Saido等人，1992年)]和非典型[λ和ζ(Ogita等人，1992年)]. 每个亚型都由一个单独的基因编码，但βI和βII亚型除外，它们是剪接变体。各种亚型表现出细胞和组织特异性表达(Huang等人，1987年;Oehrlein等人，1998年)，每个亚型子集都受到不同的控制机制的制约(康纳和斯威特，1993年;德克尔和帕克，1994年). 常规亚型由钙、二酰甘油和膜磷脂共同调节，而新型和非典型亚型在结构上同源，但可以独立于钙进行调节。

尽管PKC酶家族在各种形式的哺乳动物学习中广泛发挥作用，但PKC亚型对学习和记忆的具体贡献尚不清楚。敲除PKC脑特异性γ亚型对记忆的影响不大(Abeliovich等人，1993年)表明其他PKC亚型参与哺乳动物的学习和记忆。在目前的研究中，我们试图通过研究同源重组产生的小鼠系来增加对PKCβ在突触可塑性和记忆中作用的理解，在该系中，编码PKC的两种β亚型的基因被β-半乳糖苷酶取代。我们观察到PKCβ，特别是PKCβII在海马CA1区和杏仁核基底外侧核有显著表达。令人惊讶的是，PKC缺乏的动物在海马突触传递或长期增强（LTP）方面没有表现出缺陷。然而，PKCβ基因的缺失导致了两种杏仁核依赖性学习任务的缺陷，即线索和背景恐惧条件反射。因此，我们的数据表明，PKC的βII亚型在杏仁核依赖性联想学习的突触可塑性中具有重要作用。

材料和方法

PKCβ敲除物和对照品的生产。如前所述，生产PKCβ缺陷小鼠并进行基因型测定(Leitges等人，1996年). 最初，PKCβ基因缺失杂合小鼠被培育成C57BL/6野生型（wt）动物。然后将杂合子与C57BL/6wt回交8代或10代，并使用两组不同的动物进行我们的实验。在第一系列实验中，对纯合子PKCβ基因敲除物和从PKCβ杂合子育种（8次回交）获得的同窝对照进行了电生理、生化和行为分析。在第二组实验中，我们使用10个杂合子回交获得的纯合子敲除动物，通过与用于回交的C57BL/6野生型系的年龄匹配对照进行比较，复制了我们的恐惧调节结果。从两组不同的动物中获得的数据无法区分，并且将结果汇总用于一些实验。总的来说，在两次试验恐惧条件下使用的对照包括17个野生型同窝对照和6个年龄匹配的野生型对照。对恐惧条件反射数据的分析显示，同窝婴儿和年龄匹配的对照组之间没有统计上的显著差异。控制实验包括过度训练（五次试验恐惧条件反射）和随后的线索和背景试验，只使用了10次回传和年龄匹配的对照。

免疫组织化学。用氯胺酮和甲苯噻嗪腹腔内麻醉成年小鼠，并经心灌注10 ml 0.9%氯化钠，然后灌注50 ml pH 7.4的3%多聚甲醛和1%戊二醛PBS。然后将大脑在4°C的30%蔗糖中冷冻24–48小时，然后冷冻并安装以进行冷冻切片。切割切片（20μm）并立即解冻，将其安装在Plus载玻片上。对于β-半乳糖染色，切片在含有1 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β的溶液中培养-d日-吡喃半乳糖苷（X-Gal），4 m米亚铁氰化钾，4 m米铁氰化钾，和2 m米氯化镁在PBS中，在4°C的加湿室中过夜。对于异形特异性抗体免疫组织化学，切片在0.3%的H中孵育₂哦₂室温下在甲醇中浸泡30分钟，在含有0.2%Triton X-100（PBST）的PBS中洗涤，并在含有5%正常山羊血清的PBST中封闭。从载玻片上吸出封闭培养基，然后在4°或37°C的加湿室中用1:1000稀释的一级抗体培养切片过夜。在PBST中再次清洗切片，并在室温下用1:200稀释的山羊抗兔生物素化二级抗体孵育30分钟（ImmunoPure ABC过氧化物酶-兔IgG染色试剂盒；Pierce，Rockford，IL）。用PBST再次清洗切片，然后在室温下用1:50稀释的ABC试剂培养30分钟。切片再次在PBST中清洗，并用金属增强DAB显示染色。然后对切片进行冲洗、清理，并使用二甲苯基介质盖住切片。

蛋白质印迹。这些动物被斩首杀害。立即取出大脑，并在冰镇盐水中灌注（单位：m米：125氯化钠、2.5氯化钾、1.25氢氧化钠₂人事军官₄，25氯化钠_三, 25d日-葡萄糖，2 CaCl₂和1 MgCl₂，95%O饱和₂和5%CO₂pH值为7.4）。解剖海马，然后在2–3 ml缓冲液（20 m）中均质米三氯化氢，pH 7.5，1 m米EGTA，1米米EDTA、25μg/ml抑肽酶、25μg/ml亮氨酸肽、1 m米纳₄P（P）₂哦₇, 500 μ米苯甲基磺酰氟，4米米段落-硝基苯磷酸和1 m米原钒酸钠）。立即将样品缓冲液添加到匀浆中，并将样品在100°C下煮沸10–15分钟。样品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳印迹到Immobilon-P，并封闭在TTBS缓冲液（50 m）中米Tris-HCl，pH 7.5，150米米氯化钠和0.05%吐温20）。由于杏仁核的细胞异质性、缺乏明确的解剖结构以及难以快速解剖，因此杏仁核不适合进行这种形式的生化分析，因此我们选择对海马进行分析，以研究PKCβ缺陷小鼠可能的代偿性生化变化。

用3%牛血清白蛋白或5%奶粉和1μ米微囊藻毒素。如前所述，对PKC总量进行抽检(Chen等人，1997年). 用与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育所有印迹，并使用增强化学发光法（伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham Pharmacia Biotech）进行开发。通过密度测定法测定每个激酶的总蛋白量，并相对于每个匀浆的Lowry分析进行归一化(Lowry等人，1951年). 使用NIH Image软件，使用StudioScan台式扫描仪对条带密度进行量化。Western blot在用于密度测定的范围内呈线性。

恐惧调节。小鼠按12小时的光/暗时间表饲养。所有实验均按照贝勒医学院动物护理和使用委员会以及国家法规和政策进行。为了提示和关联恐惧条件反射，将动物置于恐惧条件反射装置中2分钟，然后发出30秒的声音条件反射刺激（CS；白噪声）。在音调的最后2秒钟内，对地板网格施加0.5毫安的电击[无条件刺激（US）]。在配对之间用2分钟重复此协议两次。在初步实验的基础上，选择刺激强度和训练对数来优化学习。为了评估情境学习，训练后24小时将动物放回训练情境中，并对其进行5分钟的冷冻评分。为了评估线索学习，训练24小时后将动物放在不同的情境中（新气味、笼底和视觉线索）。在新的环境中测量基线行为3分钟，然后呈现声学CS 3分钟。通过每5秒测量一次冻结行为（即静止位置）来评估学习。行为实验的计分员参照动物基因型是盲目的。在上下文和线索学习测试后的一天，淘汰小鼠和对照小鼠的一个子集使用五个CS-US配对的范式进行再训练。为了评估短期线索学习，在完成再培训课程后1-2小时，将动物置于不同的环境中，并根据声学CS的表现评估其冻结情况。如上所述，24小时后测试长期语境和线索学习。

行为评估。如前所述，使用开放式现场任务测量一般活动水平(Paylor等人，1998年). 在标准房间照明条件下，将动物置于开阔场地（40×40×30 cm）室内30分钟。开放场中的活动由位于腔室两侧的16束感光束监测，并由计算机操作的Digiscan光学动物活动系统进行分析。加速旋转试验用于评估整体平衡和运动协调性。被动回避被选为一种控制范式，因为它与恐惧条件反射相似，都有能力使用厌恶刺激产生鲁棒的联想学习。将动物放在55°C的热板上，测定其嗅觉，并测量舔后爪的潜伏期。

海马切片制备。如前所述进行海马切片制备和电生理学检查(Roberson和Sweatt，1996年). 刺激Schaffer侧支通路，并在CA1区的放射层中进行现场记录。测量群体EPSP（pEPSP）的初始斜率。以最大pEPSP的30–40%的刺激强度进行测试刺激（0.05 Hz）。破伤风刺激由两个100 Hz、1秒长的破伤风组成，在测试刺激强度下间隔20秒。

数据分析。通过单向方差分析进行统计分析，然后使用Tukey检验或Student’s检验进行配对比较t吨测试。所有值均为平均值±SEM*第页<0.05**第页< 0.01; 和***第页< 0.001.

结果

PKCβ表达模式

通过检测特定信号转导蛋白在中枢神经系统中的表达模式，通常可以了解其功能作用(Huang等人，1987年;Hosoda等人，1989年;Saito等人，1989年;Xia等人，1991年). 为了便于这类分析，我们使用同源重组方法构建了一个小鼠系，其中PKCβ基因的第二外显子被β-半乳糖苷酶（β-gal）基因取代(Leitges等人，1996年). 这种操作同时消除了PKCβ的表达，并提供了一个独特的分子标记，以便确定PKCβ基因上游调控元件编码的表达模式。通过提供底物X-gal可以追踪β-gal的表达，这会在我们小鼠系的中枢神经系统中的β-gal表达位点产生蓝色标记。

从我们的PKCβ小鼠系获得的大脑在X-gal中孵育，显示了一个有趣的表达模式（图。​（图11A、 B类). β-Gal在与学习和记忆有关的几个脑区表达显著，包括新皮质、小脑、海马CA1区和杏仁核基底外侧核。这种基因表达模式有点像钙的α亚单位²⁺钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII），其上游启动子区域被用于选择性地消除皮层区域的基因表达(Tsien等人，1996年). 总之，表达模式表明PKCβ参与啮齿类动物的空间学习或联想学习。

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图1。

PKCβ在大脑中的分布。X-半乳糖染色(A、 B类)海马CA1显著染色，CA3轻度染色。杏仁核、纹状体、体感皮层、小脑和内嗅/嗅周皮质区的外侧核和基底外侧核均可见中度染色。PKCβI亚型抗体的免疫组织化学研究(C、 D类)海马体基本上没有染色(C类)或者杏仁核(D类). 使用抗βII亚型抗体的免疫组织化学(E、 F类)海马CA1的起始层和放射层染色，而锥体层未染色(E类). 杏仁核(F类)基底外侧核纤维染色。中表示的结构D–F型从单个小鼠中获得，并并行处理。

我们从小鼠的β-gal表达模式推断，PKCβ基因在β-gal染色突出的大脑区域正常表达，但这种启动子导向的方法有两个局限性。首先，β-gal表达模式可能无法准确反映完整PKCβ编码基因表达的天然PKC的表达模式。其次，β-gal表达模式无法区分βI和βII剪接变异的表达，这可能具有不同的调节机制。为了解决这两个局限性，我们使用免疫组织化学方法在C57BL/6亲代小鼠的中枢神经系统中定位PKCβI和βII。我们的免疫组化结果与基因敲除动物中的β-gal表达模式非常一致，表明PKCβ在皮层、海马和杏仁核中的表达模式类似（图。​（图1）。1). 有趣的是，PKCβII剪接变体似乎只在海马和杏仁核中表达（图。​（图11E、 F类)与PKCβI剪接变异体相比，在这些区域基本上没有免疫反应（图。​（图11C、 D类). 这一观察结果表明，这些细胞类型中剪接变异体产生机制得到了高度控制，并表明PKCβ缺陷小鼠表现出的任何海马或杏仁核依赖性缺陷都可归因于PKCβII亚型的丢失。

在观察到小鼠中枢神经系统中PKCβ表达的有趣模式后，我们试图通过表征我们的PKCβ缺陷小鼠系来确定PKCβ丢失的影响。结果如图所示​图1，1，加上额外的组织学染色（数据未显示），表明PKCβ的丢失并未导致CNS的大体解剖异常。这些结果表明，PKCβ对CNS的正常大体解剖发育是不必要的。

因此，我们试图确定PKCβ的丢失是否会导致解剖层面无法观察到的更微妙的功能缺陷。为此，我们对PKCβ缺陷小鼠的突触生理进行了表征。我们选择使用体外海马切片进行这些研究，因为这是研究小鼠突触功能的最具特征的系统。在这些实验中，我们使用细胞外记录Schaffer侧支传入CA1区，不仅因为这是这类研究的标准技术，而且因为该位点突触后锥体神经元中PKCβ的显著表达（见图。​图1）。1). 此外，在我们的转基因小鼠系中，突触前CA3锥体神经元中有少量但可检测到的β-半乳糖苷酶表达。因此，如果PKCβ基因敲除时突触功能发生紊乱，则此突触似乎是检测突触功能紊乱的一个可能位置。

电生理评估

PKCβ亚型的缺失似乎对Schaffer侧支突触的基线突触传递没有不利影响，因为对照组和敲除组小鼠刺激CA1区的输入输出功能没有差异（图。​（图22A类). 如果有什么不同的话，在这些研究中，PKCβ基因敲除在纤维束振幅-EPSP斜率关系中显示出轻微增加，表明突触传递略有增加；然而，这种影响在统计学上并不显著(第页= 0.33). 配对脉冲促进（PPF）是一种短期突触可塑性，通常被认为是由突触前释放的残余钙增强神经递质引起的。因为PKCβ是一种钙依赖性形式的PKC，所以我们确定PKCβ基因敲除小鼠的PPF是否减弱。与基线突触传递一样，敲除组PPF正常，表明PKC的β亚型不是Schaffer侧支突触PPF机制的组成部分（图。​（图22B类).

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图2。

海马CA1区Schaffer侧支突触的电生理反应。A类PKCβ缺失对25°C时PKCβ缺乏小鼠（○）或野生型小鼠（●）海马CA1区放射层的基线突触传递无影响。插入，先前基线突触传递的代表性轨迹（6个连续场EPSP的平均值）。校准：2毫伏，4毫秒。B类，PKCβ缺陷小鼠的配对脉冲促进作用也不受影响。

大量使用多种生化和药理学方法的研究表明，在CA1区NMDA受体依赖性LTP的诱导中，PKC激活是必要的(马利诺等人，1988年;雷曼等人，1988年;Malinow等人，1989年;王和冯，1992年;Hvalby等人，1994年). 特别是，利用微电极技术进行的精细研究表明，突触后PKC在沙弗侧支突触诱导LTP中的充分性和必要性(Hu等人，1987年;Malinow等人，1989年;王和冯，1992年;Hvalby等人，1994年). 鉴于PKCβ在这些细胞中的显著表达（图。​（图1），1)，我们试图确定PKC的β亚型是否有助于LTP在CA1区的诱导或表达。

在我们的第一系列实验中，LTP是由两个间隔20秒的1秒、100Hz的破伤风诱发的，并对突触效能进行了90分钟的监测。该LTP诱导方案给出了一个相当适度的LTP，作为CA1区LTP容量差异的敏感指标。此外，使用该程序，我们可以监测高频破伤风后立即产生的短暂破伤风后遗症增强（PTP）（图。​（图3三A类). 我们在使用这种强直刺激方案的PKCβ缺陷小鼠中观察到PTP或LTP没有差异。此外，当LTP诱导方案之后立即采用去电位方案（5 Hz刺激5分钟；图。​图3三B类)PKCβ缺陷小鼠与对照组无明显区别。

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图3。

海马LTP。在以下实验中，从PKCβ缺陷小鼠（○）或野生型小鼠（●）获得的海马脑片被给予LTP诱导刺激(箭头)在稳定的基线反应后分娩，记录20分钟。每组破伤风由两组100 Hz的刺激组成，持续1秒，间隔20秒。A类，与野生型相比，突变海马脑片显示出正常的LTP，这是在一个适度的LTP诱导方案中，该方案包括一组破伤风，同时将脑片保持在25°C。B类，PKCβ缺陷小鼠在25°C下单组破伤风后，通过低频5Hz刺激（5min）测定的电位降低程度与野生型相同。C、 在使用更稳健的LTP诱导方案的实验中，未观察到PKCβ突变体LTP的差异，该方案包括三组100 Hz的破伤风，间隔10分钟，同时将切片保持在32°C的高温下。

在较高温度下使用重复序列破伤风刺激的破伤风激发协议可产生更强健和持久的LTP，该LTP使用不同的信号转导机制进行诱导(Chetkovich等人，1993年). 我们还确定了这种刺激方案是否揭示了突触增强中需要PKCβ的成分，并发现，与上述结果类似，在PKCβ敲除小鼠中，PTP和LTP没有显著差异（图。​（图3三C类).

总的来说，我们的数据表明，PKCβ缺乏动物海马脑片中的LTP没有受到影响。静息后增强是正常的，短期增强也是正常的；这些发现表明，短期突触前可塑性和NMDA受体介导的CA1区突触传递增强均不受PKCβ损失的影响。更具体地说，我们的结果表明，广泛报道的海马LTP对PKC的依赖性并不是PKCβ活性受阻的表现。这些结果的另一个含义是，PKCβ基因敲除的任何行为效应都不能归因于对海马CA1区基线突触传递或NMDA受体功能的非特异性影响。

我们的结论是，Schaffer侧支突触的LTP不需要PKCβ，但需要注意的是，PKCβ的缺失可能导致急性或发育性代偿性改变，从而缓解LTP对PKCβ需求。我们获得了两条独立的证据，表明这种替代方案并非如此。首先，在PKCβ缺陷小鼠的Western blotting研究中，我们发现PKC酶家族其他成员的表达水平没有改变（图。​（图44A类). 因此，在PKCβ缺陷小鼠系中，PKC的其他经典亚型没有发生代偿性上调。此外，PKCβ基因敲除小鼠在Schaffer侧支突触处确实表现出PKC介导的突触调制缺陷。我们观察到，PKCβ缺陷小鼠CA1区佛波酯诱导的突触增强显著减弱（图。​（图44B类). 该对照实验表明，PKCβ的丢失确实会导致Schaffer侧支突触的生理调制发生可检测的变化，而PKCβ缺陷小鼠的生理调制尚未得到补偿。总的来说，这些生化和生理控制实验巩固了我们的结论，即PKC的β亚型对于使用标准LTP诱导方案的破伤风诱发LTP来说是不必要的。

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图4。

PKCβ缺陷小鼠PKC缺乏代偿性变化。A、 顶部，PKCβ敲除物、对照小鼠或纯化的PKCβII蛋白的海马匀浆中PKCβ、PKCα和PKCγ蛋白的代表性西方分析。底部，PKCβ基因敲除小鼠与对照小鼠中蛋白激酶C表达的百分比变化显示了每种钙²⁺-依赖性蛋白激酶C亚型。所有PKC密度测量值均归一化为从整个海马匀浆中获得的相应总蛋白量。PKCα的PKC表达水平无统计学意义的变化(n个=4）或PKCγ(n个= 4).N个/D、，无法检测到。B类，磷酸酯酶诱导的突触传递增强在PKCβ缺陷小鼠中降低。结果显示，25分钟的5μ米对照组（+/+；n个=4）和PKCβ-缺陷型（−/−；n个=7）海马切片。对照组与敲除组小鼠的差异具有统计学意义(第页<0.01），并且与生化数据一致，表明PKCβ缺陷小鼠中缺乏其他PKC亚型代偿性变化。

情境恐惧条件作用与线索学习

我们首先研究了敲除小鼠的恐惧条件性，因为这种条件性范式引发了涉及海马体和杏仁核的强大联想学习，我们确定这些大脑区域高水平表达PKC的βII亚型。在这些实验中，在一个新的环境中，将厌恶性刺激（在本例中为轻度脚部电击；US）与听觉CS（白噪声）配对两次。在训练后24小时进行测试时，对照组小鼠表现出明显的恐惧，通过冷冻行为来衡量，以回应上下文（上下文恐惧条件反射）或不同上下文中传递的声学CS（线索恐惧条件反射；图。​图5）。5). 有趣的是，在两个单独的实验中，缺乏PKCβ亚型的小鼠在线索和背景变量中都表现出了恐惧条件反射的显著缺陷。这尤其有趣，因为上下文和线索恐惧条件作用都被认为依赖于杏仁核基底外侧核的可塑性变化，而上下文恐惧条件作用也涉及海马体(哈格里夫斯和凯恩，1992年;Bordi等人，1996年;Favata等人，1998年). 因此，根据PKCβ缺陷小鼠海马的正常突触可塑性，这些观察结果提示PKCβ在杏仁核正常功能中的必要性，并强烈暗示PKCβ对杏仁核依赖性学习的突触可塑性的作用。

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图5。

恐惧调节。左侧，我们对PKCβ基因敲除小鼠（○）和同窝野生型小鼠（●）的初步发现进行了比较。正确的，使用一组幼稚PKCβ缺陷小鼠和年龄匹配的C57BL/6对照小鼠复制这些实验。A类，PKCβ缺乏或野生型小鼠训练当天的冷冻行为。野生型小鼠在休克反应中表现出明显更高的冷冻水平(第页<0.05）比PKCβ基因敲除小鼠的初始结果好，但重复实验时，这种差异不显著。声学CS分为两个阶段下划线的脚电击出现在箭头.B、，在最初的结果中，PKCβ缺陷小鼠在训练环境中对替代物的反应表现出明显更少的冷冻(第页<0.01）。在第二次实验中重复了这种效果(第页< 0.01).C类在这些实验中，动物所处的环境与训练它们的环境不同。声学CS演示由线在两个初始实验中，PKCβ基因敲除小鼠在训练24小时后出现CS后，其冷冻反应受损(第页<0.01）和复制实验(第页< 0.001). 对于所有图表，每5秒对冻结进行一次评分，并在1分钟内进行平均。

我们进行了一系列广泛的行为控制实验，以支持我们的结论，即PKCβ缺陷小鼠缺乏学习和记忆，而不是有正常的感觉或运动功能紊乱。首先，我们在恐惧调节训练阶段对动物进行了监测。我们评估了动物因脚电击而冻僵的情况。PKCβ缺陷小鼠对足部电击表现出冷冻反应，这表明它们能够感觉到我们的足部电震。我们还对PKCβ基因敲除小鼠的正常感觉信号转导进行了另外三个对照实验。首先，我们评估了被动回避。在这项测试中，动物学会抑制正常的寻暗反射，因为它们进入暗室时会受到脚部电击。这种控制特别有吸引力，因为它使用相同的厌恶性感官刺激（0.5毫安的足部电击）作为恐惧条件反射的线索。在这些实验中，PKCβ基因敲除的动物表现出与对照组无明显区别的条件性回避（图。​（图66A类). 这是一个令人惊讶的结果，因为人们相信，恐惧条件和被动回避学习都存在类似的机制。然而，我们的结果表明，这两种范式之间可能存在机制上的差异，这可能是因为，与只需要记住和识别亮区或暗区的被动回避相比，在学习电击体验和形成恐惧调节情境的环境线索星座之间的联系方面存在差异。此外，热板和电击阈值测试用于测试脚对有害刺激的敏感性。PKCβ缺陷动物对55°C的加热板表现出正常的感觉反应(第页= 0.304; 图。​图66A类)通过记录退缩、跳跃或发声的量来评估突变体对脚部电击增加的反应，也没有发现任何差异（图。​（图66A类). 最后，恐惧条件反射的线索变体依赖于正常的听力。作为对这种感觉方式的控制以及对感觉运动门控的测试，我们使用了预脉冲抑制，这是一种测试，在这种测试中，适度音量的音调会抑制动物对响亮音调的惊吓反应。PKCβ基因敲除的动物在本试验中表现出正常的脉冲前抑制（图。​（图66A类)总的来说，这些数据强烈表明，我们在PKCβ基因敲除小鼠中观察到的线索性和情境性恐惧条件反射缺陷可归因于真正的学习或记忆缺陷，而不是仅仅归因于感觉缺陷。

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图6。

A类被动回避、热板、电击阈值和脉冲前抑制。被动回避测试了从亮舱到暗舱的阶跃延迟。这项测试利用了老鼠在训练过程中从亮区退到暗区的自然倾向。在进入黑暗区域时，给予轻微的足部电击，学习被评估为在训练课程结束后避开黑暗区域。结果显示为PKCβ缺陷小鼠（■）或野生型小鼠训练后1-3天试验期间的逐步潜伏期(▪); 平均值±SEM。采用热板试验比较突变型（■）和野生型(▪) 对有害刺激的敏感性。在55°C的热板上测量热伤害感受，作为后爪舔的潜伏期。作为热板测试的额外对照，电击阈值测试用于比较对足部电击的敏感性，通过退缩、跳跃或发声的程度来测量，以增加足部电击强度。老鼠对大噪音通常会表现出惊吓反应。有趣的是，如果在响亮的噪音之前出现适度的噪音，惊吓反应会显著减弱，这种现象称为脉冲前抑制。预脉冲抑制是评估感觉运动门控和听力的一项非常敏感的测试，因为动物对预脉冲的反应在数量上是不同的，变化幅度只有几分贝。pretone（以分贝为单位的声音强度）对减小声震震级的影响如图所示底部图形结果是PKCβ缺陷小鼠（■）或野生型小鼠（●）随后120dB惊吓反应力的减少百分比。B类，开放字段行为。作为一般活动水平测试和焦虑测试，使用野外测试对动物进行监测。在这个测试中，一般的活动水平是通过测量水平活动、垂直活动和在照明房间的开放式盒子中进行10分钟测试期间的总行程来评估的。旷野测试也测量焦虑水平，通过中心距离与总距离的比率进行评估。结果显示PKCβ缺陷小鼠（○）或野生型小鼠（●）；平均值±SEM。顶部图表，30分钟内每分钟行驶的总距离。底部图形。30分钟内每分钟中心距离与总行驶距离的比率。各组之间的总行程或中心与总距离的比率没有差异。突变体的总体垂直活性略有下降（数据未显示）。C类，Rotarod行为。我们使用旋转试验分析了协调和运动技能的获得。动物在旋转杆上停留的时间是衡量其整体协调水平的指标。老鼠也通过训练来提高他们的表现，这是运动学习的一个指标。结果显示，动物在每个训练期间停留在旋转杆上的总次数。在一天内进行了三次训练试验。动物停留在杆上的时间增加被视为运动学习的指标。结果显示PKCβ缺陷小鼠（○）或野生型小鼠（●）；平均值±SEM。

最后，我们对PKCβ基因敲除动物进行了两项运动行为反应性测试，即旷野和旋转评估。这些是对由多动或运动协调异常引起的明显恐惧调节表型的一般控制。此外，由于PKCβ在纹状体和小脑颗粒细胞中表达（图。​（图11A、 B类)rotarod试验表明PKCβ是否是执行这项小脑依赖性任务所必需的。在这些任务中，PKCβ缺陷小鼠再次表现出与对照组没有区别的反应（图。​（图66B、 C类).

作为额外的对照，我们在一组动物中进行了一系列再训练实验。我们在这些实验中的目标是三重的。首先，我们试图控制潜在的混杂因素，即明显的恐惧调节表型仅归因于PKCβ基因敲除动物无法表现出我们量化的冷冻作为学习指标。第二个目标是确定PKCβ基因敲除小鼠是否表现出长期和短期恐惧条件反射的选择性丧失。最后，根据最近的工作马伦（1998）研究表明，过度训练并不能克服大鼠基底外侧杏仁核损伤引起的恐惧条件反射的获得或表达缺陷，我们试图确定过度训练是否能够克服我们观察到的恐惧条件转换缺陷。

动物再培训的过程如下。第3天，对照组和PKCβ基因敲除组小鼠在与第1天相同的环境中接受再训练，但使用由五对声学CS和足部电击组成的恐惧调节方案（图。​（图77A类). 与第2天观察到的上下文冻结缺陷一致，PKCβ缺陷小鼠在上下文中被替换时表现出较低的基线冻结（1-2分钟）。同样，PKCβ基因敲除小鼠在前两次CS–US配对（3-4分钟）中的冷冻率低于野生型小鼠，这也与第1天的训练结果一致。然而，随着额外训练，这种冷冻缺陷消失了，PKCβ缺陷小鼠在三对、四对或五对CS–US配对后显示出与野生型小鼠无异的冷冻水平（图。​（图77A类). 这些结果表明，PKCβ基因敲除小鼠确实能够正常冷冻行为。

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图7。

在第3天对PKCβ缺陷小鼠和对照小鼠进行再训练。A类对PKCβ缺陷小鼠（○）或对照小鼠（●）进行再训练时的冷冻行为。在线索和上下文测试后的一天（第3天），用五对声学CS对这些小鼠进行再训练(暗条)和脚震(灰色箭头). 与对照组小鼠相比，PKCβ基因敲除小鼠在基线测量期间表现出明显更低的冷冻水平（1-2分钟；第页< 0.05). 这种冻结赤字随着过度训练（3-7分钟）而消失。B类，在第3天的培训后1-2小时，根据CS演示进行冻结。PKCβ基因敲除小鼠和对照组对CS反应的冷冻水平没有显著差异。C类，根据第4天的培训背景陈述，冻结。PKCβ基因敲除小鼠在训练环境下的冷冻行为受损(第页< 0.05).D类，在第4天的CS演示中冻结。PKCβ缺陷小鼠对CS的反应也明显低于对照组(第页< 0.01). 在所有实验中，每5秒对冻结进行一次评分，并在1分钟的时间内进行平均。

除了冷冻控制外，我们还对补充训练对短期和长期情绪记忆的影响感兴趣。训练后1-2小时进行测试时，与对照组相比，PKCβ缺陷小鼠表现出正常的冷冻状态，以应对声学CS的表现（图。​（图77B类). 这是一个时间点，通常用于测试恐惧调节任务中的短期记忆(Abel等人，1997年). 24小时后评估长期记忆保持能力。尽管在再训练期间和1-2小时后进行测试时显示出正常的冷冻水平，PKCβ基因敲除小鼠在这两种情况下的冷冻速度再次显著低于野生型对照小鼠（图。​（图77C类)以及在不同背景下交付的声学CS（图。​（图77D类)在第4天测试时。尚不清楚我们在PKC缺陷小鼠中观察到的差异是否表明学习障碍或记忆保留或提取障碍；然而，这些结果支持了我们的结论，即PKC的β亚型在恐惧调节中起作用，恐惧调节是一种杏仁核依赖的长期记忆形式。

总的来说，我们从这些再培训研究中获得的数据中得出了三个有趣的结论。首先，PKCβ基因敲除小鼠明显表现出与对照组无异的冷冻行为。在再训练期和短期线索测试中均观察到正常程度的冻结。因此，我们观察到恐惧条件反射长期变体的冷冻行为改变，似乎并不是冷冻反应本身改变的产物。其次，短期线索测试（2小时）显示PKCβ基因敲除动物的冷冻反应强烈，这表明PKCβ的丢失不会导致短期记忆缺陷。最后，PKCβ缺陷小鼠的长期恐惧条件缺陷是相当严重的；即使训练过度，这些动物也无法克服情境或线索恐惧条件反射的缺陷。

讨论

脚注

参考文献