神经科学杂志。2001年9月15日；21(18): 7153–7160.
星形胶质细胞在成年哺乳动物海马中产生新神经元
,1 ,2 ,1和三
贝蒂娜·斯里
1洛克菲勒大学，纽约州纽约市，邮编：10021，
何塞·曼努埃尔·加西亚·维尔杜戈
2巴伦西亚大学，Burjasot-46100，西班牙巴伦西亚，以及
布鲁斯·麦克尤恩
1洛克菲勒大学，纽约州纽约市，邮编：10021，
阿图罗·阿尔瓦雷兹·布伊拉
三加利福尼亚大学旧金山分校，加利福尼亚州旧金山94143-0520
1洛克菲勒大学，纽约州纽约市，邮编：10021，
2西班牙巴伦西亚Burjasot-46100巴伦西亚大学
三加利福尼亚大学旧金山分校，加利福尼亚州旧金山94143-0520
2001年2月14日收到；2001年5月4日修订；2001年5月31日接受。
摘要
海马齿状回的神经发生在包括人类在内的许多脊椎动物的一生中都持续存在。这些新神经元的祖细胞位于齿状回的颗粒下层（SGL）。虽然已经从成年哺乳动物海马体培养出能够自我更新并产生新神经元和胶质细胞的干细胞体内新神经元形成的主要前体尚未确定。在这里，我们显示，表达胶质纤维酸性蛋白并具有星形胶质细胞特征的SGL细胞在正常条件下或在化学去除活跃分裂的细胞后分裂并生成新的神经元。我们还描述了一群电子密度较小的SGL细胞，我们称之为D型细胞，它们来源于星形胶质细胞，可能在新神经元的形成中起暂时性前体的作用。这些结果揭示了成年海马体中新神经元的起源。
关键词：神经发生、海马、神经干细胞、星形胶质细胞、成年哺乳动物大脑、齿状回、颗粒下层
干细胞的鉴定对于了解组织如何在成年生物体中继续生成新细胞至关重要。特别令人感兴趣的是成年脊椎动物的大脑，我们现在知道，在其一生中都会不断产生新的神经元(奥尔特曼，1969年;Kaplan和Hinds，1977年;Goldman和Nottebohm，1983年;Garcia-Verdugo等人，1989年;Lois和Alvarez-Buylla，1994年). 成年哺乳动物大脑中的神经发生被描述为两个有限的生发区：海马齿状回的颗粒下层（SGL）(阿尔特曼和达斯，1965年;卡普兰和贝尔，1984年;Cameron等人，1993年)侧脑室外侧壁的室下区（SVZ）(阿尔特曼和达斯，1966年;奥尔特曼，1969年;Lois和Alvarez-Buylla，1993年). 单元格在体外从成人大脑的这两个区域分离出神经干细胞(Morshead等人，1994年;盖奇等人，1995年;Weiss等人，1996年;Palmer等人，1997年). 此外，已从成人齿状回中分离出神经元前体(Roy等人，2000年).
鸟类已证明成年海马神经发生(巴纳和诺特博姆，1994年)，爬行动物(洛佩兹·加西亚，1993年)，啮齿动物(阿尔特曼和达斯，1965年)和灵长类动物，包括人类(Gould等人，1997年;埃里克森等人，1998年). 在成年哺乳动物的齿状回中，新的神经元在SGL中诞生，并短距离迁移分化为颗粒细胞，将轴突投射到海马CA3区(斯坦菲尔德和特里斯，1988年;Markakis和Gage，1999年). 海马体的神经发生功能与学习和记忆相关(巴纳和诺特博姆，1995年;Kempermann等人，1997年;Gould等人，1999年;Shors等人，2001年). 此外，应激、阿片类药物滥用和癫痫发作会影响齿状回中新神经元的细胞增殖和分化速度(古尔德等人，1992年;Parent等人，1997年;Eisch等人，2000年)
SVZ是成人大脑的另一个生发区，其主要前体细胞最近被确认具有星形胶质细胞的特征并表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）(Doetsch等人，1999b;Laywell等人，2000年). 这一发现令人惊讶，因为星形胶质细胞被认为是属于胶质谱系的分化细胞。另一份报告表明室管膜细胞与体内SVZ干细胞(Johansson等人，1999年); 然而，这一结论并没有得到其他研究的支持(Chiasson等人，1999年;Doetsch等人，1999b;Laywell等人，2000年).
有趣的是，研究表明星形胶质细胞在成人齿状回的SGL和门区分裂，但一般认为这是一个持续的胶质生成过程(卡普兰和贝尔，1984年;Cameron等人，1993年;Palmer等人，2000年). 虽然早期证据表明，外观未分化的小暗细胞与神经元前体相对应(卡普兰和贝尔，1984年)，初级神经元前体的身份尚未确定。
使用类似于识别SVZ中神经干细胞的方法，我们发现SGL星形胶质细胞是成年海马新神经元形成的主要前体细胞。我们还发现，以前被认为与初级前体细胞相对应的小暗细胞来源于分裂的星形胶质细胞，可能与新颗粒神经元生成过程中的一种瞬时细胞类型相对应。值得注意的是，与成年鸟类的SVZ或VZ不同，SGL中的神经原生态位是独特的(Alvarez-Buylla和Nottebohm，1988年;Alvarez-Buylla等人，1998年;Lim等人，2000年)它与心室壁或室管膜层分离。这项工作确定了成年哺乳动物大脑中第二批具有生成新神经元潜力的星形胶质细胞。
材料和方法
动物护理和组织加工
所有实验均使用成年小鼠（2-4个月大，体重≥30克）。灌流前，用1.3 mg/gm体重的戊巴比妥（戊巴比妥）腹腔注射对小鼠进行深度麻醉。对于光学显微镜，动物经心灌注10–30 ml 0.9%生理盐水，然后在pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PB）中灌注30–50 ml 3%多聚甲醛（PFA）5分钟。大脑在3%PFA中培养过夜。第二天，将其转移到pH值为7.4的Tris缓冲盐水（TBS）中。对于自由浮动免疫细胞化学，用振动切片机在50μm处对大脑进行正面切片。为了进行电子显微镜检查，用10-30 ml 0.9%生理盐水灌注动物，然后用30-50 ml 3%PFA和2.5%戊二醛（electron microscopy Sciences，Fort Washington，PA）在pH 7.4的PB中灌注5 min，并在相同的固定液中培养过夜。第二天，将大脑转移到pH值为7.4的PB中，正面切割200μm，然后进行EM处理（见下文）。对于立体定向手术，通过腹腔注射戊巴比妥（戊巴比妥）麻醉动物（0.3 mg/gm体重）。所有动物护理都符合机构指导方针。
BrdU和[三H] 胸苷给药
成年CD-1小鼠单次腹腔注射5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）（西格玛，圣路易斯，密苏里州），体重50μg/gm（10 mg/ml储备，溶于0.9%盐水），或单次腹腔内注射[三H] 胸腺嘧啶，10μCi/gm体重（比活性，6.7Ci/mol；NEN，马萨诸塞州波士顿）。分别于2小时、24小时和72小时后处死动物。对于胞嘧啶-β-d日-阿拉伯呋喃糖苷（AraC）加丙卡巴唑鸡尾酒疗法（APB）实验，成年CD-1小鼠接受两次腹腔注射（间隔12小时）BrdU或[三H] 胸腺嘧啶核苷的剂量与上述实验相同。所有动物在最后一次注射DNA前体2小时后进行灌注。
抗细胞治疗
CD-1小鼠在0.9%生理盐水和丙卡巴唑（0.25 mg/ml；Hoffmann-LaRoche，Nutley，NJ）中接受1.5%AraC（Sigma）抗有丝分裂药物的联合治疗。AraC在以下立体定位坐标下注入大脑表面：前后，1.5；内侧，使用微量渗透泵，相对于前角0.8（流速，0.5μl/hr，7d；Alzet型号1007D；Alza，Palo Alto，CA）。在饮用水中施用丙卡巴唑。经过7天的处理后，从饮用水中取出水泵和丙卡巴唑。在每个时间点处死小鼠之前，将BrdU注射两次（间隔12小时）用于光学显微镜或[三H] 胸腺嘧啶核苷的电子显微镜检查（剂量和给药方案见上文）。在最后一次注射BrdU或[三H] 胸腺嘧啶在0(n个= 4), 2 (n个= 5), 4 (n个= 5), 6 (n个= 4), 8 (n个= 4), 10 (n个=5）和15(n个=3）d。此外，在APB治疗终止后，允许一些动物存活2 d，用BrdU或[三H] 胸腺嘧啶，并允许存活30或150天。
盐分控制。将含有0.9%生理盐水的微量渗透泵植入成年CD-1小鼠体内。给小鼠提供正常饮用水。持续输注7天后，动物接受两次BrdU或[三H] 胸腺嘧啶，如上所述。最后一次注射DNA两小时后，分别对模拟大脑进行光学显微镜和电镜检查。
完整的控件。成年CD-1小鼠接受两次腹腔注射BrdU或[三H] 如上所述，在最后一次注射后2小时灌注胸苷。
免疫细胞化学
用于BrdU检测的DNA变性。切片（50或6μm）在60%甲酰胺-2×SSC中于54°C孵育20分钟，在2×SSC中漂洗5分钟，在2N HCl中于37°C孵育30分钟，在0.1米硼酸，pH 8.5，持续10分钟，在pH 7.4的TBS中洗涤三次，并用0.1%Triton X-100和10%马血清在TBS中封闭30分钟。对于双重染色，来自不同物种的一级抗体同时孵育，二级抗体依次使用。用抗GFAP的小鼠单克隆抗体（mAb）（印第安纳波利斯Boehringer Mannheim）和大鼠抗BrdU mAb（1:200；纽约州韦斯特伯里Accurate Chemicals）在4°C下培养48小时。罗丹明结合抗鼠IgG（1:200；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）在室温下显示GFAP染色2小时，并在TBS中冲洗三次。BrdU在室温下使用生物素化抗鼠Ig G（1:200:Vector Laboratories，Burlingame，CA）显示2小时，在TBS洗涤三次，并在室温下在荧光素-亲和素（1:200；矢量实验室）中培养1小时。所有部分在TBS中冲洗，并用Aquamount（Polysciences，Warrington，PA）安装。切片用Zeiss（Oberkochen，德国）LSM510共焦显微镜进行分析。
GFAP和tva受体双重染色。如上所述，给Gtva小鼠灌流并固定过夜。在室温下，用10%马血清在PB中封闭50微米切片30分钟，用小鼠抗GFAP（mAb 1:200；Boehringer Mannheim）和兔抗GFAP受体（tvaR）（1:200；加利福尼亚大学旧金山分校Andrew D.Leavitt赠送）在4°C下孵育48小时，用10%的马在PB内冲洗三次，用罗丹明-X抗鼠IgG（1:200；Jackson ImmunoResearch）在室温下孵育2小时，在PB中冲洗三次，在生物素化抗兔IgG中孵育1小时（1:200，Vector Laboratories），在PB-中冲洗三遍，在荧光素-亲和素DCS（1:200，并用Aquamount（Polysciences）进行安装。切片用蔡司LSM510共焦显微镜进行分析。
逆转录病毒注射
将200 nl RCAS-碱性磷酸酶（AP）逆转录病毒立体定向注射到上述麻醉的成年Gtva小鼠海马齿状回的三个位置（前后、中外侧和背腹，分别为：1.0、0.6和1.75；1.3、0.7和1.85；1.5、0.8和1.85.）。所有坐标都是从大脑角和大脑表面测量的。在0.5的温度下对动物进行光学显微镜灌注（如上所述）(n个= 5), 1 (n个= 4), 2 (n个= 8), 4 (n个= 5), 15 (n个=9）和30(n个=病毒注射后8）天。在3%PFA中固定过夜后，对大脑进行连续切片（50μm，额叶），并进行碱性磷酸酶染色，以显示受感染的细胞及其后代。简言之，将切片在pH 7.4的PBS中培养30分钟，温度为65°C，以灭活内源性AP活性。然后让切片在新鲜PBS中冷却至室温，并在AP缓冲液（100 m）中培养米三氯化氢，pH 9.5，100 m米氯化钠和5 m米MgCl2）培养10分钟，并在AP底物中培养：硝基蓝四唑氯化物（NBT）（10μl/ml AP缓冲液）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）（2μl/ml AP-缓冲液）（博林格曼海姆）。当出现足够的沉淀物（30到120分钟之间）时，在PBS中冲洗切片三次。
放射自显影和EM分析
如前所述进行放射自显影和EM分析(Doetsch等人，1997年).
逆转录病毒感染的细胞。EM嵌入协议Doetsch等人（1997年）已针对此实验进行了修改。简言之，如上所述，用RCAS-AP病毒注射成年Gtva小鼠。存活2天后，用1.3 mg/gm体重的戊巴比妥（Nembutal）对小鼠进行深度麻醉，并用30 ml 0.9%生理盐水经心灌注，然后用pH 7.4的3%全氟辛烷磺酸和0.8%戊二醛在PB中灌注5分钟。将大脑在4°C的同一固定剂中后固定2小时，然后转移到3%全氟辛烷磺酸中过夜。大脑连续切片（50μm，额叶），并如上所述进行碱性磷酸盐染色。含有碱性磷酸酶阳性细胞的切片在4°C的PBS中清洗过夜，在室温下固定在含有7%葡萄糖的1%四氧化锇（电子显微镜科学）中1小时，在马来酸中清洗三次，并在醋酸铀酰（电子显微镜学）（2%溶于马来酸的溶液）中培养1小时。然后在马来酸中清洗切片三次，在升序乙醇系列中脱水，漂洗2分钟，在环氧丙烷中漂洗两次，并嵌入Durcupan（ACM；Fluka Neu-Ulm，德国）。将嵌入Durcupan的部分安装在涂有硅胶（Rain-X）的玻璃载玻片上，并允许聚合2天。按照以下说明进行额外的组织处理：Doetsch等人（1997年）.
结果
在SGL中划分单元类型
我们首先描述了SGL中存在的分裂细胞类型。在注射BrdU后2小时，在共焦显微镜下对细胞进行研究。BrdU阳性细胞经常被GFAP抗体标记（图。一). SGL中较小比例的BrdU标记细胞也被波形蛋白和S100抗体染色（数据未显示）。在这个存活时间，没有BrdU标记的细胞用神经元标记物Tuj1或NeuN的抗体染色。许多双标记的BrdU–GFAP阳性细胞的突起呈放射状伸入齿状回的叶片。然而，共焦显微镜不允许识别细胞膜，可能这些假定的双标记细胞中的一些对应于与邻近细胞产生的GFAP阳性过程密切相关的小BrdU阳性细胞。为了证实GFAP标记的过程对应于分裂细胞的细胞核，我们使用[三H] 胸腺嘧啶核苷和包埋后GFAP免疫电镜，遵循与BrdU标记相同的注射方案。该分析证实[三H] 标记细胞为GFAP阳性，我们可以描述该区域分裂细胞的超微结构（图。c（c）,d日). 在电子显微镜下，GFAP阳性细胞具有星形胶质细胞的特征：含有少量核糖体的淡色细胞质，中间丝，不规则轮廓，有质膜和突起插入相邻细胞之间。这些细胞的细胞核通常含有疏松的染色质颗粒，但异染色质聚集的差异表明，这些细胞处于细胞周期的不同阶段。除了标记的星形胶质细胞外，还有[三H] -标记为GFAP阴性的较深细胞。这些颜色较深的细胞与星形胶质细胞明显不同：它们轮廓光滑，胞质暗淡，含有许多核糖体，细胞核颜色较深（图。d日). 轻型星形细胞与SVZ中的B型细胞具有相同的超微结构(Doetsch等人，1997年); 因此，我们将其称为SGL B细胞。深色细胞在SVZ中没有明确的同源物；因此，我们将它们称为D细胞。
在SGL中分割细胞。一，注射BrdU后2小时，BrdU标记的GFAP阳性SGL星形胶质细胞的共焦显微照片。注意BrdU标记的核(绿色)和多个GFAP阳性过程(红色)穿透GCL。b条，BrdU标记GFAP阳性的共焦显微照片(箭头)BrdU注射72小时后SGL中的GFAP阴性细胞。c（c），用标记的两个B细胞的电子显微照片[三H] 之后2小时[三H] 胸腺嘧啶注射液。这个插入显示了这两个B细胞的细胞核在1.5μm的切片中被放射自显影银颗粒覆盖，用于制备下图所示的超薄切片。d日, [三H] -72小时后标记D细胞[三H] 胸腺嘧啶注射液。注意D细胞的暗细胞质与B细胞的亮细胞质形成对比。这个插入显示了在用于制备下图所示超薄切片的1.5μm切片中由放射自显影银颗粒覆盖的D细胞细胞核。e（电子），注射BrdU后第2、24和72小时SGL中BrdU标记细胞的百分比。该分析在共焦显微镜下进行；每个存活组分析三只动物的108个细胞。（f），百分比[三H] 2、24和72小时后SGL中的-标记细胞[三H] 胸苷注射液；每个存活组在电子显微镜下对三只动物的25个细胞进行了研究。在e（电子）和（f），错误条指示SD。比例尺：一,b条，5微米；c（c）3.6微米；d日，2微米。
使用共焦显微镜，我们量化了2小时、24小时和72小时GFAP阳性的BrdU标记细胞的数量。独立地，我们在电子显微镜下测定了标记有GFAP的B和D细胞的数量[三H] 胸腺嘧啶核苷同样存活。结果如图所示,e（电子）和（f）两种分析都表明，在2小时时，一半以上的分裂细胞对应于GFAP阳性细胞或B细胞。在2到24小时之间，GFAP阳性（共聚焦）或标记B（电子显微镜）细胞的数量显著减少。这表明B细胞在此期间死亡或产生另一种细胞类型。EM分析显示，许多标记细胞在24小时和72小时后出现[三H] 胸腺嘧啶与D细胞相对应（图。d日,（f）).
抗细胞治疗
短期标记分析表明有两种有丝分裂活性的SGL细胞：B型和D型细胞。为了确定不同分裂细胞的起源，我们暂时杀死了该区域活跃分裂的细胞，并确定了不同细胞类型的出现顺序。我们推断，在抗有丝分裂治疗后，次级前体只会在初级前体分裂后出现。脑膜下联合应用阿糖胞苷(Doetsch等人，1999年a)在饮用水中（APB处理）放置7天，可消除齿状回SGL中大多数分裂细胞（图。一). 在抗核分裂治疗终止后的第2、4、6、8、10和15天，将五组动物处死。如图所示d日，SGL中的增殖在抗核分裂治疗终止后重新建立。到第2天，检测到一些BrdU标记的细胞，到第4天，其数量增加。APB终止15天后，BrdU标记的细胞数量已恢复到与盐水处理的对照组相似的水平。我们连续切片SGL的一个区域，并在APB终止后0、2、4和15天在电子显微镜下测定其组成。
APB处理后细胞再次出现。一，标有BrdU的电池(绿色)和GFAP(红色)APB终止后2天。b条APB后4天，BrdU–GFAP标记的细胞仍然存在，但也存在一些GFAP阴性的BrdU标记细胞。c（c），超结构分析[三H] -标记细胞（参见插入)2小时后[三H] 胸苷注射和APB治疗终止后2天。此单元格对应于B单元格。注意细胞质较轻，质膜轮廓不规则。d日、终止APB治疗后BrdU标记细胞重新出现的时间进程；n个= 5; 平均值±标准偏差。e（电子），APB终止后多次存活时SGL的细胞组成（EM）；n个= 3; 每只动物250个细胞；平均值±标准偏差标尺：一,b条，8微米；c（c），2微米。
结果如图所示e（电子）.百分之九十三(n个=212个细胞），在0天和91%时在SGL中分析的细胞(n个=281）在APB终止后2 d，可鉴定为B型细胞。在0和2天时，分别有7%和9%的标记细胞在所研究的切片上细胞质很少，无法识别。在这些生存期，SGL中未检测到D细胞。相反，到第4天，d型细胞又出现了，到第15天，d细胞的比例与对照组相似（图。d日). 如上所述，有一些细胞标记有BrdU或[三H] 胸腺嘧啶核苷终止APB治疗后2天。我们在用GFAP抗体对切片染色或对其进行EM处理后研究了这些细胞。所有在电子显微镜下研究的细胞（20个细胞）都与B细胞相对应（图。c（c）). 在共聚焦显微镜下观察到的95个细胞中，83个为GFAP阳性（图。一). 到第4天，许多BrdU阳性细胞没有GFAP染色（图。b条). 这表明，在终止抗有丝分裂治疗后，B细胞的分裂再生了D细胞。当动物被注射[三H] 胸腺嘧啶核苷在APB治疗终止后2d存活5个月，在齿状回颗粒细胞层（GCL）观察到完全分化的标记神经元。此外，在相似的存活时间后，在SGL中观察到标记的星形胶质细胞。这项长期存活实验表明，APB终止后2天，B细胞分裂产生了新的神经元。D型细胞的早期出现表明，这些细胞可能在新神经元的形成中起到短暂的前体作用。
逆转录病毒注射
上述抗有丝分裂治疗结果表明，SGL星形胶质细胞是齿状回的主要前体细胞。为了直接证明SGL中GFAP表达细胞在未接触APB的动物中作为神经元前体发挥作用，我们使用在GFAP启动子下表达RCAS禽白血病病毒受体（tva）的转基因小鼠(Holland and Varmus，1998年). 先前的工作表明，携带报告基因的禽白血病病毒（RCAS）感染Gtva小鼠会导致GFAP阳性星形胶质细胞的标记(Holland and Varmus，1998年). 因为逆转录病毒整合到DNA中，所以可以追踪受感染星形胶质细胞的后代。当携带碱性磷酸酶报告基因（RCAS-AP）的禽RCAS病毒被注射到成年Gtva小鼠的齿状回时，SGL中的一部分细胞受到感染。AP标记的细胞在SGL中出现需要约2天。这可能是由于细胞分裂和积累足够的AP蛋白以检测到所需的时间。我们在感染后2天通过光学显微镜分析了2μm切片中的20个AP标记的细胞。然后在电子显微镜下通过包埋后金免疫细胞化学法对这些细胞进行GFAP分析。所有AP标记的细胞都具有SGL B型细胞的特征（图。d日,e（电子）). 同样，感染后第2天在共焦显微镜下分析的大多数细胞都被双重标记为GFAP和AP（数据未显示），尽管少数细胞无法识别。这些结果支持了以下观点：星形胶质细胞是Gtva转基因小鼠RCAS感染的靶细胞(Holland and Varmus，1998年). 然而，由于在感染后2天，一些细胞可能已经开始转化，因此单靠这种方法不可能确定最初的靶细胞。为了进一步证实RCAS病毒感染了Gtva小鼠的GFAP阳性星形胶质细胞，我们对GFAP和RCAS病毒受体tvaR进行了双重免疫细胞化学。Gtva小鼠组织切片的共聚焦分析进一步证实，tvaR在具有SGL星形胶质细胞形态的GFAP阳性细胞中表达（图。a–c).
逆转录病毒标记的SGL星形胶质细胞在颗粒细胞层产生新的神经元。正常Gtva小鼠SGL中GFAP和tvaR的双重染色(a–c).一，GFAP染色。b条，tvaR染色。c（c），合并区域显示GFAP和tvaR的联合免疫染色。将RCAS-AP病毒注射到Gtva小鼠齿状回后鉴定的AP阳性细胞e（电子）和d日注射病毒后2d，对细胞进行电镜分析。d日，AP阳性细胞的塑料切片（1.5μm）(星号)NBT-BCIP染色(紫色矿床; 亮场）。将细胞重新包埋、切除，并用GFAP金结合抗体染色以进行超微结构分析(e（电子）). 标记细胞对应于包含由金颗粒修饰的中间丝的B细胞(箭头在中插入（见下文）。这个箭头在里面e（电子）显示该细胞质膜的不规则轮廓。（f），注射病毒后8天开始出现未成熟颗粒神经元。克，将RCAS-AP注射到Gtva小鼠的SGL中30天后，齿状回中存在AP标记的颗粒神经元。这些细胞在分子层中具有特征性的树突轴和轴突(箭头)投射到CA3。中的单元格插入产生苔藓纤维克。此单元体位于相邻部分中的近似位置，如星号。比例尺：一，5μm（适用于a–c);e（电子），2微米；（f），10微米；克，100微米。
通过研究不同存活期的AP阳性细胞，我们可以追踪SGL中RCAS-AP感染细胞中新颗粒神经元的形成和成熟情况（表). 逆转录病毒注射后8天观察到第一批未成熟神经元。它们有一个圆形的细胞体，位于SGL和GCL之间的界面上，并通过GCL投射出一个树枝状晶，在分子层中分支（图。（f）). 感染15天后，细胞体变得更大、更球形，一级树突更加发达和树枝状（表). 注射30天后，齿状回中观察到完全成熟的AP标记颗粒细胞（图。克). AP染色清楚地显示了这些细胞的形态，细胞体呈圆形或椭圆形，顶端有分支树突。还观察到轴突（苔藓纤维），它们起源于齿状回中的AP阳性细胞，并投射到海马CA3区（图。克,插入和箭头). 这一特征表明这些细胞是新形成的颗粒神经元。在靠近SGL–GCL边界的颗粒细胞层中观察到大多数标记有AP的颗粒细胞。标记颗粒神经元经常出现在由两个或三个细胞组成的簇中。存活30天后，门和SGL中也可见星形胶质细胞。
表1。
| 2天(n个= 8) | 4-8天(n个= 8) | 15天(n个= 10) | 21天(n个= 12) | 30天以上(n个= 17) |
|---|
| 星形细胞 | 37 | 37 | 31 | 20 | 54 |
| 神经元 | 0 | 0 | 4* | 15 | 35 |
| 未确认 | 8 | 0 | 4 | 1 | 2 |
讨论
我们在这里确定的成年海马体中新神经元的主要前体细胞在光学和电子显微镜下具有星形胶质细胞的特征。它们包含多个过程，中间丝富含GFAP。三个独立实验的结果支持这一结论。首先，许多增殖的SGL星形胶质细胞迅速转化为GFAP阴性且具有D细胞特征的细胞类型。第二，抗有丝分裂治疗导致SGL中的D细胞消失，但神经再生恢复。因为新神经元诞生的时间[三H] 胸腺嘧啶标记的星形胶质细胞被观察到，我们推断星形胶质细胞是主要的前体细胞。最后，我们发现SGL星形胶质细胞，特别是被禽逆转录病毒标记的星形胶质细胞产生颗粒神经元。我们通过杀死逆转录病毒感染后不同存活时间的动物，观察到颗粒神经元处于不同成熟阶段。一些SGL星形胶质细胞在长时间后仍被胸腺嘧啶类似物标记(Cameron等人，1993年; 这表明SGL中的部分或全部前体星形胶质细胞可能不对称分裂，其中一个子细胞保留为星形胶质细胞，另一个子细胞继续生成神经元后代。这与其他器官中干细胞的行为一致(Potten和Loefler，1990年). 然而，也有可能是一些星形胶质细胞对称分裂产生两个星形胶质细胞，而相邻的星形胶质细胞可能对称分裂产生神经元后代。两种细胞分裂模式都会更新SGL内的神经干细胞池。
SGL星形胶质细胞分裂后出现的小电子密度细胞（D细胞）表明SGL星形细胞可能不会直接产生新的神经元。我们的数据表明，APB治疗终止后2天，绝大多数（>90%）分裂的SGL细胞对应于星形胶质细胞，其中一些细胞产生神经元。然而，我们不知道前体细胞在最终分化为神经元之前分裂了多少次。D细胞可能是短暂的前体细胞，因为这些细胞在APB后2至15天，即星形胶质细胞分裂后和新神经元出现之前出现在SGL中。之后[三H] 胸腺嘧啶核苷治疗后，标记的D型细胞通常位于颗粒细胞层底部标记的星形胶质细胞附近。此外，D细胞在SGL和颗粒细胞层之间的界面经常与颗粒神经元接触，在颗粒细胞层出现新神经元。因此，D细胞很可能是新颗粒神经元形成过程中的短暂前体。这一解释与之前的一份报告一致，该报告建议类似于此处描述的D细胞的小的电子密度细胞充当神经元前体(卡普兰和贝尔，1984年). 然而，目前的研究表明，这些细胞不是初级前体细胞，而是来源于分裂的SGL星形胶质细胞。与SVZ不同，SVZ中的中间前体细胞（C型细胞）较大且有丝分裂程度高(Doetsch等人，1997年)SGL中的D细胞较小，似乎分裂不那么频繁。这表明SGL中瞬态前体对神经元产生的放大可能是有限的。尽管上述数据表明，D细胞在新神经元形成过程中作为短暂的前体细胞发挥作用，但这一说法没有直接的实验证据。这里的数据并不排除星形胶质细胞在不通过D细胞中间产物的情况下直接产生颗粒神经元的可能性。为了正确回答这个谱系问题，需要标记D细胞的特定标记和直接可视化星形胶质细胞向神经元转化的方法。
SGL星形胶质细胞的复杂形态，具有穿透颗粒细胞层的多个突起(小坂和哈马，1986年;埃肯霍夫和拉基克，1989年;Cameron等人，1993年)与神经前体细胞未分化的观念背道而驰，除了产生新的神经元外，没有其他作用。SGL星形胶质细胞似乎结合了祖细胞和神经胶质细胞的功能。插入成熟颗粒神经元的SGL星形胶质细胞的放射状突起可能将信息从成熟神经元所在的隔室传递到新神经元出生的生发层。这些信息可能会影响SGL中前体的增殖和分化。SGL星形胶质细胞的精细结构表明，这些神经元前体细胞发挥着齿状回胶质细胞特有的结构和化学作用。被认为是“胶质细胞”的细胞(巴雷斯，1999年)具有去分化潜能并发挥神经干细胞的功能，或者一些“胶质细胞”没有最终分化，可能比以前认为的更接近于干细胞谱系。
星形胶质细胞在胎儿和出生后早期发育过程中来源于放射状胶质细胞(莱维特和拉基克，1980年;埃肯霍夫和拉基克，1989年;Voigt，1989年). SGL星形胶质细胞（本研究）和SVZ星形胶质细胞(Doetsch等人，1999b)由于其来源于放射状胶质细胞，可能保持其神经生成潜能。在一些脊椎动物物种中，放射状胶质细胞存在于成人大脑中(霍斯特曼，1954年;史蒂文森和尹，1982年;Alvarez-Buylla和Nottebohm，1988年1995年），在鸣禽中，它们分裂，似乎是新神经元不断生成的主要前驱体(Alvarez-Buylla和Nottebohm，1988年;Alvarez-Buylla等人，1988年,1998). 在发育中的鸟类大脑中进行的逆转录病毒标记实验与放射状胶质细胞在发育过程中也可以作为神经元前体发挥作用的主张相一致(格雷和桑斯出版社，1992年). 在哺乳动物中，它们通常被认为是星形胶质细胞的忠实祖细胞(Schmechel和Rakic，1979年)但最近在发育中的哺乳动物大脑中的证据表明，放射状胶质细胞可以产生新的神经元，并可能对应于神经干细胞(Gaiano等人，2000年;Malatesta等人，2000年;Noctor等人，2001年). 因此，神经干细胞可能包含在谱系内：“神经上皮-放射状胶质细胞”(Alvarez-Buylla等人，2001年). 这一假设对SGL星形胶质细胞特别有吸引力，因为它们起源于放射状胶质细胞，在发育中的灵长类大脑中得到了很好的说明(埃肯霍夫和拉基克，1989年).
我们的发现表明，成年海马体中的新神经元起源于星形胶质细胞。值得注意的是，神经干细胞也可能存在于成人大脑的非神经原性区域(Weiss等人，1996年;Palmer等人，1997年,1999). 因此，在适当的条件下，其他脑区的星形胶质细胞亚群也可能作为神经前体发挥作用。具有神经干细胞潜力的星形胶质细胞的鉴定及其作为神经元前体的调节机制将对成人神经发生的实验操作及其未来在治疗性神经元替代中的应用具有强大的意义。
脚注
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）NS28478拨款的支持。B.S.得到NIH Grant GM07524的支持。J.M.G.-V.得到了拉卡夏基金会和西班牙-北美国家技术合作委员会的支持。我们感谢巴格瓦提·哈利帕和D.Lucia Collado Morente提供的技术援助。我们还感谢E.Holland和H.Varmus提供的Gtva小鼠和RCAS-AP质粒，以及Andrew D.Leavitt提供的抗vaR抗体。我们感谢安东尼·特拉蒙廷（Anthony Tramontin）和蒂埃里·林茨（Thierry Lints）对这份手稿的批判性评论。
通信地址应为加利福尼亚大学旧金山分校脑肿瘤研究中心Arturo Alvarez-Buylla，加利福尼亚州旧金山，邮政信箱0520，邮编94143-0520。电子邮件：ude.fscu.asti@allyuba.
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