胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF）已被证明是一种有效的因子，可保护黑质多巴胺（DA）神经元免受毒素诱导的变性体内(Björklund等人，1997年;Gash等人，1998年;波恩，1999年). 在黑质附近注射GDNF可以显著保护黑质DA神经元免受急性毒素诱导的变性，前提是在细胞损失开始之前注射(Beck等人，1995年;Sauer等人，1995年;Winkler等人，1996年;Lu和Hagg，1997年;Sullivan等人，1998年;Rosenblad等人，2000b). 然而，在没有纹状体DA神经支配的情况下，仅DA细胞体的存活不足以维持完整的运动性能(Winkler等人，1996年;Rosenblad等人，2000b; D.Kirik、C.Rosenblad和A.Björklund，未发表的观察结果）。因此，在纹状体内6-羟基多巴胺（6-OHDA）损伤模型中，可能需要向纹状体长期输送GDNF，以获得有效的轴突再生和功能恢复。
体内基因转移已被探索为一种相对无创的方法，使用腺病毒、慢病毒或腺相关病毒（AAV）载体向大脑输送长期GDNF(Bilang-Bleuel等人，1997年;Choi-Lundberg等人，1997年,1998;Mandel等人，1997年;Connor等人，1999年;Mandel等人，1999年;Deglon等人，2000年;Rosenblad等人，2000a). 基于重组AAV（rAAV）的载体对神经系统的基因转移特别感兴趣，因为它们能够转导有丝分裂后神经元并支持大脑中的长期转基因表达(Kaplitt等人，1994年;皮尔等人，1997年;Bartlett等人，1998年;Klein等人，1998年;Mandel等人，1998年;Leff等人，1999年;Lo等人，1999年;Szczypka等人，1999年). 目前还没有关于rAAV注射引起的神经毒性或免疫反应的报告，可能是因为用该载体转导后没有任何病毒蛋白表达(Muzyczka，1992年;Kaplitt等人，1994年). 在黑质纹状体系统中，rAAV载体已被证明在纹状体和黑质的神经元转导中有效，并且转基因的高水平表达已维持至少3-6个月(Kaplitt等人，1994年;Klein等人，1998年;Leff等人，1999年;Lo等人，1999年;Szczypka等人，1999年). rAAV载体对黑质DA神经元及其靶标的特殊亲和力提高了rAAV介导的基因转移可用于比较黑质DA神经元内长期GDNF表达的影响与纹状体中长期GDNF递送对受损黑质纹状体的影响的可能性传入神经。
我们在此报告，通过黑质或纹状体的rAAV-GDNF转导，可以保护黑质DA神经元免受6-OHDA诱导的损伤，但只有当GDNF在纹状体中长时间表达时，纹状体内6-OHDA损伤模型中受损的黑质纹状体投射才能获得长期功能恢复和再生。这表明旁分泌机制而非自分泌机制对受损的黑质纹状体DA系统的功能再生很重要。
材料和方法
重组AAV载体生产。如前所述制备rAAV-CMV-GFP和rAAV-MD-GDNF载体(McCown等人，1996年;Mandel等人，1997年). 简言之，rAAV载体的制备根据Snyder等人（1996年）修改如下Mandel等人（1997）用磷酸钙法将亚流入293细胞与载体质粒和AAV辅助质粒共转染。然后用腺病毒Ad5 dl312感染细胞，MOI为2，感染持续60-72小时。采集细胞并进行三次冷冻/解冻循环以溶解细胞。细胞裂解液通过硫酸铵沉淀分离，rAAV病毒在两个连续的CsCl梯度上分离。rAAV-CMV-GFP的最终颗粒滴度为1.4×1012每毫升病毒颗粒数，rAAV-MD-GDNF为1.0×1012通过斑点杂交分析估计每毫升病毒颗粒数。
学科。共有58只年轻雌性Sprague-Dawley大鼠（瑞典斯德哥尔摩B&K Universal）被关在笼子里，四至五只，在12小时的光/暗周期内可以自由进食和饮水。根据隆德大学实验动物使用伦理委员会制定的规则，对动物进行饲养和治疗。
外科手术。对于本文所述的所有手术程序，动物在手术前接受了马松麻醉（3 ml/kg，i.p.）。麻醉后，将动物置于立体定向框架内（加州图荣加Kopf Instruments）。所有注射均使用连续输液系统（瑞典斯德哥尔摩卡内基药物公司）进行，该系统连接到10μl汉密尔顿微量注射器上，该微量注射器配有玻璃微吸管（外径60-80μm）。从前角计算前-后（AP）和中-外侧（ML）立体定位坐标，从硬脑膜表面计算背-腹（DV）坐标。在计算出的坐标下，在头骨上钻了一个钻孔。在玻璃吸管入口处，使用28号不锈钢皮下注射针在硬脑膜上切一个小切口。
注射AAV载体。将悬浮在PBS中的rAAV（rAAV-MD-rGDNF或rAAV-CMV-GFP）注射到纹状体（每个部位3μl，总计9μl）、黑质（每个部位2μl，合计4μl）或两者兼而有之。坐标如表所示纹状体注射速率为1μl/min，黑质注射速率为0.5μl/min。在三腔内注射过程中，玻璃移液管每分钟缓慢缩回1毫米。停止输液一分钟后，将微量吸管再缩回1毫米，并在其从大脑中缓慢缩回之前再放置2分钟。本实验中使用的实验组如下：（1）rAAV-GDNF注入SN(n个=10）称为“序号组”；（2） rAAV-GDNF注入STR(n个=11）被称为“STR组”；（3） rAAV-GDNF注入SN和STR(n个=11）称为“SN+STR组”；（4） 两个对照组包括rAAV-GFP进入黑质和纹状体（GFP对照组，n个=6）或非矢量注入病变组(n个= 5). 就所有测试变量而言，这两个对照组无法区分，因此被合并为一个“对照组”(n个=11）所有分析和数据；（5） rAAV-GDNF注入SN(n个=5），STR(n个=5），或SN+STR(n个= 5). 注射病毒后4周处死这些动物，以测定组织中GDNF蛋白、多巴胺及其代谢物的水平；（6） rAAV-GFP注入SN(n个= 4). 注射后4周处死这些动物，并进行GFP免疫组织化学处理。
表1。
| 注射部位 | rAAV注射 | 6-羟多巴胺注射液每部位2μl中7μg游离碱 |
|---|
| 纹状体 | 尼格拉 |
|---|
| 1 | 2 | 三 | 1 | 2 | 1 | 2 | 三 | 4 |
|---|
| 应用程序 | +1.2 | +0.2 | −0.8 | −4.8 | −5.8 | +1.3 | +0.4 | −0.4 | −1.3 |
| 毫升 | −3.0 | −3.4 | −4.4 | −2.0 | −2.0 | −2.6 | −3.0 | −4.2 | −4.5 |
| 数码摄像 | −5.51年 | −5.51年 | −5.51年 | −7.2 | −7.2 | −5.0 | −5.0 | −5.0 | −5.0 |
| 齿杆 | 0 | 0 | 0 | −2.3 | −2.3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
6-OHDA损伤。注射病毒四周后，除第5组和第6组的动物外，所有动物均接受了单侧立体定向注射，共28μg 6-OHDA（以游离碱计算；西格玛，圣路易斯，密苏里州）溶于抗坏血酸盐（0.05%）中，分为右侧纹状体中的4个7μg沉积物。注射速率为1μl/min，微量移液管在缓慢缩回之前再放置2 min。使用的坐标（见表)基于我们之前实验的结果(Kirik等人，1998年).
行为分析
旋转行为。所有旋转测试均在自动转速表碗中进行(Ungerstedt和Arbuthnott，1970年). 在30分钟内监测自发性旋转，以确定动物是否表现出不对称行为。数据表示为同侧和对侧360°旋转的总次数。通过计算旋转的总次数来评估动物的活动性，无论旋转方向如何。使用脱吗啡-HCl（Research Biochemicals Incorporated，0.25 mg/kg，s.c.）、SKF-82958 HCl（完全D1多巴胺激动剂，Research生化公司，0.1 mg/kg，s.c.）和d日-硫酸苯丙胺（Apoteksbolaget；1.0或2.5 mg/kg，i.p.）。对阿朴吗啡、SKF-82958和d日-安非他明。所有药物引起的旋转不对称评分均表示为每分钟360°旋转，同侧旋转为正值。
前肢运动障碍（踏步试验）。这些动物在步进试验中进行了前肢运动障碍测试(Schallert等人，1992年)如所述Olsson等人（1995年）连续四天每天进行两次测试，最后三天的数据平均值构成最终因变量。
气缸测试。该测试是对前肢不对称运动测试的修改，首先描述为Schallert和Lindner（1990），按照所述执行Schallert和Tillerson（1999）简单地说，在录像过程中，动物可以在一个透明的玻璃圆柱体中自由移动，直到它完成10次后仰动作，在此过程中，它将至少一只爪子放在圆柱体壁上。镜子放在圆柱体后面，以便摄像机可以看到圆柱体周围的所有爪子位置。一名对动物身份视而不见的观察者观看了录像带，并统计了圆柱体壁上左右前爪接触的次数，最少为20次。数据以对侧（左）前爪接触占总数的百分比表示。
楼梯（伸手）测试。楼梯测试的修改版本描述如下Montoya等人（1991年）已使用。在2天的食物缺乏期之前，这些动物在家中的笼子里接受了食物颗粒，导致体重下降了约15%。然后将动物置于有机玻璃测试箱中，连续7天测试15分钟。此时，将标准中央平台（27 mm）替换为更宽的平台（34 mm），以使任务更加困难，并对动物进行了额外的5天测试。每次测试后，分别计算从楼梯上取出的小球数量和未命中的数量。所取芯块和未命中芯块之间的差异构成了成功检索的总数，这是统计和图形表示的因变量。
损伤前行为测试。能够监测完整大鼠GDNF过度表达的影响(Horger等人，1998年)在6-OHDA损伤之前，对动物进行了踏步试验和自发和苯丙胺诱导的旋转不对称性试验。在注射病毒后的第3周进行步进试验。步进测试完成后，在30分钟内监测自发旋转，然后进行苯丙胺诱导旋转测试。每组动物分为两个亚组，分别服用1.0或2.5 mg/kgd日-两周以上腹腔注射硫酸苯丙胺，各亚组交替接受交叉设计剂量(科克伦和考克斯，1957年).
离职后行为测试。在损伤后4、7、10、13、16和22周监测苯丙胺诱导的旋转行为。在损伤后第3、7、14、18和22周进行阶梯试验。在第一次和最后一次损伤后步进测试之前，在圆柱体测试中对动物进行录像。从损伤后第20周开始，对动物进行如上所述的阶梯试验（有关详细信息，请参见图。). 在损伤后3周和18周监测阿扑吗啡诱导的旋转。每次阿朴吗啡给药四天后，动物接受皮下注射SKF-82958。两个对照组（GFP对照组和仅病变组）在任何测试中均无差异，因此将其数据汇总以供进一步分析。
手术和测试时间表。动物在6-OHDA损伤前4周接受病毒载体注射(−4). 从载体注射后3周开始，使用步进试验对动物进行前肢运动障碍测试(预步骤)其次是自发运动不对称(赞助。腐烂。)和d日-苯丙胺诱导的运动不对称(前置放大器I–二). 在第0周，将6-OHDA注射到纹状体的四个部位，剂量为每个部位7μg。使用反复药物诱导评估术后运动损伤(放大器I–VI,阿波罗I–II级、和SKF-82958型I–II级; 和自发测试(第一步–V（V）,圆柱和楼梯测验；时间线以下）。如材料和方法所述，在损伤24周后灌注动物进行免疫组织化学分析。
生化分析
GDNF和多巴胺及其代谢物的组织水平。为了测定同一样品中GDNF蛋白、DA和DA代谢物的水平，在6-OHDA损伤时，15只大鼠将rAAV-MD-GDNF注入SN(n个=5），STR(n个=5）和序号/STR(n个＝5），如上所述。载体注射4周后，在病毒注射动物和5只幼年对照动物被杀前30分钟，向其注射l-芳香族氨基酸脱羧酶抑制剂NSD-1015（Sigma，100 mg/kg，i.p.）。DOPA脱羧酶抑制导致DOPA积累，否则会转化为DA，从而提供机会确定体内纹状体酪氨酸羟化酶（TH）活性的测量。然后用戊巴比妥钠对动物进行深度麻醉并斩首。大脑被迅速切除，纹状体被切割到前连合的背侧，并从皮层和隔核中分离出来。然后将解剖的组织切成小块，混合，并平均分为两半，分别冷冻（一部分用于GDNF ELISA，另一部分用于DOPA、DA和DOPAC测量）。从含有rAAV载体注射部位的3mm厚冠状切片上取一个直径为2至3mm的冲头，冲头位于两侧黑质致密部的中心。
为了测定组织GDNF蛋白水平，在均质缓冲液（150 m）中对纹状体和黑色素组织进行超声处理（Vibra Cell Sonics and Materials Inc.，Danbury，CT）米氯化钠，50米米HEPES，pH 7.4，1%Triton X-100，1 m米苯甲基磺酰氟和0.6μ米leupeptin），组织浓度为50 mg/ml（湿重/体积）。根据供应商的建议（G3240；威斯康星州麦迪逊市普罗米加），使用商业试剂盒通过ELISA从组织匀浆中测定GDNF的组织水平。使用大鼠GDNF蛋白（基因泰克公司H.Phillips博士的慷慨捐赠）绘制了用于测定组织样品中GDNF水平的标准曲线。
为了测定DOPA、DA和DOPAC水平，纹状体片立即在液氮中冷冻并保存，直到通过联合放射酶法进行分析，如Schmidt等人（1982年）.
组织学
灌注和组织处理。行为测试完成后（损伤后24周），用戊巴比妥对动物进行深度麻醉，并通过升主动脉灌注50 ml等张生理盐水，然后再灌注250 ml冰镇4%多聚甲醛溶液米磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.4。取下大脑并在同一溶液中固定2小时，然后转移到0.1的20%蔗糖中米在40μm冷冻切片机上切片前的PB。
免疫组织化学。如前所述使用标准免疫组织化学程序(Sternberger等人，1970年). 对于TH免疫组织化学，用5%正常马血清（NHS）预孵育切片，然后在室温下用1:2000稀释的小鼠抗TH抗体（Chemicon，Temecula，CA）在2%NHS中孵育过夜。对于GDNF免疫组织化学，用5%NHS预孵育切片，然后在室温下用1:1000稀释的山羊抗GDNF抗体（R&D系统）在2%NHS中孵育过夜。GFRα-1免疫组化是用5%的正常猪血清（NSS）进行预孵育，然后用1:500稀释的兔抗GFRα-1抗体（斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所C.Ibanez博士赠送的礼物）在4%的NSS中孵育过夜。在所有病例中都使用了针对产生一级抗体的物种的适当二级抗体。在所有染色方案中，先用二级抗体孵育，然后用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育（ABC，Vector Laboratories，Burlingame，CA）。用3,3-二氨基联苯胺作为显色剂对反应进行可视化。切片安装在镀铬-明矾的载玻片上，在酒精浓度升高时脱水，在二甲苯中清除，并在Depex中盖玻片。
形态分析
黑细胞计数。如前所述，使用光学分馏器对黑质细胞总数进行无偏体视学估计(Kirik等人，1998年). 这种取样技术不受组织体积变化的影响，也不需要测定参考体积(West等人，1991年). 用于计数的切片覆盖了整个黑质，从致密部嘴端到网状部尾端。这在一系列中产生了9-11个部分。使用Olympus C.A.S.T.网格系统（Olympus-Demark A/S，Albertslund，Denmark）进行采样。计数框（5445μm2)随机放置在第一个计数区域，并系统地移动到所有计数区域，直到对整个划定区域进行采样。使用100×油标（NA 1.4）进行实际计数。为了避免盖子丢失的问题，从两个表面都排除了保护体积（从截面顶部5μm到底部5-8μm），并且只计算了计数体积内聚焦的轮廓（深度为10μm）。根据光学分馏器公式计算神经元总数[有关更多详细信息，请参阅West等人（1991年）]. 根据以下公式计算估算的误差系数（CE）Gundersen和Jensen（1987）CE<0.10被接受。
纹状体纤维密度测量。使用NIH 1.62 Image程序在Macintosh 9500计算机上测量纹状体TH-免疫活性纤维的光密度，该计算机连接到数码相机（ProgRes）和恒定照明表。根据地图集，对每只动物的整个纹状体在七个吻腭水平测量光密度Paxinos和Watson（1998年）：（1）AP，+1.6；（2） AP，+1.0；（3） AP，+0.2；（4） AP，-0.3；（5） AP，-0.9；（6） AP，−1.4；和（7）AP，相对于短角-2.1。为了估计特定的TH染色密度，从纹状体完全失神经部分测量的非特定背景密度校正了光密度读数。
统计分析
使用参数方差分析（ANOVA）评估不同处理之间的显著差异。仅当方差分析中存在显著交互项时，才使用平均值之间的个体对比，使用Systat 5.2.1进行简单的主效应分析(柯克，1968年).后hoc组间测试包括Tukey诚实显著差异（HSD）。Greenhouse-Geiser-Epsilon检验用于确定接受方差分析的各组之间方差的同质性，对所有对比结果均无显著性结果(第页> 0.05). 对楼梯数据进行对数转换，以控制由于一些动物在学习的获得阶段早期表现不佳而导致的变异性。在95%的概率水平上接受显著性。
结果
本研究旨在确定通过rAAV介导的基因转移在纹状体和/或黑质中长期过度表达GDNF是否可以保护纹状体内6-OHDA损伤模型中的黑质纹状体通路并促进再生和功能恢复。将rAAV-GDNF载体单侧注入纹状体（STR组，n个=11）或黑质（SN组，n个=10）或两种结构（SN+STR组，n个= 11). 注射编码绿色荧光蛋白（GFP，n个=6）和一组未注射的大鼠(n个=5）作为对照。纹状体内注射6-OHDA前4周进行载体注射，以留出足够的时间让GDNF基因完全表达(Mandel等人，1997年,1999). 为了诱导持续的运动行为缺陷和DA细胞的大量丢失，采用了纹状体内四位点6-OHDA损伤(Kirik等人，1998年). 6-OHDA致敏的动物被允许存活6个月，在此期间，他们被反复测试药物诱导和自发运动行为（图。).
完整动物中GDNF的表达
用ELISA法评估损伤时GDNF在另一组非致敏动物组织样本中的表达(n个=14），其在载体注射后4周被杀死（表). 在所有三个rAAV-GDNF注射组（0.22–2.28 ng/mg组织，比基线高4–35倍F类(1,22)= 16.1,第页< 0.0001). 单独在黑质（SN组）或在黑质和纹状体（SN+STR组）接受载体注射的动物的GDNF水平比纹状体注射的动物（STR组）高约10倍（组F类(2,22)= 73.4,第页< 0.0001). 此外，SN组纹状体中高水平的GDNF表明，在接受SN载体注射的动物中，GDNF蛋白已从黑质运输到纹状体。
表2。
注射rAAV-GDNF后4周，用ELISA法测定纹状体和黑质区穿孔处GDNF蛋白水平（ng/mg组织）
| 纹状体 | 尼格拉 |
|---|
| 左侧（无喷射） | 右侧（注入） | 左侧（无喷射） | 右侧（注入） |
|---|
| 序号组(n个= 5) | 0.07 ± 0.02 | 1.58 ± 0.312年 | 0.09 ± 0.02 | 1.41 ± 0.492年 |
| STR组(n个= 5) | 0.02 ± 0.01 | 0.22 ± 0.092年 | 0.05 ± 0.03 | 0.11 ± 0.03 |
| SN+STR组(n个= 4) | 0.05 ± 0.04 | 2.28 ± 0.352年 | 0.10 ± 0.04 | 1.00 ± 0.112年 |
体内TH酶活性（测量为我-在同一组动物的双侧纹状体中测量脱羧酶抑制后多巴胺（DOPA）的积累和多巴胺（DA）的转换（估计为多巴胺/多巴胺比值）。如表所示在所有rAAV-GDNF注射组中，载体注射侧的DA转换增加了两到三倍，而TH活性仅在SN+STR组合组中显著增加。
表3。
注射后4周，非损伤对照组和rAAV-GDNF注射动物纹状体中DOPA水平和DOPAC/DA比率
| 实验组 | DOPA（fmol/mg组织） | DOPAC/DA公司 |
|---|
| 控制(n个= 5) | 759.2 ± 44.8 | 0.021 ± 0.003 |
| 序号组(n个= 5) | 538.4 ± 211.9 | 0.048 ± 0.0083年 |
| STR组(n个= 4) | 975.3 ± 89.8 | 0.046 ± 0.0043-安培 |
| SN+STR组(n个= 4) | 1905.3 ± 345.93-b类 | 0.065 ± 0.0143年 |
在载体注射后的第三周，即6-OHDA损伤前一周，评估GDNF过度表达对完整动物行为的影响。SN组和SN+STR组注射rAAV-GDNF的动物表现出明显的自发对侧转向偏向（即远离矢量注射半球的方向）（图。A类)以及与对照组相比增加的一般运动活动（两个方向的总旋转）(F类(3,39)= 6.18,第页= 0.001). 尽管与对照组相比，STR组的对侧旋转次数增加了两倍，但这种不对称性并没有达到统计学意义。这些差异在与d日-安非他明（图。B类); 也就是说，所有三个rAAV-GDNF注射组均表现出强烈的苯丙胺诱导的对侧旋转，并且它们在测试中明显更为活跃，如90分钟测试中总转数的增加所示(F类(3,39)= 9.284,第页< 0.0001). 另一方面，rAAV-GDNF治疗的动物在6-OHDA损伤前表现出正常的前肢行走行为(F类(3,78)= 0.15,第页=0.93）（图。E类,F类,病变前值）。
在载体注射3周后，评估完整动物的自发运动不对称性。A类，预放电自发旋转。对照组没有表现出偏倚，这是因为它们在两个方向的旋转次数与同侧方向的旋转数量之间没有差异（Tukey HSD事后（post-hoc）测试第页= 0.995). 相比之下，SN和STR/SN矢量注入组自发地旋转到矢量注入的对侧(封闭式钢筋)与同侧相比(开放式酒吧，组的主要影响显著F类(3,78)= 6.8;第页=0.0004，Tukey HSD事后（post-hoc），序号第页<0.0001，STR/SN第页< 0.0001).星号表明对侧与同侧旋转显著增加(第页< 0.05).英镑符号（#）表示与对照组相比，旋转速度显著提高(第页< 0.05).B类，病变前苯丙胺旋转。与自发旋转数据类似，对照动物对2.5 mg/kg苯丙胺的反应没有表现出不对称行为。然而，所有注射rAAV-GDNF的动物在与载体注射相反的方向上都表现出高度显著的不对称性(封闭式钢筋).星号表明与同侧旋转率相比，对侧旋转率明显更高(第页< 0.05).英镑符号（#）表示与对照组相比，对侧旋转速度更大(第页< 0.05). 注意中的不同比例A类和B类.
自发行为。A类，使用圆柱体试验评估自发性肢体使用(Schallert和Tillerson，1999年)6-OHDA损伤后3周。在这个时间点，所有组都存在高度显著的同侧偏倚，这表明在这个测试中只有10-15%的对侧肢体使用(F类(1,76)= 0.408,第页= 0.52).B类，在6-OHDA损伤23周后再次进行圆柱体试验。此时，所有组都有了总体改善（时间的影响第页= 0.001). STR组的改善更为明显，但这一趋势没有达到显著性（群体效应第页= 0.07). 然而，仅考虑在苯丙胺诱导旋转试验中表现出完全补偿的STR组动物（8/11只动物，STR-压缩机)，这些动物用对侧爪子接触圆柱体侧面，接近正常水平（～45%），它们的表现明显好于无补偿动物和对照组(F类(1,39)= 17.5,第页< 0.0001).C类，楼梯（熟练肢体使用）测试，来自对侧爪的数据。使用标准窄平台进行第一阶段测试（第1-7天）。两组的表现有显著差异(F类(3,39)= 5.4,第页= 0.003). 在测试过程中，各组都有所改善（培训效果；F类(6,234)= 46.5,第页<0.0001），但组间学习率没有差异（时间×组间交互作用，F类(18,234)= 1.6,第页= 0.058). 然而，STR组在所有日子里都能成功取出比其他三组多得多的颗粒(星号; 简单的主要效果，第页<0.02），而对照组、SN组和SN+STR组的表现彼此没有差异（简单的主要效应，第页>每天0.1）。从第8天开始，通过使用更宽的平台，测试变得更加困难。在这部分测试中，各组在成功回收粒剂的能力上存在差异(F类(3,39)= 3.2,第页= 0.035). STR组的表现再次显著优于所有其他组(星号，简单的主要效果，第页<0.05，第8天和第10天除外，其中0.08>第页> 0.05). SN组在第8天和第12天的表现明显差于对照组和SN+STR（†，简单的主要影响，第页<0.05），而对照组和SN+STR组在任何时间点的表现都没有差异(第页>每天0.4）。D类楼梯（熟练肢体使用）测试，来自同侧爪子的数据。在所有四组中，同侧爪子的表现明显优于对侧爪子(第页< 0.0001).E类,F类，对侧表现(E类)和同侧前肢(F类)在步进测试中。在损伤前测试中(灰色阴影列)两边的两组之间没有差异(F类(3,78)= 0.3,第页= 0.82). 病变严重影响各组对侧台阶数（侧效应；F类(1,78)= 543.9,第页<0.0001），而同侧的表现不受影响。在这项测试中，任何一组都没有随着时间的推移而得到改善。中的图例右下角指代表每个组的符号，适用于C–F所有数值均为平均值±SEM。
综上所述，这些数据表明，在rAAV-GDNF注射动物中获得的GDNF过度表达水平足以在完整的黑质纹状体DA神经元中诱导显著的功能性上调，并且这种效应在SN+STR组中最为显著。此外，纹状体GDNF水平最高的组的对侧转向偏向（自发和苯丙胺激发后）最强，而GDNF含量较低的组最弱（表).
rAAV介导的GDNF递送逆转病变诱导的功能损伤
从脊髓内6-OHDA损伤后3周开始，对动物进行一系列药物诱导和自发运动测试（图。). 在损伤后3-5周进行的测试中，所有载体注射组在药物诱导旋转测试中均显示出类似程度的损伤（图。，表)以及在自发运动测试中（前肢运动障碍和爪子使用测试）（图。). 这些数据表明，这一巨大的6-OHDA损伤对所有四个实验组的急性影响是相同的。
苯丙胺诱发的运动不对称。纹状体6-OHDA损伤4周后，所有组均显示出明显的同侧旋转，这在组间是等效的(第页>0.5，简单的主要效果）。然而，早在6-OHDA损伤后7周，STR载体注射组就开始显示苯丙胺诱导的旋转减少。从10周及以后，STR组与所有其他组有显著差异（组的主要作用；F类(3,39)= 3.464,第页= 0.03).星号表明与STR组早期时间点的显著差异磅符号（#）表示与所有其他组的显著差异(第页通过简单的主要影响，<0.05）。所有值均为平均值±SEM。
表4。
阿扑吗啡（0.25 mg/kg）和SKF-82958（0.1 mg/kg）诱导的旋转（全转/分钟）
| 阿扑吗啡 | SKF-82958型 |
|---|
| 5周 | 18周 | 5周 | 18周 |
|---|
| 控制(n个= 5) | −6.2 ± 1.4 | −6.2 ± 0.9 | −10.9 ± 2.0 | −7.1 ± 2.1 |
| 序号组(n个= 5) | −8.9 ± 0.9 | −9.8 ± 0.9 | −13.0 ± 2.0 | −11.6 ± 1.7 |
| STR组(n个= 4) | −9.7 ± 1.3 | −8.3 ± 0.9 | −12.2 ± 2.5 | −6.1 ± 1.7 |
| SN+STR组(n个= 4) | −9.1 ± 1.2 | −10.3 ± 1.0 | −13.7 ± 1.9 | −12.6 ± 2.0 |
在随后的几周内，STR组在苯丙胺诱导的旋转中均观察到显著的功能恢复（图。)以及动物使用前肢的能力（圆柱和楼梯测试）（图。A类–D类). 相反，SN组和SN+STR组在任何行为测试中均未表现出任何显著的恢复。STR组的改善，如苯丙胺诱导的旋转行为减少所示，在6-OHDA损伤23周后逐渐发展。23周时，STR组11只大鼠中有8只完全消除了不对称性。这些完全康复的动物在圆柱体试验中也恢复了前肢的正常使用（图。B类). 相反，对混合D1/D2激动剂阿扑吗啡或D1激动剂SKF-82958的反应的旋转在所有时间点都不受影响（表).
为了进一步描述rAAV-GDNF治疗大鼠使用受影响前肢的能力，进行了两种不同版本的阶梯试验。前7天的测试是使用标准宽度的平台进行的（图。C类,狭窄平台). 在测试的初始阶段，STR组在整个测试期间能够成功地用对侧爪子取出比所有其他组更多的小球（图。C类). 在达到渐近性能后，用一个更宽的平台取代标准平台，以使测试更加困难，延长5天。在第二个5天测试期间（图。C类第8-12天），STR组的表现再次优于所有其他组。此外，在第二次更困难的测试中，SN组的表现往往比其他组差，并且在所有日子里都明显比STR组差（简单的主要影响，第页所有天<0.025），其余两组在其中两天（图。C类). 与楼梯和圆柱体试验中观察到的改善相反，所有组在踏步试验中对侧（左）前肢的使用都受到严重损害，并且在整个试验过程中，所有组都受到损害（图。E类,F类).
rAAV GDNF处理动物黑质纹状体通路完整性的保存
用TH免疫组织化学方法评价黑质DA神经元的保护作用和黑质纹状体投射的保护作用。选择四个冠状面来说明黑质纹状体通路的状态：中央纹状体（图。)、尾侧纹状体和苍白球（GP）（图。)，内侧前脑束（MFB）（图。)和黑质（图。).
中央纹状体TH免疫细胞化学染色。6-OHDA损伤导致对照组TH阳性纤维变性(B类). 注意STR中TH阳性纤维神经支配的强度较高(D类)组。SN的神经支配(C类)和SN+STR(E类)各组与对照组无差异。中的比例尺A类代表500μm，也适用于B–E类. The插入如草图所示，显示了在七个喙顶水平上测量的纹状体中TH阳性纤维的密度。对照组6-OHDA损伤导致纹状体TH阳性神经广泛变性。两组之间纹状体TH阳性纤维密度存在高度显著差异(F类(3,273)= 18.6,第页< 0.0001). 与所有组的后部区域（IV–VII级）相比，前部区域（I–III级）相对较少(F类(6,273)= 5.2,第页< 0.0001). 然而，没有显著的水平×群体交互作用(F类(18,273)= 0.60,第页= 0.92); 因此，事后（post-hoc）组间测试不分等级。与所有其他组相比，STR组在所有口腔粘膜水平上显示出明显更高的TH纤维密度(*第页< 0.05; Tukey HSD）。所有值均为平均值±SEM。
苍白球和侧纹状体尾部的TH免疫细胞化学染色。通过GP的正常终前轴突（如A类)在控件中丢失(B类). 注意GP和纹状体内STR组的发芽(D类). 在SN+STR组中，GP中观察到较低强度的发芽(E类)SN组完全缺失(C类).箭头指向高倍显示的单个图形附近的区域。中的比例尺A类代表500μm，也适用于B–E类.
MFB的TH免疫细胞化学染色。未经治疗的大脑中可见TH阳性轴突束(A类). 由于损伤，位于束背侧的大多数轴突丢失(B类). 注意SN和SN+STR组中的异常发芽(C、 E类)STR组正常模式的保存(D类).矩形以高倍显示单个图形附近的区域。比例尺（如所示A类):A–E500微米。
黑质细胞体的TH免疫细胞化学染色。注意所有GDNF载体注射组致密部TH阳性细胞体的保护(C类–E类)与受损控件相比(B类). 比例尺（如所示A类):A类–E类500微米。这个插入显示了损伤后27周使用材料和方法中描述的体视学计数方法估计的黑质TH阳性细胞数。在未经治疗的半球，TH阳性细胞的数量在所有四组中都非常相似(第页> 0.99). 6-OHDA损伤导致对照组TH+细胞减少～88%。所有rAAV-GDNF治疗组的黑质TH阳性细胞均受到显著保护（ANOVA，其次为事后（post-hoc）Tukey HSD测试，第页<0.0001）：SN组和SN+STR组分别为91和78%（Tukey HSD测试，第页> 0.99). STR组中TH阳性细胞的保护作用显著降低至57%（Tukey-HSD试验，第页<0.05），但TH阳性的黑质细胞存活率与对照组相比仍非常显著*第页<0.0001与完好侧不同；+第页<0.0001与所有其他组不同。条形图中的值表示TH阳性细胞与完整侧相比的百分比。所有值均为平均值±SEM。
在对照组中，纹状体内四点注射6-OHDA导致黑质致密部TH阳性神经元（>85%）大量丢失（图。B类、和插入)与完整半球相比（图。A类). 纹状体的大部分也有类似的TH神经支配缺失，除了一些支配纹状体最内侧和腹侧的备用纤维（图。，比较A类,B类; 图。，比较A类,B类). 广泛的纹状体失神经与GP中TH阳性终末前轴突的近完全缺失有关（图。，比较A类,B类)在内囊和MFB中也很明显（图。，比较A类,B类).
在所有三个rAAV-GDNF治疗组中，rAAV-介导的GDNF表达对黑质致密部TH阳性细胞具有显著的神经保护作用（图。,插入). SN组的保护接近完成（91.2%）（图。C类)STR组为56.8%（图。D类)SN+STR组为78.6%（图。E类). SN和SN+STR组的所有动物都显示TH阳性纤维在黑质背侧和嘴侧广泛出芽，围绕载体注射部位，导致MFB水平的纤维紊乱（图。C类,E类). 这种广泛的发芽反应也延伸到丘脑底核、内脚核（EP）和腹侧丘脑，但未能到达纹状体（图。C类,C类).
在STR组中，在GP内观察到大量TH阳性芽生，这些芽生也支配纹状体的邻近区域（图。D类). 萌芽纤维主要支配纹状体的尾侧和腹侧部分，向中央纹状体背侧延伸，而背侧和外侧纹状体区域保持失神经状态（图。D类). 这种发芽反应在SN+STR组中不太明显，而在SN组中完全没有。除了STR组的这种发芽反应外，TH阳性纤维离开黑质进入MFB的外观相对正常（图。，比较A类,D类)与所有其他rAAV-GDNF治疗组相比（图。，比较D类,C类,E类). 在GP层面（图。D类)在内囊有髓纤维束中，除了杂乱无章、染色浓密的出芽TH阳性纤维外，还可以观察到外观和组织正常的TH阳性神经纤维。在其他实验组中未观察到正常纹状体延髓TH阳性纤维的亚群（图。B类,C类,E类). 这些观察结果表明，在STR组，病变诱导的逆行轴突变性并没有进展到GP的尾部。
密度测量（图。,插入)与所有其他治疗组相比，STR组的纹状体TH神经支配显著增加，从受损对照组最失神经尾侧区域正常的约10%到rAAV-GDNF注射动物正常的约25-30%。
GFP在黑质和纹状体中的表达
其中一个对照组在注射后6个月死亡，注射rAAV-GFP载体作为转导的对照。GFP免疫组织化学证实了早期的观察结果(Klein等人，1998年)rAAV载体的转导效率在黑质中相对较高，而在纹状体中相对较低（图。，比较A类,D类). 在纹状体中，在注射部位附近观察到GFP阳性细胞，宽度为～300μm（图。A类,B类)其中至少90%的细胞具有神经元样形态，既有中等大小的棘状神经元，也有纹状体中常见的白杨状神经元（图。B类). 令人惊讶的是，尽管纹状体中的转导仅限于一个小区域，但许多GP神经元在载体尾部注射部位远端>1mm处也呈GFP阳性（图。A类,C类).
受损和未受损动物中rAAV-GFP转导的示例。A类，病变对照组，存活6个月；后纹状体单个注射部位的rAAV-GFP转导。纹状体和GP中均可见GFP阳性细胞箱纹状体内(STR公司)表示所示的放大区域B类、和箱在中普通合伙人表示所示的放大区域C类.比例尺，500μm。科科斯群岛胼胝体。B类，GFP表达细胞，沿注射道具有神经元形态。比例尺，100μm。C类，注射部位远端GP中的GFP阳性神经元（比例尺如B类).D类，rAAV-GFP在完整动物黑质中的转导（存活4周）。整个黑质致密部都有转导(SNc公司)以及沿着针轨的背面(箭头).SNr公司黑质，网状部。这个箱表示中的放大区域E类.比例尺，500μm。E类高倍镜下GFP阳性细胞在形态学上与黑质致密部DA神经元一致。比例尺（如所示E类):E类–G公司，50微米。在同一动物中，GFP阳性纤维可以沿着黑质纹状体通路的长度追踪。观察到这些纤维在纹状体中分支成细小的GFP阳性终末斑块(G公司).
在注射rAAV-GFP载体的非感染动物中（图。D类,E类)，在黑质中观察到许多GFP阳性神经元，最显著的是致密部。绝大多数转导细胞的外观为神经元，转导从黑质内注射部位向内侧延伸约1.5 mm。致密部内的GFP免疫反应细胞中，大多数在形态学上与正常的黑质DA神经元没有区别（图。E类). 所观察到的黑质DA神经元和rAAV转导的苍白球倾向性与较高程度的FGFr-1表达一致[FGFr-1]是rAAV内化的假定受体(Qing等人，1999年)]在这些解剖区域(Matsuo等人，1994年). 在接受相同载体注射的6-OHDA诱导的动物中，在致密部仅发现少数表达GFP的细胞。然而，在邻近的中脑区域，观察到的转导细胞数量与未切除的对照动物相似，这与黑质外的多巴胺能和非多巴胺能神经元（例如A8细胞组）均不受6-OHDA损伤的影响这一事实相一致（数据未显示）。在其中一只转导GFP的完整大鼠中，GFP阳性纤维可以沿着黑质纹状体通路的长度追踪到纹状体，在纹状体中可以看到它们分支成细小的GFP阳性终末斑块（图。F类,G公司). 黑质GFP转导后的这种GFP免疫反应模式表明GFP蛋白顺行运输到纹状体的终末，这与SN组纹状体中测得的高水平GDNF蛋白相一致（表).
与6-OHDA注射部位在6个月时表现为小的局限性瘢痕相比，rAAV载体注射部位没有任何非特异性损伤的迹象。这表明rAAV注射液的非特异性毒性较低；这个问题将在以后的研究中进行更详细的研究。
GDNF免疫反应在基底节的分布
注射载体6个月后，用免疫组织化学方法观察GDNF蛋白的分布（图。). 在转导区附近的纹状体中观察到的GDNF免疫反应主要是细胞外的（有一些例外；见下文），并且既不存在于载体注射的对照组，也不存在于任何大脑的对侧半球（数据未显示）。在STR中（图。A类)和SN+STR（图。C类)各组中，GDNF蛋白在纹状体内广泛分布，横向延伸至皮层深层（图。A类,C类,D类,F类). 最后，GDNF免疫反应区延伸至两组的GP（图。D类,F类). 总的来说，SN+STR组GDNF免疫反应性在所有口腔粘膜水平上的分布更广。纹状体最腹外侧部分的邻近皮层中观察到强烈的免疫反应性细胞分布（图。C类,M（M）)和GP（图。F类,N个). 因为这些强GDNF阳性细胞（图。C类,M（M）)位于载体注射部位的远端，并且这些区域在接受相同rAAV-GFP载体注射的动物中没有转导，很可能这些细胞积累了来自转导细胞释放的GDNF，这些转导细胞定位于载体注射部位附近。使用GFRα-1受体抗体(Trupp等人，1997年;Kokaia等人，1999年)，检测相邻切片的GFRα-1染色。在含有GDNF阳性细胞的相应区域准确地发现了强GFRα-1免疫反应细胞，这表明GDNF在这些细胞中的积累可能是受体介导的。载体注射半球的细胞GFRα-1染色更强（数据未显示）。
载体注射6个月后，GDNF免疫反应在STR的四个水平上显示(A类,D类,G公司,J型)，序号(B类,E类,H（H）,K（K）)和SN+STR(C类,F类,我,我)组，从每组的同一标本中取出。最前面的水平(A–C)图示为中央纹状体区域。注意STR组和SN+STR组腹侧纹状体和邻近皮层的弥漫细胞外染色和免疫反应细胞分布(A类,C类). 下一个后水平(D–F型)图示GP和尾部纹状体。同样，在纹状体转导的动物中，GDNF免疫反应覆盖纹状体和GP(B类,F类). 在两个纹状体中均观察到GDNF阳性细胞分布(C类,M（M）)和GP(F类,N个)SN+STR组。在SN组，中央纹状体和尾部纹状体以及GP均无GDNF免疫反应(B类,E类). 在EP层面(G–I型)，STR组EP中观察到GDNF免疫反应(G公司)，位于丘脑腹侧(Th（第个）)在序号组中(H（H）)SN+STR组中的MFB、Th和EP(我). 注意染色仅限于网状(信噪比)STR组中(J型)SN组和SN+STR组染色更广泛(K（K）,我). 这个箱在里面C类表示所示的放大区域M（M），的箱在里面F类表示中的放大区域N个、和箱在里面我表示所示的放大区域O（运行）.集成电路，内囊。比例尺：A–F，1毫米；G–L750微米；M（M），50μm（也适用于N个,O（运行）).
在纹状体转导的动物中，GDNF免疫反应也可以在更多的尾侧纹状体传出结构中观察到，包括EP（图。G公司,我)黑质网状部（图。J型,我)，在注射侧。在网状部，观察到GDNF阳性细胞轮廓（图。K（K）,我,O（运行）). 这些观察结果与纹状体rAAV产生的GDNF沿着纹状体传出通路从纹状体尾部顺行运输高度一致。
在接受黑质rAAV-GDNF转导的动物中（SN和SN+STR组），黑质及其周围的GDNF免疫反应显著（图。K（K）). 在SN组中，可以在MFB中观察到EP水平的GDNF蛋白（图。H（H）,我). 然而，纹状体或GP中未观察到GDNF免疫反应（图。B类,E类)SN转导的动物。
讨论
结果表明，rAAV载体系统可以在黑质纹状体系统和黑质中以功能有效的水平长期表达GDNF蛋白。黑质的转导率是纹状体的6到7倍。与之前的调查结果一致(Klein等人，1998年)rAAV-GFP载体标记的黑质区细胞数量多于纹状体，且90%以上的转导细胞为神经元。在中脑，GFP优先表达于致密部黑质，GFP蛋白沿黑质纹状体通路的轴突和纹状体内的终末顺行运输。转基因GDNF在细胞外广泛分布，距离生产地点约2 mm，这与GDNF是一种分泌蛋白一致，并且能够在宿主组织内广泛扩散。此外，在纹状体注射rAAV-GDNF的大鼠中，GDNF有效地沿着纹状体通路顺行运输至GP、EP和黑质。ELISA测量表明，沿黑质纹状体通路，从黑质到纹状体的顺行运输；SN组纹状体无GDNF免疫反应，表明6-OHDA致敏大鼠纹状体染色完全消失。
对完整的黑质纹状体DA系统的功能影响
在黑质中注射rAAV GDNF提供了在DA神经元自身内优先表达GDNF的工具。相反，在纹状体中，该载体表达于黑质纹状体通路的神经元靶点。rAAV-GDNF载体在任一位点过度表达GDNF，在完整的黑质纹状体DA系统中诱导功能效应，在接受载体注射的动物中观察到自发的运动不对称，在注射到黑质或纹状体的动物中，苯丙胺诱导的旋转率很高。所有组的纹状体DA转换增加，SN+STR组纹状体多巴胺合成增加。这些数据表明，通过DA神经元自身GDNF的过度表达或纹状体靶区细胞的GDNF分泌，可以在完整的黑质纹状体系统中实现DA转换的长期激活。有趣的是，这些大鼠的前肢步进没有受到影响，这表明GDNF在完整的黑质纹状体系统中单方面过度表达不会干扰正常的运动功能。
DA神经元对毒性损伤的保护
在黑质或纹状体注射rAAV-GDNF可显著挽救黑质DA神经元。这种作用在接受黑质载体注射的动物中最为明显，细胞保护的程度似乎与注射6-OHDA时ELISA测定的黑质区域表达的GDNF水平相匹配。在SN组中，我们观察到GDNF组织水平为～1.4 ng/mg的近完全（91%）保护（这表示内源性GDNF浓度增加了15-20倍）（表). 这表明GDNF在DA神经元内的过度表达对6-OHDA诱导的轴切断术后黑质细胞体的挽救特别有效。在之前的研究中(Choi-Lundberg等人，1997年)，GDNF通过腺病毒载体在黑质区表达。在这种情况下，尽管GDNF的组织水平比本实验中高出几倍，但只获得了部分保护。这种差异可能是因为腺病毒载体主要在DA神经元外表达，在这种情况下，GDNF可能以一种效率较低的旁分泌方式发挥作用。事实上，在黑质上以2.5–3μg/d的剂量输注GDNF蛋白，仅能使6-OHDA致敏动物存活60–70%(Lu和Hagg，1997年;Rosenblad等人，2000b).
在6-OHDA损伤之前或之后不久，纹状体注射GDNF蛋白对保护黑质DA神经元有效(卡恩斯等人，1997年;Rosenblad等人，1999年; Kirik、Rosenblad和Björklund，未发表的观察结果）。在本实验中，纹状体注射rAAV-GDNF对DA细胞具有高度显著但不完全的保护作用。这表明GDNF在轴突末端水平的传递可能与在细胞体水平的传递一样有效。然而，更高水平和/或更大范围的GDNF遍布纹状体可能需要完全的黑质细胞保护。
再生和功能恢复
在所有rAAV GDNF注射组中观察到的急性行为损伤表明，在本文获得的水平上，GDNF的过度表达不足以保护纹状体DA末端免受急性毒性损伤。在SN组中，尽管DA细胞体得到了近乎完全的保护，但没有发现功能恢复。这与之前使用GDNF黑质内注射的研究一致，表明在纹状体内6-OHDA损伤模型中，在缺乏功能性纹状体神经支配的情况下保留黑质DA神经元不足以恢复功能(Winkler等人，1996年;Rosenblad等人，2000b). MFB内部和周围出现大量TH阳性纤维萌芽，靠近黑质中挽救的DA细胞体。纤维网向上延伸至GP边缘，与GDNF免疫反应性的分布重叠。纹状体的失神经程度和沿着通路的轴突丢失与受损对照组相似，表明黑质细胞中GDNF的表达无法将轴突再生引导至纹状体靶区。
STR组大鼠纹状体尾侧和腹侧纹状体及GP内大量萌芽和再生，黑质纹状体通路TH阳性轴突部分保存。从出芽纤维的分布来看，GDNF的持续表达似乎促进了TH阳性纤维从GP的轴突末端再生并延伸到纹状体。因此，STR组纹状体的有效再神经支配可能是由受损黑质纹状体轴突的部分保护以及随后再生到GDNF高表达区的综合作用引起的。这与STR组功能恢复的时间过程一致，STR组在发病时延迟，并在病变后的前4-5个月内逐渐发展，如苯丙胺旋转和阶梯和圆柱体测试所示。STR组中异常的苍白球三项TH神经支配模式（图。A类′,D类′），再加上长期的恢复过程，明确显示了黑质纹状体束的重塑，而不是GDNF诱导的黑质纹状DA系统TH酶的重新表达。
STR组纹状体TH阳性神经支配增加，SN+STR组没有出现。这种差异可能归因于黑质中GDNF过表达诱导的强烈局部发芽，这可能阻止了受损轴突向GDNF纹状体来源的再生。如果是这样，黑质DA神经元自身GDNF的表达可能对受损的黑质纹状体纤维再生和重新激活失神经纹状体的能力有害，而非阳性。SN+STR组无明显功能恢复符合这一解释。
结论
在本实验中，GDNF对黑质纹状体DA神经元有三种独立的生物学作用：第一，完整黑质神经元DA合成和转换的上调导致自发和药物诱导的不对称；第二，保护黑色素DA细胞免受毒素诱导的细胞死亡；第三，黑质纹状体通路的功能再生和神经再支配。结果表明，rAAV载体系统可用于在黑质纹状体DA神经元及其纹状体靶细胞中以生物有效水平表达GDNF。虽然这两个位点的转导都能显著拯救受损的黑质DA细胞体，但在纹状体内6-OHDA损伤模型中，只有纹状体中GDNF的表达能够保持投射轴突的完整性，刺激失神经纹状体的神经再支配，并促进功能恢复。这表明GDNF以自分泌方式发挥作用，在保持黑质细胞体完整性方面非常有效。然而，DA神经元内GDNF的表达无法维持受损的轴突或诱导纹状体重新神经支配或功能恢复。相比之下，靶向衍生GDNF表达在保护黑质细胞体方面效率较低，但对最初失神经纹状体的变性和神经再支配具有显著的长期刺激作用，同时药物诱导和自发运动行为均显著恢复。黑质转导后，在DA细胞体附近观察到广泛的芽生。然而，这种局部萌芽是有害的，而不是有益的，因为它似乎损害了在黑质和纹状体接受载体注射的动物的功能并阻止纹状体再生。
PD是一种多巴胺能黑质纹状体系统的退行性疾病，可以在多年内进展(费恩利和李，1991年;Morrish等人，1996年). 在PD中，与纹状体内6-OHDA损伤模型一样，纹状体DA神经支配似乎在黑质细胞体死亡之前退化(McGeer等人，1988年;费恩利和李，1991年;Gibb和Lees，1994年). 事实上，当纹状体中70-80%的DA耗尽，PD症状开始显现时，只有约50%的DA细胞体丢失(费恩利和李，1991年;Gibb和Lees，1994年). 这些数据表明，黑质DA神经元在没有完整功能性黑质纹状体投射的情况下可能存活一段时间。如果是这样，目前的数据表明纹状体而不是黑色素应该是PD早期GDNF基因转移的主要靶点。
