赫斯1和赫斯5哺乳动物内耳毛细胞正常发育所需的活动

摘要

阳性和阴性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的调节级联在哺乳动物神经系统中的同种外胚层祖细胞生成多种类型的神经元中起着重要作用(Kageyama和Nakanishi，1997年;Lee，1997年). 内耳最初形成为外胚层的增厚，称为后脑中的耳板。耳板产生第八颅神经的神经元，并向内凹陷成为耳囊，Corti和前庭器官将从耳囊发育而来(范德沃特，1983年;托雷斯和吉拉尔德斯，1998年). 这些器官的感觉上皮由机械感受毛细胞、支持细胞和神经末梢组成。在小鼠耳蜗中，终末有丝分裂发生在胚胎第13天（E13）和E14天之间(鲁本，1967年)，并且可以首先在基底中的E15上识别分化的毛细胞(Anniko，1983年;Lim和Anniko，1985年). 组织学研究表明，在耳蜗形态发生过程中，内毛细胞（IHC）来源于位于Corti未来器官内侧的大上皮嵴（GER）中的祖细胞，而外毛细胞（OHC）来源于小上皮嵴中的远端祖细胞(Lim和Rueda，1992年). 毛细胞发育的时间过程包括细胞命运承诺——确定、初始分化、成熟和获得静纤毛束(Kelley等人，1993年;Fekete，1996年;Torres和Giraldez，1998年). 最近，关于哺乳动物耳蜗毛细胞分化这一初步决定的两个证据已经确立。首先，Notch1信号通路参与调节发育为毛细胞的祖细胞数量，有助于产生规则的耳蜗镶嵌(Lanford等人，1999年;Zine等人，2000a). 第二，需要bHLH转录因子Math1作为小鼠内耳毛细胞规格的正向调节器(伯明翰等人，1999年;郑和高，2000).

bHLH负转录因子Hes1和Hes5与果蝇毛和拆分增强程序[E类(标准普尔)] (Akazawa等人，1992年;Sasai等人，1992年)已证明通过抑制bHLH阳性调节物在中枢神经系统发育过程中的作用来影响细胞命运的确定(Kageyama和Nakanishi，1997年).

此外，之前的研究报告称赫斯1和赫斯5Notch激活诱导表达(Jarriault等人，1995年,1998;Ohtsuka等人，1999年). 尽管最近的一项研究表明赫斯1充当IHC分化的负面调节器(Zheng等人，2000年)，没有证据表明需要控制OHC分化。准确控制IHC和OHC对于在哺乳动物耳蜗内产生有规律的毛细胞和支持细胞镶嵌是必要的。在这里，我们使用逆转录（RT）-PCR分析检测了赫斯1,赫斯5、和数学1发育中的小鼠耳蜗中的基因。使用就地杂交，赫斯1和赫斯5检测E18和新生儿耳蜗mRNA表达谱。

的角色赫斯1和赫斯5通过分析发育中的内耳来研究毛细胞分化赫斯1和赫斯5基因。

材料和方法

动物。化合物赫斯1和赫斯5胚胎和早期新生儿[出生后第0天（P0）]突变体是从赫斯1^+/−;赫斯5^+/−或赫斯1^+/−;赫斯5^−/−老鼠。这些突变小鼠系已在前面描述过(Ishibashi等人，1995年;Ohtsuka等人，1999年;Cau等人，2000年). E0.5定义为观察到阴道堵塞的当天中午。内耳组织是从E16–E18胚胎或出生后立即采集的，因为赫斯1^−/−小鼠在妊娠期或出生后1天内死亡(Ishibashi等人，1995年). 用尾部DNA PCR对胚胎和P0小鼠进行基因分型。

逆转录聚合酶链反应。从E12.5到新生儿的五个发育阶段的10-14个耳蜗中解剖出感觉上皮（P0）。如前所述进行并控制RT-PCR(Zine等人，2000b)几乎没有修改。使用TRIZOL（马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司）分离总RNA。通过低聚dT纤维素分离从总RNA中纯化聚腺苷酸化RNA（Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）。mRNA使用Superscript II RNase free reverse transcriptase（Life Technologies）进行逆转录。

对于PCR扩增，典型的热循环曲线如下：95°C下5分钟，58°C下45秒，72°C下1.5分钟，共40个循环。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭染色，纯化并测序。RT-PCR分析的引物如下：赫斯1上游CAGCAGTGCAACACGACAC和下游TCGTTCATGCACTCTGAGAG；对于赫斯5上游CGCATCAA CAGCAGATAG和下游TGGAAGTGT AAA GCAGCTTC；对于数学1上游AGTGACGGAGAGTTTTCCCC和下游CTGCAGCGTCCGAAGTCAA；对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），上游为GTCATCTCCGCCCCTTCTGC，下游为GATGCCTTCACCTCTTG。

现场杂交。从E18和P0内耳解剖耳蜗，并将其固定在4%多聚甲醛中3小时，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，在4°C下过夜。

对于冷冻切片，耳蜗在PBS中的20%蔗糖中进行冷冻保护，嵌入OCT复合物（Tissue-Tek；Miles，Elkhart，in）中，并固定切片。为了进行整体表面准备，从所有周围组织中解剖耳蜗，以暴露发育中的感觉上皮。从cDNA合成RNA探针用于赫斯1(Tomita等人，1996年)和赫斯5(Akazawa等人，1992年).赫斯1被线性化Xho公司I并由T3转录，以及赫斯5被线性化Hin公司dIII并通过T3 RNA聚合酶转录。

如前所述，使用地高辛（DIG）标记的cRNA探针处理整个表面制备和冷冻切片（10μm）(Schaeren-Weemers和Gerfin-Moser，1993年). 简言之，固定后，样品在1%Triton X-100中培养并用蛋白酶K消化。在50°C的预混合溶液中培养2小时，然后在50°C的条件下暴露于cRNA探针过夜。探针由碱性磷酸酶偶联的抗DIG抗体（Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany）揭示，该抗体与硝基蓝四唑氯化铵和5-溴-4-氯吲哚基磷酸盐底物反应进行显色反应。一些全套耳蜗制剂在就地杂交程序。

组织学和免疫细胞化学。将胚胎（E16–E18）和P0小鼠的耳蜗在4°C的PBS中的4%多聚甲醛中固定过夜。如前所述，我们对耳蜗的整体表面准备和石蜡切片进行了免疫荧光分析(Zine等人，2000a). 耳蜗石蜡切片和表面制备物均在含有5%正常驴血清的PBS中预孵育2小时，然后与抗肌球蛋白VIIa的多克隆抗体孵育(Hasson等人，1995年)或对抗数学1(赫尔姆斯和约翰逊，1998年). 抗体孵育在4°C下过夜，并与罗丹明或Cy3-共轭驴抗兔二级抗体结合（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）。其他耳蜗表面准备物用罗丹明结合的指骨苷（5μg/ml）染色45分钟，以观察Corti器官中毛细胞分化的模式，尤其是富含肌动蛋白的静纤毛。

共焦和扫描电子显微镜。数字图像是在莱卡（德国努斯洛赫）TCS-NT共焦激光扫描显微镜上拍摄的。用于数字的图像使用NIH Image或Photoshop（Adobe Systems，Mountain View，CA）软件程序进行处理。

扫描电子显微镜下，将耳蜗固定在2%戊二醛中0.1米pH 7.2的二甲酰二钠缓冲液2小时，然后用1%四氧化锇固定1小时。在二羧酸缓冲液中洗涤后，耳蜗在升高浓度的乙醇中脱水，在临界点干燥，然后溅射镀金。所有材料均在Jeol（Peabody，MA）630F扫描电子显微镜中进行检查，扫描电子显微镜工作电压为5 kV。

毛细胞定量。我们量化了早期新生儿（P0）突变小鼠与野生型同窝小鼠耳蜗毛细胞的数量。对用罗丹明结合的指骨样肽处理过的耳蜗表面制剂进行计数。我们对Corti器官1600μm长的一个区域进行了分析，该区域从耳蜗底部附近开始，一直延伸到中弯。

在前庭感觉上皮中，我们使用40×物镜在整个感觉上皮横切面上用肌球蛋白VIIa免疫染色，计算突变体P0胞囊和黄斑球囊的毛细胞数量，与野生型小鼠的毛细胞数相比。只统计切片垂直于神经上皮表面的节段。对每个黄斑的三到五个远切面进行毛细胞计数，对每个基因型的两到五只动物进行计数。

结果

赫斯1,赫斯5、和数学1在发育中的耳蜗中表达

RT-PCR分析（图。​（图1）1)如前所述，从发育中的耳蜗中分离出感觉上皮细胞，主要由Corti器官、基底膜的一部分、GER和LER组成(Zine和de Ribaupierre，1999年).赫斯1和赫斯5转录物被E14检测到，这是E15毛细胞细胞学分化开始之前的一个阶段(Lim和Anniko，1985年).数学1早在E12.5就表达，这与E12.5在Corti胚胎器官中启动Math1/LacZ表达的研究一致(伯明翰等人，1999年). 的表达式赫斯1,赫斯5、和数学1E14和P0之间，这是一个对初始毛细胞分化至关重要的发育期，这表明这些基因之间可能存在功能关系。

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图1。

RT-PCR分析赫斯1,赫斯5、和数学1在发育中耳蜗的感觉上皮中。如图所示，用GAPDH对所有cDNA进行共扩增。数学1在E12.5早期检测到转录本，而赫斯1和赫斯5E14检测到。以下表达式赫斯1,赫斯5、和数学1维持在发育中的感觉上皮中，直到P0。

为了确定赫斯1和赫斯5基因，我们使用非放射性的就地E18–P0耳蜗冷冻切片和整体表面制备的杂交（图。​（图2）。2).现场E18耳蜗切片杂交显示赫斯1主要在两个领域表达，包括GER和LER。含有毛细胞和支持细胞的Corti器官缺乏赫斯1成熟阶段的信号（图。​（图22A类)，尽管弱杂交信号赫斯1除GER和LER外，在E15小鼠基底耳蜗轮的支持细胞区域也观察到（数据未显示）。

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图2。

非放射性赫斯1(A–C)和赫斯5(D–F型)核糖核酸就地在发育中的小鼠耳蜗E18和P0处进行杂交。A类,D类,现场E18耳蜗基底横切面杂交。赫斯1信使核糖核酸(A类)在LER细胞和GER大面积表达，Corti器官除外(OC公司).赫斯5信使核糖核酸(D类)表达于LER，柱细胞(P（P）)和位于OHC底部的Deiter电池（括号中的区域箭头).赫斯5也发现于内指骨细胞(箭头)，靠近内毛细胞区域。毛细胞(大箭头表示IHC；斜箭头表示缺少三行OHC）赫斯5杂交信号。请注意赫斯5血管纹边缘细胞的表达(开箭头).星号表示螺旋血管，这是Corti器官在此成熟阶段位置的里程碑。B类,E类,现场在P0。的表达式赫斯1(B类)如在耳蜗切片中观察到的那样，横跨GER的大面积区域(A类). 的表达式赫斯5(E类)在相对狭窄的GER细胞带中观察到。有一种微弱但具体的赫斯5LER内细胞的表达(箭头). 注意两者都不存在赫斯1和赫斯5毛细胞的杂交信号(箭头指示IHC行的位置；支架表示OHC行）。C类,F类，全安装耳蜗表面准备的横截面图B类和E类分别是。C类，本节确认赫斯1GER细胞中的表达及其在Corti器官细胞中的缺失(支架). 的杂交标签赫斯1也位于LER中(箭头).F类,赫斯5表达仅限于非感觉支持细胞（Deiter细胞；箭头)在科尔蒂的器官内。本节还确认了赫斯5是LER单元(箭头). 一个软弱的标签赫斯5在GER区和基底膜附近的细胞中观察到。星号表示螺旋容器。比例尺，20μm。

P0（图。​（图22B类)也显示了赫斯1GER区域和Corti器官的缺失。A部分（图。​（图22C类)通过图中所示的全安装表面处理。​图22B类已确认赫斯1GER和LER中的表达以及赫斯1来自Corti器官的杂交信号。Hes5原位杂交（图。​（图22D–F型)与E18–P0耳蜗相比，E18–P耳蜗的表达模式既重叠又不同赫斯1在Corti器官中（图。​（图22D类,F类),赫斯5在柱细胞、Deiter细胞和内指骨细胞中表达。喜欢赫斯1，表达式赫斯5未在毛细胞中检测到。赫斯5也在LER的细胞中大量表达（图。​（图22D类)，尽管其在GER中的表达仅限于狭窄的细胞带（图。​（图22E类). 血管纹边缘细胞表现出特异性赫斯5表达式。

定义的角色赫斯1和赫斯5毛细胞发育中的基因，我们分析了不同基因型的耳蜗表面准备和内耳切片赫斯1^+/−;赫斯5^+/−或赫斯1^+/−;赫斯5^−/−交叉路口。我们获得了八种可能的基因型（Cau等人，200），并对其中六种耳蜗进行了毛细胞计数（如表所示​表1）1)前庭为四个（见图。​图66).

表1。

Hes1和Hes5缺失对听觉毛细胞分化的影响

	耳蜗#	国际水文中心	职业健康保险	HC总数	IHC对	BM的相对长度：
						IHC对	第四排OHC
重量	一	208	619	827	1
	b条	189	581	770	0
	c（c）	202	604	806	1
平均值		200 ± 10	601 ± 19	801 ± 29	0.66	<1%	<1%
赫斯1−/−	一	291	640	931	数控
	b条	261	583	844	数控
	c（c）	275	615	890	数控
平均值		276 ± 151-160	612 ± 28	888 ± 43*		38%	5%
第页价值		0.0018	0.5987	0.0442
赫斯1−/−;赫斯5+/−	一	338	645	983	数控
	b条	315	609	924	数控
平均值		326 ± 161-160	627 ± 25	953 ± 42*		63%	12%
第页价值		0.0015	0.2831	0.0052
赫斯5−/−	一	201	663	864	7
	b条	230	713	943	11
	c（c）	219	674	893	15
平均值		217 ± 14	683 ± 26*	900 ± 40*	11	5%	45%
第页价值		0.1691	0.0120	0.0254
赫斯1+/−;赫斯5−/−	一	227	750	977	6
	b条	219	723	942	14
	c（c）	197	701	898	23
平均值		214 ± 15	725 ± 251-160	939 ± 40*	14	7%	62%
第页价值		0.2379	0.0024	0.0082
赫斯1+/−;赫斯5+/−	一	221	645	866	10
	b条	207	633	840	5
	c（c）	198	597	795	6
平均值		209 ± 12	625 ± 25	834 ± 36	9	4%	12%
第页价值		0.3609	0.2626	0.2866

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用从突变、杂合子和野生型小鼠的耳蜗中分离出的罗丹明鬼臼蛋白标记毛细胞后，对毛细胞进行定量。每只动物统计一个耳蜗[每种基因型统计3只动物（a–c）]，除了赫斯1^−/−;赫斯5^+/−(n个= 2). 每个耳蜗的突变型、杂合子和野生型的长度为1.6毫米，包括从基底向匝中延伸的部分。数据表示为平均值±SD，显著性使用Student的双尾，第页价值t吨测试。

^*第页<0.05和

F1-160层： 第页<0.005表示野生型的显著值。基底膜与IHC对的相对长度计算如下：IHC_突变体−国际卫生大会_重量/国际控股公司_重量。基底膜与第四排OHC的相对长度计算如下：OHC_突变体−OHC_重量/<trans data-src="1">1</trans><trans data-src="3">三</trans>职业健康保险_重量.NC，不计算；BM，基底膜；WT，野生型。

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图6。

囊和球囊中多余毛细胞的形成赫斯1-和赫斯5-缺陷小鼠。野生型P0囊状切片的肌球蛋白VIIa免疫标记(重量)控制(A类),赫斯1^−/−(B类),赫斯5^−/−(C类)、和赫斯1^+/−;赫斯5^+/−杂合小鼠(D类).E类,F类，毛细胞计数赫斯1^−/−,赫斯5^−/−和赫斯1^+/−;赫斯5^+/−小鼠球囊和胞囊。毛细胞密度表示为垂直于上皮表面切割的感觉上皮每100μm长度的平均数。数据表示为平均值±SD，显著性使用学生的t检验. *第页<0.0001表示野生型的显著值。比例尺：A–D，50微米。

删除赫斯1基因导致IHC数量显著增加

耳蜗的整体贴装表面处理赫斯1^−/−罗丹明-阴茎肽染色的小鼠显示出许多区域（基底膜相对长度的38%；表​表1）1)拥有一排几乎完整的额外IHC（图。​（图3三D–F型)与野生型相比（<1%基底膜；表​表1），1)只有一行IHC（图。​（图3三A–C). 此外，一些区域（5%的基底膜有第四排OHC；表​表1）1)第页，共页赫斯1^−/−突变体耳蜗呈现四排而非三排OHC（图。​（图3三D类,F类). 耳蜗抗肌球蛋白VIIa（一种毛细胞特异性标记物）的免疫染色横截面证实了多余毛细胞的存在（图。​（图3三E类)并通过扫描电子显微镜（图。​（图3三F类). 耳蜗毛细胞总数显著增加赫斯1^−/−小鼠与野生型的比较。这主要归因于国际控股公司数量的大幅增加(**第页<0.005），因为赫斯1^−/−耳蜗略高于野生型（表​（表1）。1). 这个赫斯1^−/−与最近的一项研究结果相比，本研究的小鼠在耳蜗毛细胞总数方面表现出严重的耳蜗表型(Zheng等人，2000年). 这可能是由于毛细胞计数的发育阶段不同或毛细胞计数覆盖的耳蜗长度不同所致。在本研究中，我们量化了从新生（P0）小鼠耳蜗中收集的毛细胞数量，无论是突变型还是野生型，沿着1.6 mm长的感觉上皮，即接近总长度的70%。

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图3。

野生型对照组P0耳蜗毛细胞发育的比较(A–C),赫斯1^−/−(D–F型),赫斯5^−/−(G–I型)、和赫斯1^−/−;赫斯5^+/−(J型)突变体和赫斯1^+/−;赫斯5^+/−杂合小鼠(K（K）). 缺乏赫斯1和赫斯5导致多余毛细胞的发育。A类,D类,G公司,J型,K（K）用罗丹明-阴茎倍体素染色的表面处理的共焦图像，以显示毛细胞富含肌动蛋白的静纤毛。B类,E类,H（H）经抗肌球蛋白VIIa抗体免疫染色的中极区Corti器官的交叉切片。C类,F类,我扫描电子显微镜观察中耳弯皮层器官表面。在对照耳蜗中，正常模式定义明确，有一行IHC和三行OHC。相比之下赫斯1^−/−耳蜗、两排IHC和三到四排OHC。在赫斯5^−/−耳蜗中通常有四排OHC，此外还有沿感觉上皮的分散区域，其中包含少量IHC对。J型,赫斯1^−/−;赫斯5^+/−耳蜗表现出与赫斯1^−/−，但对多余毛细胞数量的影响在赫斯1^−/−;赫斯5^+/−耳蜗（见表1）。K（K），从双杂合子小鼠耳蜗中制备耳蜗表面，指示具有额外OHC行和几对IHC的区域。括号标记OHC行，以及箭头指向IHC行。比例尺：A类,B类,D类,E类,G公司,H（H）,J型,K（K），20微米；C类,F类,我，10微米。

删除赫斯5基因导致OHC数量显著增加

来自的耳蜗赫斯5^−/−小鼠暴露出许多区域（基底膜相对长度的45%具有第四排OHC；表​表1）1)主要包含四行OHC，而不是三行（图。​（图3三G–I型，表​表1），1)，尽管在这些突变体中，IHCs的双重（基底膜的5%；表​表1）1)分布在单行IHC的区域内（图。​（图3三G公司,我). 此外，有时赫斯5^−/−小鼠在GER的感觉上皮外发现了一些多余的毛细胞（毛细胞计数中不包括此位置的多余毛细胞），如指骨样蛋白所定义的（图。​（图44A类)和肌球蛋白VIIa（图。​（图44B–D类)标签。与…对比赫斯1^−/−小鼠耳蜗毛细胞总数显著增加赫斯5^−/−小鼠被归因于OHC数量的显著增加(*第页<0.05）与野生型相比（图。​（图3三G-I公司，表​表11).

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图4。

耳蜗皮层器官和P0耳蜗GER中多余毛细胞的形成赫斯5-缺陷小鼠。A类，耳蜗表面处理用指骨苷染色，显示Corti器官中的成对IHC(箭头)除了一些额外分化的毛细胞外，GER中散布着未成熟的静纤毛(箭头).B类，经抗肌球蛋白VIIa免疫染色的Corti器官中极区的交叉切片。箭头表示科尔蒂器官外GER区域的两个分化的额外毛细胞。还要注意Corti器官中多余的毛细胞。C类，用肌球蛋白VIIa对耳蜗表面进行免疫染色，表明GER中存在分化的额外毛细胞(箭头).D类年GER中额外毛细胞的高度放大C类显示出它们的特征形状和基底细胞核。比例尺，20μm。

我们还检查了赫斯5^−/−因为，赫斯5单个突变体是可行的。我们观察到，多余的毛细胞存活到P10（我们检查的最新阶段），并形成了正常毛细胞的形态特征（数据未显示）。

Math1在耳蜗中的表达分析赫斯1-和赫斯5-缺陷小鼠

因为Math1已经显示(伯明翰等人，1999年)为了研究毛细胞的发生，我们用免疫组织化学方法检测了多余的毛细胞是否存在于赫斯1和赫斯5突变小鼠也表达Math1（图。​（图5）。5). 抗体抗Math1(赫尔姆斯和约翰逊，1998年)用于检测野生型中的Math1表达，赫斯1、和赫斯5变异耳蜗。在野生型中，Math1的表达仅限于E16的分化毛细胞（图。​（图55C类)和P0（图。​（图55A类,E类)但在支持细胞和感觉上皮外的细胞中不存在。有趣的是，在赫斯1^−/−（图。​（图55B类)和赫斯5^−/−（图。​（图55D）突变体耳蜗Math1的表达还包括感觉上皮内发育的多余毛细胞。E16感觉上皮中存在多余的毛细胞赫斯5^−/−（图。​（图55D类)和E16赫斯1^−/−小鼠（数据未显示）在能够区分这些细胞的最早发育时间点表明赫斯1和赫斯5基因可能在毛细胞决定的最初步骤&分化中发挥作用。此外，Math1表达在Corti器官外发育的额外毛细胞亚群中赫斯5^−/−耳蜗（图。​（图55F类). Math1在分化赫斯1^−/−和赫斯5^−/−突变的耳蜗与一项研究一致，该研究表明Math1对小鼠内耳毛细胞的生成是必要的(伯明翰等人，1999年). 此外，最近的一项功能获得性研究表明，出生后耳蜗培养物中Math1的过度表达导致GER中观察到额外的毛细胞(郑和高，2000).

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图5。

Math1蛋白在发育中的野生型耳蜗中的表达模式（对照）(A类,C类,E类),赫斯1-不足(B类)、和赫斯5-不足(D类,F类)老鼠。A类,B类、对照组P0耳蜗中弯横切面和赫斯1^−/−老鼠。在对照组中，单个内毛细胞(箭头)三个外毛细胞表达Math1。在赫斯1^−/−，Math1表达式还包括额外的IHC(箭头).C类,D类，对照组和赫斯5^−/−显示分化的额外毛细胞的小鼠(箭头). 注意，Math1在胃食管反流中一些细胞的顶端区域有弥漫表达赫斯5^−/−老鼠(箭头).E类,F类从P0对照组和赫斯5^−/−老鼠。在控制中，一行IHC和三行OHC表示数学1。在赫斯5^−/−，Math1的表达突出了Corti两个器官中正在分化的额外毛细胞(打开的箭头)和GER(箭头). 比例尺，20μm。

讨论

我们的实验证明赫斯1和赫斯5在调节哺乳动物内耳毛细胞分化方面具有独立和重叠的作用。在耳蜗里，赫斯1对国际控股公司的生产有重大影响，而赫斯5对OHC的产生有显著影响，尽管在某些耳蜗的GER中可以看到一些分化的额外毛细胞赫斯5^−/−老鼠。在前庭器官中，靶向缺失赫斯1或赫斯5导致胞囊和球囊感觉上皮中多余毛细胞的形成。

我们对孤立耳蜗感觉上皮的RT-PCR分析表明赫斯1,赫斯5、和数学1基因在发育期间表达，这对毛细胞的初始分化至关重要。我们的结果使用就地E18–P0小鼠耳蜗杂交显示赫斯1GER和LER区域的表达，但检测不到低水平的赫斯1E15耳蜗基底圈支持细胞表达。赫斯5在E18-P0耳蜗感觉上皮的LER和支持细胞中表达为主。此外，就地与发育中耳蜗的全套制剂杂交显示一条狭窄的赫斯5-在GER区域表达细胞（图。​（图22E类). 这些表达数据在一定程度上与赫斯1和赫斯5变异耳蜗。事实上，在胚胎发育过程中，IHC来源于位于GER最远端的祖细胞，而OHC来源于位于LER近端的祖细胞(Lim和Rueda，1992年).

有趣的是赫斯5也在GER内的窄带细胞中表达，如在一些赫斯5^−/−耳蜗中，除了正常行旁边出现的第四行OHC分化外，在该区域还观察到一些异位毛细胞。在前庭系统内赫斯1或赫斯5缺失诱导胞囊和球囊上皮中多余毛细胞的形成。这表明角色重叠赫斯1和赫斯5在内耳正常发育过程中防止多余的脐毛细胞和囊状毛细胞形成的基因。我们前庭系统的定量数据表明赫斯5只突变小鼠，额外毛细胞的形成虽然与野生型小鼠相比显著，但不如野生型小鼠重要赫斯1突变小鼠。这与大鼠心室上皮的表达研究相吻合(Zheng等人，2000年)证明这一点，不像赫斯1在整个感觉上皮的支持细胞中表达，赫斯5表达仅限于胞囊中央区的支持细胞。与前庭系统相反，赫斯1E18–P0小鼠耳蜗支持细胞中未检测到表达。这表明赫斯1可能对内耳神经上皮毛细胞分化的调节作用不同。

Math1在小鼠感觉上皮中的上调赫斯1和赫斯5突变耳蜗（图。​（图5）5)表明赫斯基因调节毛细胞分化，可能通过拮抗数学1这也可能发生在前庭系统内，因为已经表明赫斯1和赫斯5在发育中胞果的支持细胞层中表达(Zheng等人，2000年). 此外，数学1在前庭毛细胞中表达，也是其分化所必需的(伯明翰等人，1999年;Shailam等人，1999年).

这些结果与先前的研究一致，表明数学1被赫斯基因(Takebayashi等人，1994年;Akazawa等人，1995年)，尽管赫斯5作为Math1转录的阻遏物仍然是推测性的。年耳蜗毛细胞生成增加赫斯1^−/−;赫斯5^+/−和赫斯1^+/−;赫斯5^−/−突变小鼠与赫斯1和赫斯5单个突变小鼠表明赫斯1和赫斯5基因在一个共同的信号通路中运作，并可能在功能上相互补偿。最近的研究表明，Notch的激活导致随后的赫斯1和赫斯5基因(Jarriault等人，1995年,1998;Ohtsuka等人，1999年). Notch蛋白是配体激活的跨膜受体，在两种疾病的发展过程中参与细胞命运选择果蝇属和脊椎动物(Artavanis-Tsakonas等人，1999年).

来自几个实验室的研究报告称，Notch通路参与脊椎动物内耳的发育(Adam等人，1998年;Haddon等人，1998年;Lanford等人，1999年;莫里森等人，1999年;Eddison等人，2000年;Zhang等人，2000年;Zine等人，2000a). 在哺乳动物耳蜗中，靶向性缺失杰格德2编码一种Notch配体的基因导致了多余的毛细胞(Lanford等人，1999年). 此外，通过以下任一方式改变Notch信号槽口1或Jagged1型反义寡核苷酸导致发育中耳蜗器官型培养中毛细胞数量增加(Zine等人，2000a). 当槽口1和赫斯1/赫斯5功能改变表明Notch1和Hes型因子在耳蜗发育过程中作用于同一途径。

相比之下赫斯5在较小程度上赫斯1发育中的耳蜗与槽口1和Jagged1型就其空间分布而言。以前的研究表明槽口1及其配体Jagged1型在毛细胞分化前，在预期的耳蜗感觉上皮中表达(莫里森等人，1999年;Zine等人，2000a). 它们在分化的毛细胞中表达下调，在发育中耳蜗GER和LER的支持细胞和未分化细胞中持续表达。总之，这些结果可能支持赫斯1和赫斯5作为耳蜗中Notch1信号通路的下游介质，以及Notch1介导的侧向抑制参与毛细胞分化调控的模型。然而，两者的表型特征赫斯1和赫斯5无效突变耳蜗表明，这些Hes基因的功能并不局限于相邻细胞之间的侧向抑制机制。我们没有观察到Corti器官的区域仅显示毛细胞，而没有插入支持细胞赫斯1^−/−和赫斯5^−/−老鼠，如果赫斯1和赫斯5基因只以侧向抑制的方式运作。根据早期的表达赫斯1胚胎小鼠耳蜗E14（图。​（图1），1)结合其在GER和LER细胞中的广泛表达（图。​（图2），2),赫斯1也可能作为一个准备基因，用于区分感觉上皮和非感觉上皮祖细胞域，决定-分化线索是针对这些域的。与…对比Hes1、Hes5除GER和LER外，支持细胞中也有表达，包括E18耳蜗感觉上皮内的Deiter细胞和柱状细胞（图。​（图22D类). 这种空间分布赫斯5与分化的OHC密切相关的细胞类型可能支持赫斯5在Notch介导的侧抑制中，因为Deiter细胞和柱细胞在成熟的这个阶段也表达Notch1受体(Zine等人，2000a).

这种系统在某种程度上与果蝇属同源基因多毛的和[E类(标准普尔)]与脊椎动物机械感觉毛细胞的基本特征相似的机械感觉鬃毛的生成复杂(Chan和Yan，1999年). 在果蝇属，的多毛的基因作为预编码基因参与神经前簇定位[E类(spl）]基因在前神经簇内抑制局部神经元命运的后期发挥作用。后一种功能依赖于基因的Notch激活[E类(标准普尔)]复杂。在这两种情况下多毛的和[E类(标准普尔)]复杂基因通过抑制bHLH公司基因，如无调性（a果蝇属Math1）和阿切特-斯库特复杂(Jennings等人，1994年;Fisher和Caudy，1998年). 因此，赫斯1和赫斯5在发育中的哺乳动物内耳中可能具有Notch依赖性和/或Notch非依赖性活性果蝇属并提出Notch–Hes–Math1通路的功能在进化上保守的假设。

我们的研究结果表明赫斯1和赫斯5活性对于抑制祖细胞对IHC和OHC命运的承诺很重要，可能通过拮抗Math1。这种负调控对于产生正确数量的毛细胞以及建立单行IHC和三行OHC的正常耳蜗镶嵌至关重要。在前庭系统中，赫斯1和赫斯5也作为胞囊和球囊上皮内毛细胞分化的负调控因子。

全面了解Notch–Hes–Math1通路在哺乳动物内耳毛细胞命运中的作用，可能有助于制定解决听觉毛细胞丢失问题的策略。可能同时下调赫斯1和赫斯5耳蜗中的毛细胞可能被用来刺激缺失的听觉毛细胞的替换。这些研究可能具有重要的治疗价值，因为疾病、创伤和衰老导致的听觉毛细胞丧失是听力丧失和/或耳聋的常见原因。

脚注

参考文献