基质金属蛋白酶-9基因敲除对脑缺血后血脑屏障和白质成分蛋白水解的影响

摘要

基质金属蛋白酶（MMP）家族由至少23种内肽酶组成，其具有共同的基序，包括前肽和锌结合催化区(长濑和沃斯纳，1999年). 总之，MMPs是一种细胞外蛋白酶，能够修饰细胞外基质的几乎所有成分。MMPs的生理作用包括胚胎重塑、血管生成、排卵和伤口愈合(长濑和沃斯纳，1999年). 由于基质金属蛋白酶可以降解许多基质成分，酶活性通过基因转录、原酶激活和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的动态抑制受到严格调控(Fini等人，1998年;Westermack和Kahari，1999年).

MMPs的非受控表达可导致组织损伤和炎症(卢卡舍夫和维尔布，1998年). 在中枢神经系统中，基质金属蛋白酶与多发性硬化症和阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关(Yong等人，1998年;Hartung和Kieseier，2000年). 越来越多的证据表明基质金属蛋白酶可能参与急性脑损伤。缺血后MMPs上调(Rosenberg等人，1996年;Mun-Bryce和Rosenberg，1998年b;Gasche等人，1999年;Heo等人，1999年)，出血(罗森博格和纳夫拉蒂尔，1997年)和创伤(Morita-Fujimura等人，1999年;弗格森和缪尔，2000年;Vecil等人，2000年;Wang等人，2000年)药物抑制基质金属蛋白酶可以减少组织损伤和水肿(Romanic等人，1998年;罗森博格等人，1998年). 最近，我们发现缺乏MMP-9表达的敲除（KO）小鼠对脑缺血有保护作用(朝日等人，2000b)和创伤性脑损伤(Wang等人，2000年). 这些数据表明MMP-9具有病理生理作用，但其确切机制尚待完全阐明。以前的研究主要集中在MMP介导的脑血管基底层胶原和层粘连蛋白的降解以及随后的血管完整性和水肿的扰动。然而，基质金属蛋白酶具有广泛的底物特异性(Imper和Van Wart，1998年)，因此可能会涉及其他目标。

在本研究中，我们研究了MMP-9在脑缺血中的有害作用是通过脑中关键细胞外基质的蛋白水解降解介导的假设。尽管可能涉及广泛的底物，但我们选择关注血脑屏障（BBB）、白质和细胞外基质中已知的MMP-9底物，因为这三个区室的损伤将在脑缺血的病理生理学中发挥核心作用。对于BBB，我们检测了闭塞带-1（ZO-1），这是一种与脑内皮细胞紧密连接功能表达相关的蛋白(Denker和Nigam，1998年;Harkness等人，2000年;Kniesel和Wolburg，2000年). 对于白质，我们关注髓鞘碱性蛋白（MBP）(坎帕尼尼，1988年;Chandler等人，1995年). 对于细胞外基质，我们检测了层粘连蛋白，因为它在大脑中广泛表达，可能介导神经元生存所必需的细胞-基质相互作用(Tsirka等人，1997年a). 在短暂局部缺血后检测这些底物的降解，并将MMP-9基因敲除小鼠与野生型（WT）同窝小鼠的结果进行比较。为了评估我们发现的特异性，我们还检测了非MMP-9底物。

材料和方法

动物模型所有实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）批准的制度方案进行实验动物护理和使用指南在记录MMP-9缺血性上调的实验中，使用了正常雄性CD-1小鼠。在所有其他实验中，均使用MMP-9基因敲除的雄性小鼠及其相应的野生型同窝小鼠。MMP-9敲除物来自CD-1背景(Vu等人，1998年). 检测到的主要表型变化是在生命的前3周骨骼生长板发育的紊乱模式，最终重塑，导致轴向骨骼外观正常(Vu等人，1998年).

采用标准的大脑中动脉腔内闭塞方法(朝日等人，2000b). 简单地说，用1%的氟烷在30%氧气和70%氧化亚氮中用面罩麻醉小鼠。右股动脉插管以记录血压并获取动脉血样。使用温控加热垫将直肠核心温度维持在37.5°C。在中线皮肤切口后，暴露右侧颈外动脉，并对其分支进行电凝。将涂有硅的7.0尼龙单丝通过颈外动脉引入右侧颈内动脉，以阻断大脑中动脉的起源。动脉闭塞120分钟后，通过拔出尼龙缝合线恢复血流。假对照组动物接受类似的手术，以暴露颈动脉而不阻塞大脑中动脉。用激光多普勒血流计对所有动物进行评估，以确认局部缺血诱导充分且成功再灌注，并比较实验组之间的区域灌注。缺血期间的灌注减少以缺血前基线的百分比进行评估。为了减少麻醉时间，取下激光多普勒血流探头，然后重新连接以进行再灌注。这导致基线无法再与缺血前水平进行比较。因此，再灌注曲线被评估为缺血期间的fold-增加与灌注水平的对比。

脑血管构筑的乳胶-碳黑灌注。KO的宏观检查显示，与之前描述的WT同窝小鼠和正常CD-1小鼠相比，包括Willis环在内的主要脑动脉似乎正常(朝日等人，2000b). 然而，重要的是要排除以下可能性，即缺血结果的差异不是由基因敲除小鼠和野生型小鼠之间脑血管结构的差异引起的。因此，一种已建立的血管铸型方法(Coyle和Jokalainen，1982年;Maeda等人，1999年)用于定量评估这些品系小鼠大脑中动脉和前动脉之间的边界区。简单地说，如上所述用氟烷麻醉小鼠，并注射盐酸罂粟碱（40 mg/kg，静脉注射）以诱导最大血管扩张。将乳胶溶液（Vultex，目录号563；芝加哥乳胶生产）与少量碳黑墨水（日本福井市博库赛）混合，加热至38°C，然后用于大脑灌注。福尔马林固定后，提取大脑并进行数字成像。使用NIH Image软件，使用由Maeda等人（1999年）首先，统计每个半球的吻合总数。接下来，通过识别吻合点来确定大脑背面大脑中动脉和前动脉之间的边界区，即血管的最窄部分或大脑中动脉与前动脉最近分支点之间的一半。将这些点连接成一条线，在距额极2、4和6 mm处测量距中线的距离。测量(n个=每组6只）。

神经功能缺损的测量。对小鼠进行神经功能缺损测试和评分如下：0，无可检测的神经功能缺损；1、左前爪未完全伸出；2、自发向左转弯；3、自发向左盘旋；4、无法移动或保持正常直立姿势。在缺血发作后2小时和24小时进行评估。

梗死体积的测量。诱导局部缺血24小时后处死小鼠。准备每个大脑的八个冠状切片（1 mm厚），并用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（西格玛，密苏里州圣路易斯）染色。梗死体积用标准的计算机辅助图像分析技术定量(n个=7种野生型；n个=8次击倒）。

抗体和试剂。针对小鼠MMP-9的兔多克隆抗体是Robert Senior（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）赠送的礼物。这种抗体能够识别MMP-9的潜伏形式和激活形式(Betsuyaku等人，2000年). 大鼠抗鼠髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）单克隆抗体（AA3）是Steve Pfeiffer（康涅狄格大学，法明顿，CT）赠送的礼物。兔抗MBP多克隆抗体购自Chemicon（Temecula，CA）。抗肌动蛋白和层粘连蛋白的兔亲和性分离抗原特异性抗体购自Sigma。小鼠MMP-9、人MMP-2和人MBP的纯化蛋白购自Chemicon。

组织提取物的制备。在缺血损伤开始后8、16和24小时，小鼠(n个=每个时间点5）用氟烷深度麻醉，然后用pH 7.4的冰镇PBS经心灌注。大脑很快被切除，并分成同侧和对侧两个半球。解剖对侧半球的缺血组织和匹配组织，立即在液氮中冷冻，并在−80°C下储存。如前所述制备脑组织提取物(Asahi等人，2000年b). 简单地说，脑样本在包括冰上蛋白酶抑制剂在内的裂解缓冲液中均质。离心后，收集上清液，并使用Bradford分析测定总蛋白浓度（Bio-Rad，Hercules，CA）。

蛋白质印迹分析。为了研究对照组和缺血脑中的蛋白质表达模式，制备等量（30μg）的总蛋白提取物。与2×样品缓冲液混合后，在自然条件下用三甘氨酸SDS-PAGE分离MMP-9、髓鞘碱性蛋白和PLP，在还原条件下分离肌动蛋白、层粘连蛋白、闭塞素和ZO-1。分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。在4°C的温度下，用pH 7.4、含有0.1%吐温20（PBS-T）的10%脱脂奶粉隔夜封闭所有斑点。然后，在室温下将过滤器与在封闭缓冲液中稀释的初级抗体孵育1小时。MMP-9、肌动蛋白、层粘连蛋白、髓磷脂碱性蛋白、髓鞘PLP、闭塞素和ZO-1的一级抗体稀释率分别为1:4000、1:500、1:1000、1:2000、1:10000、1:250和1:250。用PBS-T清洗后，在室温下用过氧化物酶结合二级抗体（驴制备的MMP-9、肌动蛋白、层粘连蛋白、髓磷脂碱性蛋白、闭塞素和ZO-1的抗兔IgG；山羊制备的髓磷脂PLP的抗鼠IgG）（Amersham Pharmacia Biotech，新泽西州皮斯卡塔韦）孵育1小时。最后，使用标准化学发光法（ECL；Amersham Pharmacia Biotech）检测抗原。

SDS-PAGE酶谱。将同样制备的蛋白质样品（如Western blot分析中所示）装入10%的三甘氨酸凝胶中，并用0.1%的明胶作为底物进行分离。通过电泳分离后，将凝胶重新命名，然后在37°C下与显影缓冲液孵育24小时，如前所述(朝日等人，2000b). 显影后，用0.5%考马斯蓝R-250对凝胶进行染色30分钟，然后进行适当的去渍。

免疫组织化学。为了评估短暂局灶性缺血后MMP-9的空间分布，在缺血诱导后16和24小时，用冰冷的PBS（pH 7.4）经心灌注小鼠，然后用冰冷的4%多聚甲醛（pH 7.4）在PBS中灌注(n个=3个野生型；n个=3次击倒）。假手术对照小鼠(n个=3）于24小时处死。取脑，用4%多聚甲醛浸泡在4°C的PBS中过夜，并用30%蔗糖冷冻4°C PBS中。使用切片机制备冰冻冠状切片（30μm厚）。在0.3%H中淬灭内源过氧化物酶后₂O（运行）₂在PBS中，用5%正常山羊血清封闭，切片在4°C下与MMP-9兔多克隆抗体（1:400）孵育过夜。用PBS清洗切片，用生物素化抗兔IgG二级抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA）以1:200的稀释度孵育1小时，然后用亲和素-生物素复合物孵育一小时。通过与二氨基联苯胺底物孵育观察过氧化物酶（Vector Laboratories）。阴性对照组除一级抗体外均接受相同的治疗。

埃文斯蓝外渗的定量评估。通过荧光检测渗出的埃文斯蓝染料定量评估血管通透性(Uyama等人，1988年). 简单地说，在短暂局灶性缺血2小时后再灌注开始时，将PBS中2%的Evans蓝作为BBB渗透性示踪剂进行静脉注射（4 ml/kg）(n个=7种野生型；n个=7次击倒）。18–20小时时，用氟烷对小鼠进行深度麻醉，并经心灌注冰镇PBS以去除血管内染料。大脑被切除并分为同侧缺血半球和对侧非缺血半球。在进一步分析之前，立即将同侧缺血半球冷冻在液氮中，并储存在−80°C下。将脑样品在1ml 50%三氯乙酸中匀浆并离心（10000rpm，20分钟）。上清液用乙醇稀释四倍。使用荧光板读取器（620nm激发，680nm发射）来量化染料浓度。计算基于溶解在相同溶剂（1:3；50%三氯乙酸：乙醇）中的外部标准（50–1000 ng/ml）。Evans蓝的渗出量以每一缺血半球的纳克数进行量化。

统计分析。定量数据表示为平均值+SEM。使用ANOVA进行统计比较，然后使用Tukey–Kramer检验进行组间比较。与的差异第页<0.05被认为具有统计学意义。

结果

MMP-9敲除小鼠和野生型小鼠的脑血管边界相似

为了排除脑血管解剖结构差异可能导致缺血结果差异的可能性，使用了一种包括乳胶和炭黑灌注的既定技术来划定大脑前动脉和大脑中动脉之间的边界（图。​（图1）。1). 比较野生型、MMP-9敲除小鼠和商业化获得的CD-1小鼠。之所以选择使用CD-1菌株，是因为MMP-9敲除物来源于这种背景。定量分析显示，所有三种小鼠的血管边界和吻合数量相似（表​（表11).

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图1。

乳胶-MMP-9敲除的炭黑灌注(击倒对手)，野生型(重量)和CD-1(光盘)大脑显示出类似的背血管分布和大脑前动脉和大脑中动脉的边界区。

表1。

大脑前动脉和中动脉之间的血管边界

	重量	击倒对手	光盘	方差分析
边界与中线的距离
距前杆2 mm	2.0  ± 0.1	1.9  ± 0.3	1.9  ± 0.3	F类= 0.08;第页= 0.92
距前杆4mm	2.2  ± 0.3	2.1  ± 0.3	2.3  ± 0.3	F类= 0.43;第页= 0.66
距前杆6 mm	2.5  ± 0.2	2.6  ± 0.2	2.7  ± 0.3	F类= 1.12;第页= 0.35
每个半球的吻合数	7.5  ± 1.8	9.0  ± 1.0	8.0  ± 1.8	F类= 1.72;第页= 0.22

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WT，野生型；KO、MMP-9基因敲除；CD，商用CD-1；n个=每组6人。

短暂局部缺血后MMP-9表达上调

在Western blot分析中，MMP-9的105 kDa潜伏形式在缺血损伤开始后8小时即被检测到，并且表达持续增加至24小时（图。​（图22A类). 缺血24小时后，MMP-9敲除小鼠或误操作对照脑中未检测到MMP-9（图。​（图22A类). 以明胶为底物，通过酶谱评估MMP-9的酶活性。在缺血后8到24小时内，MMP-9升高的类似情况也被记录下来（图。​（图22B类). MMP-9敲除小鼠的缺血脑在24小时时未检测到MMP-9活性（图。​（图22B类). 有趣的是，缺血24小时后，在对侧大脑的Western blot上检测到弱免疫反应带，在酶谱上检测到轻微的胶溶活性。在Western blot和酶谱分析中，未观察到MMP-9活化形式的可靠检测。然而，除了MMP-9外，野生型和MMP-9基因敲除小鼠的缺血脑在～72 kDa时也可见微弱的凝胶溶解活性条带。这些条带的出现水平与人类MMP-2标准相同，这表明在这种局灶性缺血模型中可能出现低水平的MMP-2诱导。

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图2。

A类MMP-9蛋白印迹显示短暂局灶性脑缺血后蛋白表达上调。MMP-9的表达主要局限于l05-kDa酶原。假手术大脑提取物(S公司)没有显示MMP-9上调。这个车道标记24小时反向和24小时KO分别代表24小时时来自MMP-9敲除小鼠对侧脑和缺血脑的样本。以小鼠MMP-9为标准。B类明胶酶谱显示短暂局灶性脑缺血后MMP-9上调。大多数情况下，检测到105kDa酶原，尽管这些酶原在97kDa时也显示出一些凝胶溶解活性，与裂解活化酶相对应。假手术大脑(S公司)没有显示MMP-9上调。这个车道标记24小时反向和24小时KO分别代表24小时时来自MMP-9敲除小鼠对侧脑和缺血脑的样本。微妙的胶溶活性也接近MMP-2的水平。以小鼠MMP-9和人MMP-2为标准。

免疫组织化学显示，MMP-9在非缺血假手术对照脑中的表达非常低（图。​（图3三A类,B类). 缺血后，在缺血区域内的皮层和纹状体中观察到MMP-9在16小时时上调（图。​（图3三C类,D类); 24小时后变得更加明显（图。​（图3三E类,F类). MMP-9主要在脑血管系统的内皮细胞中表达。然而，MMP-9免疫反应也出现在大量的实质细胞中。MMP-9敲除小鼠的大脑中未观察到免疫反应细胞（图。​（图3三G公司,H（H）). 在没有一级抗体的情况下孵育24小时缺血脑的对照组中未观察到任何检测结果（图。​（图3三一、 J型).

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图3。

抗MMP-9免疫组织化学。A、 B类，假手术后的大脑没有MMP-9的表达。C–F类野生型小鼠脑短暂局灶性缺血后MMP-9染色增强。在缺血半球的皮质和纹状体区域均观察到弥漫性MMP-9免疫反应。免疫反应性MMP-9主要见于内皮细胞。此外，在缺血区的实质细胞中也检测到MMP-9的表达。G、 H（H），敲除小鼠缺血脑内未观察到免疫反应细胞(击倒对手).一、 J型，阴性对照在没有初级抗体的情况下孵育，未显示染色。比例尺，50μm。

MMP-9敲除小鼠血脑屏障成分的缺血降解减少

基质金属蛋白酶底物ZO-1是一种与BBB紧密连接功能表达相关的关键蛋白。Western blot分析检测到ZO-1的220kDa带，在缺血损伤后显著降解（图。​（图44A类). 密度分析显示，缺血后24小时，ZO-1降低至基线水平的～30%（图。​（图44A类). 与野生型小鼠相比，MMP-9基因敲除小鼠中ZO-1的缺血降解显著降低（图。​（图44A类). 然而，有趣的是，在我们的检测灵敏度范围内，缺血后未观察到其他BBB-相关蛋白闭塞素的明显降解（图。​（图44B类).

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图4。

A类Western blot显示缺血发作后BBB-相关蛋白ZO-1的时间依赖性降解。密度分析表明，MMP-9敲除小鼠的ZO-1降解显著改善(击倒对手).n个=每个时间点5只动物*第页< 0.05.B类，Western blot显示另一个BBB相关蛋白，即闭塞素没有显著变化。n个=每个时间点5只动物。

短暂局部缺血后MMP-9基因敲除小鼠血脑屏障破坏减弱

埃文斯蓝标准品的荧光分光光度分析显示，荧光强度和染料浓度在50–1000 ng/ml范围内呈线性相关（数据未显示），因此可以定量测量缺血小鼠大脑中的染料浓度。在所有再次灌注伊文思蓝的小鼠中，在缺血后18–20小时观察到染料渗入脑实质。MMP-9基因敲除小鼠缺血脑血脑屏障破坏的严重程度，即每个缺血半球的Evans蓝外渗，显著降低（1263±529 ng/半球；n个=7）与野生型小鼠（3067±621 ng/半球；n个=7）（图。​（图55A类,B类).

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图5。

A类，在野生型小鼠中显示埃文斯蓝渗漏的代表性大脑(重量)减少MMP-9敲除物的泄漏(击倒对手).B类Evans蓝的荧光定量显示，与野生型小鼠相比，敲除小鼠的BBB泄漏显著减少。n个=每组7人*第页< 0.05.

MMP-9敲除小鼠髓鞘碱性蛋白的缺血降解减少

已知的MMP-9底物MBP被检测为短暂局灶性缺血后白质损伤的标志物。正如预期的那样，MBP的Western blot显示了与四种亚型（21.5、18.5、17和14kDa）相对应的多条带（图。​（图66A类). 缺血损伤后，MBP降解。密度分析表明，缺血后24小时，21.5、18.5和14kDa亚型发生显著降解（图。​（图66B类). MBP抗体识别的降解带在～10 kDa时出现（图。​（图66A类). 短暂局灶性缺血后24小时，MBP降解带的强度显著增加（图。​（图66C类). 与野生型相比，MMP-9基因敲除小鼠18.5和14kDa MBP的缺血降解以及降解MBP的10kDa带的积累显著改善（图。​（图66B类,C类). 其他主要髓鞘相关蛋白PLP和DM20也进行了检测。野生型或基因敲除小鼠的缺血损伤后，PLP的26 kDa带或DM20的20 kDa区没有检测到降解（图。​（图77A类,B类).

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图6。

A类，MBP的蛋白质印迹检测到所有四种异构体（21.5、18.5、17和14kDa）。缺血后，降解带(度)出现在～10 kDa。B类定量密度分析显示，缺血24小时后，21.5、18.5和14kDa MBP条带与假对照组相比显著降解*第页< 0.05. 在MMP-9基因敲除小鼠中(击倒对手)缺血24小时后，18.5和14kDa MBP的带强度显著高于野生型小鼠；†第页< 0.05;n个=每个时间点5。C类，密度分析表明降解MBP(度)野生型小鼠缺血发作后随时间增加。MMP-9敲除小鼠中降解MBP的积累显著减少(击倒对手).n个=每个时间点5个*第页< 0.05.美国。，任意单位。

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图7。

A类PLP和DM20的Western blot显示缺血后无明显降解。B类密度测定定量显示，在野生型或MMP-9基因敲除小鼠中有统计学意义的影响(击倒对手).n个=每个时间点5。

为了评估这些发现的相对特异性，我们还检测了层粘连蛋白作为代表性细胞外基质蛋白和肌动蛋白作为代表和普遍存在的细胞内蛋白。在我们的模型系统中，Western blot检测到层粘连蛋白在220kDa和肌动蛋白在42kDa的主带（图。​（图88A类,B类). 短暂局部缺血后，在我们的检测灵敏度范围内，层粘连蛋白和肌动蛋白均未出现明显的降解迹象（图。​（图88A、 B类).

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图8。

A类，在野生型或敲除MMP-9的小鼠中，细胞外基质成分层粘连蛋白的蛋白质印迹在缺血后没有显示出可检测的降解(击倒对手).n个=每个时间点5。B类在野生型或MMP-9基因敲除小鼠缺血后，普遍存在的细胞内蛋白肌动蛋白的Western blot显示未检测到降解。n个=每个时间点5。

MMP-9基因敲除降低短暂局灶性缺血后的病变体积

MMP-9基因敲除小鼠和野生型同窝小鼠的生理参数没有差异（数据未显示）。激光多普勒血流测定证实，野生型和MMP-9基因敲除小鼠的缺血程度一致且相似（野生型为9.9±1.8%，敲除小鼠为9.0±0.8%，以缺血前基线百分比表示）。在再灌注开始后，也观察到类似的血流恢复水平（野生型14.1±1.2，敲除型13.7±2.9；表达为缺血期间的fold-增加vs灌注水平）。

MMP-9基因敲除小鼠24小时缺血损伤体积显著减少（54.3±9.7 mm^三;n个=8）与野生型小鼠相比（86.4±10.7 mm^三;n个=7）（图。​（图99A类,B类). 敲除小鼠的平均神经功能缺损略有改善（2.3±0.3；n个=8）与野生型小鼠相比（2.9±0.3；n个=7），但该差异未达到统计显著性(第页= 0.18).

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图9。

20小时缺血损伤体积(A类)和区域(B类)显示基因敲除小鼠(击倒对手;n个=8）与野生型小鼠相比，显著减少了缺血性损伤(重量;n个= 7). *第页< 0.05.

讨论

细胞内蛋白水解酶级联的异常激活有助于脑缺血的病理生理学，大量证据表明钙蛋白酶等酶的有害作用(Bartus等人，1995年)和半胱天冬酶(Schulz等人，1999年). 现在积累的数据表明，细胞外蛋白水解级联也可能参与(Turgeon和Houenou，1997年;金里奇和特雷尼利斯，2000年;Cuzner和Lo，2001年). 特别是，锌内肽酶的MMP家族已被证实(Mun-Bryce和Rosenberg，1998年b).

在本研究中，我们首次发现短暂局灶性缺血后BBB和白质的关键成分被降解，与野生型同窝小鼠相比，MMP-9基因敲除小鼠的这些作用显著改善。相关性在于，这些成分是MMP-9底物，而非MMP-9基质不受影响。ZO-1是与内皮紧密连接形成相关的BBB蛋白，在缺血发作后表现出时间依赖性降解，在MMP-9基因敲除小鼠中显著减弱。相应地，血脑屏障破坏在敲除中减少。在白质中，四种MBP亚型中的三种在缺血后降解，在MMP-9敲除小鼠中也显著减弱。伴随着基质蛋白水解的这些改变，梗死体积减少。综上所述，这些数据表明，MMP-9通过降解BBB和白质腔室中的关键成分，有助于脑缺血的病理生理学。

以前对MMP-9在缺血中的作用的研究主要集中在脑血管基底膜。已知IV型胶原和层粘连蛋白都是MMP-9底物，因此预计这些基底层成分的蛋白水解会干扰BBB的完整性并导致血管源性水肿(Mun-Bryce和Rosenberg，1998年a)事实上，MMP-9参与BBB功能障碍可能不仅限于缺血，还可能发生在细菌性脑膜炎的广泛神经炎症反应中(Kieseier等人，1999年)，冻伤(Morita-Fujimura等人，1999年)和兴奋毒性(Zhang等人，2000年). 然而，BBB功能并不仅仅由基底层决定。另一个主要的生理决定因素是大脑内皮细胞之间的紧密连接。这些紧密连接的功能完整性通过特殊蛋白质介导，这些蛋白质包括闭塞带家族（ZO-1、ZO-2、ZO-3）、闭塞素、扣带蛋白和克劳丁(Denker和Nigam，1998年;Kniesel和Wolburg，2000年). 在这些蛋白质中，ZO-1是MMP-9的底物(Harkness等人，2000年). 这与我们的数据一致，即在MMP-9敲除小鼠中ZO-1的缺血性降解显著降低。ZO-1是一种特定的分子标记物，对应于发育中大脑中BBB的成熟(Nico等人，1999年). 在本研究中，敲除物中ZO-1蛋白水解的改善伴随着BBB破坏的减弱。有趣的是，我们无法检测到另一种BBB蛋白，即闭塞素的降解。这种差异可能与MMP-9介导的缺血后蛋白水解的特异性有关。然而，值得注意的是，闭塞素也被鉴定为不明金属蛋白酶的底物(Wachtel等人，1999年). 目前尚不清楚为什么我们没有检测到缺血后闭塞素的显著降解，以及各种BBB相关蛋白的差异敏感性的原因。

在本研究中，我们无法检测到层粘连蛋白的统计学显著降解。层粘连蛋白是几种基质金属蛋白酶的底物(Imper和Van Wart，1998年)和其他蛋白酶，包括纤溶酶(Chen和Strickland，1997年;Tsirka等人，1997年a). 先前的研究已经证明局部缺血后大脑层粘连蛋白免疫染色减少(哈曼等人，1995年)和兴奋性毒性损伤(Chen和Strickland，1997年;Tsirka等人，1997年b). 蛋白质印迹可能不够灵敏，无法检测到这些变化。然而，值得注意的是，ZO-1降解在我们的模型中更为显著，蛋白质水解水平很容易用Western blots检测到。在缺血性血脑屏障破坏中，降解水平的差异可能与ZO-1与层粘连蛋白水解的相对贡献有关。

MMP与脑血管完整性之间的关系可能超越血管源性水肿的发展。可以想象，血管壁的蛋白水解减弱也可能增加破裂和出血的风险(Mun-Bryce和Rosenberg，1998年b). 在狒狒局灶性缺血模型中，MMP-9的局部升高与出血灶的形成呈正相关(Heo等人，1999年)MMP抑制剂BB-94降低实验性栓塞性卒中后出血性转化率(Lapchak等人，2000年). 在我们目前的小鼠缺血模型中，没有观察到出血性转化，很可能是因为我们使用了动脉闭塞的机械方法。众所周知，血栓栓塞导致缺血模型更容易出血(朝日等人，2000a). 然而，在这些敲除制剂中使用栓塞方法来解剖脑出血中的MMP通路对未来的研究将是重要的。

脑缺血的实验研究主要集中于灰质损伤。然而，在临床中风中，白质损伤极其重要(Petty和Wettstein，1999年). 在这里，我们首次显示脑缺血后MBP的三种亚型被降解，MMP-9敲除显著改善。相关性在于MBP是MMP-9底物(Chandler等人，1995年). 蛋白水解是MBP特有的，其他髓磷脂蛋白PLP和DM20没有降解。PLP和DM20是由同一基因编码的交替剪接跨膜蛋白(Nave等人，1987年)占髓鞘中蛋白质含量的50%。PLP和DM20缺乏降解，表明MBP的发现可能是MMP-9蛋白水解的特异性。MMP-9参与多发性硬化患者MBP免疫原片段的蛋白水解过程(库兹纳和奥普德纳克，1999年;Hartung和Kieseier，2000年). 在脑缺血的情况下，可能会发生类似的炎症反应。一般来说，很难量化脑缺血中白质损伤及其对总组织梗死的影响，尤其是在白质成分含量低的大鼠或小鼠模型中。最近，免疫组织化学分析被发展成为一种可能的方法(Valeriani等人，2000年). 我们的研究结果还表明，MBP的丢失可能被用作评估白质缺血损伤途径的标记物。

我们之前已经证明，MMP-9基因敲除小鼠对永久性局部缺血具有保护作用(朝日等人，2000b). 这里，除了关键BBB和白质成分的蛋白水解减弱外，短暂局灶性缺血后梗死体积也显著减少。永久性和短暂性脑缺血再灌注的病理生理学可能存在重要差异。因此，MMP-9基因敲除在这两种范式中都是有益的，这进一步支持了MMP-9上调可能在缺血病理生理学中发挥中心作用的假设。MMP-9的有害机制可能是广泛的，因为这些敲除物也可以防止创伤性脑损伤(Wang等人，2000年).

与本研究相关的一些警告。首先，MMP-9的底物范围很广，超出了本文所研究的底物。在这里，我们重点关注与脑缺血病理生理学相关的关键靶点的代表性底物。其他靶点也需要检查，因为缺血性损伤显然是多因素的。其次，我们的免疫组化数据表明MMP-9主要在血管室上调，这与内皮细胞可以分泌这种蛋白酶的事实一致(Herron等人，1986年). 因此，MMP-9酶最适合降解ZO-1。然而，众所周知，神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞也能分泌MMP(Gottschall和Deb，1996年;Oh等人，1999年;Rosenberg等人，2001年). 我们在薄壁组织中观察到一些细胞染色，但需要进行额外的共定位研究来评估我们模型中的特定细胞类型，尤其是关于白质中MMP-9活性的研究。第三个警告涉及MBP降级。虽然这将是白质损伤的有用标志，但我们的数据无法确定髓鞘完整性的丧失是否会对轴突本身产生功能性影响。第四，目前的数据支持MMP-9的有害作用。然而，这些都是急性实验。众所周知，基质金属蛋白酶在重塑和细胞迁移中发挥重要作用(Yong等人，1998年;长濑和沃斯纳，1999年). 因此，MMPs可能在缺血性损伤的慢性恢复过程中发挥有益作用。对这些基因敲除小鼠的长期研究将有助于解决这个问题。最后，越来越多的数据表明，通过纤溶酶原轴的蛋白水解也可能有助于脑缺血的病理生理学(Wang等人，1998年;Ahn等人，1999年). 众所周知，基质金属蛋白酶与纤溶酶原轴协同作用(库兹纳和奥普德纳克，1999年). 因此，仔细剖析MMP-9在级联中其他蛋白酶的背景下的作用是很重要的。

总之，本研究表明，MMP-9基因敲除可显著改善BBB和白质关键成分的缺血性降解。敲除小鼠也能抵抗短暂的局灶性缺血，这进一步支持了我们之前在永久性缺血方面的发现。这些数据表明，MMP-9可能在脑缺血的广泛病理生理学中发挥关键作用。对基质金属蛋白酶作用的底物和机制的进一步表征可能有助于描绘中风的新治疗靶点。

脚注

参考文献