离子通道TRPV4的热激发激活

摘要

检测环境和体温变化的能力对哺乳动物的生存至关重要。在外周神经系统中，皮肤的加热和冷却是由温度敏感神经元检测出来的，这些神经元被调节以在不同的温度范围内作出反应。例如，温热感受器检测到适度的皮肤温度升高（34–42°C），而热伤害感受器检测出极热的温度（>42°C(Raja等人，1999年). 中枢神经系统还包含温度敏感神经元，最显著的是在视前/下丘脑前部，这些神经元被局部升温或降温特别激活，同时接收来自外周的热相关输入(Boulant，2000年). 虽然对温度感觉的分子基础仍知之甚少，但已经确定了几种离子通道，它们在不同的外周感觉神经元亚群中表达，并可被环境温度的变化激活。其中包括瞬时受体电位（TRP）家族成员，包括TRPV1（VR1）(Caterina等人，1997年)和TRPV2（VRL-1）(Caterina等人，1999年)，分别被>40和>50°C的温度以及远相关蛋白TRPM8（CMR1）激活(McKemy等人，2002年;Peier等人，2002年)，由低温（<25°C）激活。这些发现增加了在其他TRP家族成员中观察到热刺激转导的可能性。

TRPV4（OTRPC4/VR-OAC/VRL-2/TRP 12）是一种非选择性阳离子通道，与TRPV1具有约40%的氨基酸同源性(Liedtke等人，2000年;Strotmann等人，2000年;Wissenbach等人，2000年;Delany等人，2001年). TRPV4蛋白在肾远曲小管、气管和粘膜下腺的上皮细胞、中性粒细胞和自主神经纤维中表达(Delany等人，2001年).现场杂交研究还揭示了TRPV4 mRNA在内耳毛细胞、外周感觉神经节和渗透调节相关脑结构中的表达，包括终板的血管器官和下丘脑中央视前区（MnPO）(Liedtke等人，2000年;舒马赫等人，2000年). 与这种定位模式一致，低渗溶液可以激活异源表达的TRPV4，这表明它可以作为渗透压和/或机械拉伸的传感器(Liedtke等人，2000年;Strotmann等人，2000年;Wissenbach等人，2000年;Delany等人，2001年). 最近，研究表明TRPV4也可以被某些佛波醇衍生物激活(Watanabe等人，2002年). 虽然先前的一项研究表明，环境温度可以影响TRPV4对低极化的响应程度(Liedtke等人，2000年)，有几项研究未能检测到环境温度的急剧变化对TRPV4的激活(Liedtke等人，2000年;Strotmann等人，2000年;Delany等人，2001年). 在这里，我们通过使用两个不同的表达系统证明TRPV4被温暖的温度激活，并且这种反应受渗透压的影响。此外，我们通过免疫组织化学证实TRPV4蛋白在视前/下丘脑前部表达。总之，这些数据表明TRPV4在温度传感和/或温度调节中可能发挥作用。

材料和方法

分子生物学。寡核苷酸杂交探针[5′-taagtacccgtgtcttc-3′，大鼠香草酸受体相关渗透激活通道（VR-OAC）编码区的核苷酸（nt）2160–2178](Liedtke等人，2000年)用于从pCDNA3（Invitrogen，Carlsbad，CA）中的大鼠背根神经节cDNA文库中分离出部分TRPV4 cDNA。将从大鼠肾脏获得的283 bp 5′-RACE片段连接到该部分克隆，得到一个全长cDNA，其开放阅读框为2612 bp，与大鼠VR-OAC的相同。pCDNA3中的TRPV1 cDNA已在前面描述过(Caterina等人，1999年).果蝇属TRPL公司(Xu等人，1997年)和人类TRPC3(Wes等人，1995年)pCDNA3中的cDNA是C.Montell（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学）的礼物。TRPV1和TRPV4 cDNA也在5′-和3′-非翻译区之间亚克隆爪蟾pXβG中的β-珠蛋白（约翰·霍普金斯大学P.Agre赠送）。除非另有说明，否则分子生物学和细胞培养试剂均来自Invitrogen，化学品来自Sigma（密苏里州圣路易斯）或Fisher（宾夕法尼亚州匹兹堡）。

卵母细胞表达系统和电生理学。转录pCDNA3或pXβG中的TRPV1和TRPV4 cDNA在体外线性化后使用T7或T3 RNA聚合酶（威斯康星州麦迪逊Epicenter Technologies）Xba公司一、第五阶段非洲爪蟾（Nasco，Modesto，CA）用胶原酶（新泽西州莱克伍德沃辛顿）去除卵母细胞，第二天在50 nl水中注射1–50 ng TRPV1或TRPV4 cRNA。卵母细胞接受双电极电压钳(E类_小时=−40 mV），通过TEV-200A放大器（达根，明尼阿波利斯，明尼苏达州）、PowerLab a/D转换器（AD Instruments，加利福尼亚州山景城）和3米KCl填充电极，电阻为0.4–2 MΩ。正常（210 mOsm）镀液成分（单位：m米)为96氯化钠、2氯化钾、1氯化镁₂，0.1氯化钙₂和5个HEPES，用NaOH调节至pH 7.4。在高渗（410 mOsm）浴溶液中补充200 m米甘露醇。灌注速率为1 ml/min。通过使用Peltier控制器（Dagan）预热灌注液，在15秒内从27°C加热至45°C，并在卵母细胞2 mm范围内使用热敏电阻（Physitemp，Clifton，NJ）进行监测。所有涉及动物护理和使用的程序均按照机构指南执行。

哺乳动物细胞培养和钙成像。人胚胎肾（HEK）293/保存在DMEM中的T抗原细胞/10%胎牛血清/青霉素/链霉素/我-用Lipofectamine 2000瞬时转染谷氨酰胺，每35 mm培养皿转染2μg质粒DNA（包括pCDNA3中125 ng/孔绿色荧光蛋白（GFP）cDNA）。24小时后将细胞重新放置在聚鸟氨酸涂层玻璃盖玻片上，24小时后进行钙显像。通过选择缺乏T抗原的转染HEK 293细胞（约翰·霍普金斯大学J.Nathans赠送）和500μg/ml G418，产生稳定的转化子TRPV1、TRPV4和pcDNA3细胞系。通过免疫荧光法筛选TRPV1或TRPV4表面表达的耐药克隆。所含正常（290 mOsm）镀液（单位：m米)130氯化钠、3氯化钾、2.5氯化钙₂，0.6氯化镁₂，10 HEPES，1.2 NaHCO_三和10葡萄糖，用NaOH调节至pH 7.45。对于图中所示的实验​图5，5，用甘露醇将此溶液调节至300 mOsm。通过添加额外的100 m来制备400 mOsm溶液米甘露醇。对于250 mOsm溶液，NaCl减少至105 m米.通过向250 mOsm溶液中添加甘露醇来制备300 mOsm-低钠溶液（300/M）。用蒸汽压渗压计（Wescor、Logan、UT）测量渗透压。对于无钙溶液，CaCl₂被替换为10米米EGTA。用fura-2 AM（10μ米; 37°C 40分钟），在含有0.02%胸膜酸的正常浴液中（分子探针，尤金，俄勒冈州）。利用倒置荧光显微镜（尼康，梅尔维尔，纽约州）、激发滤波器变换器（萨特，诺瓦托，加利福尼亚州）和冷却CCD相机（罗珀，图森，亚利桑那州）进行比例钙成像。使用RatioTool软件（ISee Imaging，北卡罗来纳州罗利市）每2秒采集一次配对图像（340和380 nm激发，510 nm发射）。根据绿色荧光蛋白的表达鉴定瞬时转染细胞。对卵母细胞记录进行加热，并用放置在显微镜视野2 mm内的热敏电阻进行监测。在25–45秒内达到目标温度。Fura比率是从每个盖玻片的30到50个细胞中计算出来的，并且使用多个独立盖玻片中的平均比率来计算样品的平均值±SEM。除非另有说明，否则使用成对或不成对的Student’st吨测验。

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图5。

TRPV4介导的热诱发反应受渗透压调节。A类，第二个的代表性电流轨迹(我)，第四(二)、和第六(三)表达TRPV4的卵母细胞对连续热刺激的反应（45°C；水平开口钢筋). 高渗浴溶液（410 mOsm；水平的填充钢筋)第三次热刺激前1min，第四次热刺激后清洗卵母细胞2min。插入，410 mOsm处理的热诱发反应II和III相对于反应I的振幅(开放式列)和未经治疗(填充柱)表达TRPV4-和TRPV1-的卵母细胞。数据表示四个卵母细胞的平均±SEM。B类，代表性热诱发（40°C，水平填充钢筋)稳定表达TRPV4的HEK 293细胞的钙内流反应。显示了镀液渗透压。300 mOsm低钠（300/米)和250 mOsm溶液含有同等的NaCl浓度，仅因甘露醇的存在或不存在而不同。在底部实验始于300年的两条轨迹/米并在箭头.C类，用控制载体稳定转化的细胞在指定渗透压下的热诱发钙反应总结(P（P）;开放式列;n个=3–4）或TRPV4(V4版本;填充柱;n个= 5–9). 数据表示所示数量的盖玻片的平均值±SEM。中的比较A类和C类具有适当的300 mOsm或300/米控件*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001 (NS公司，不显著；未成对的t吨测试）。

膜片钳电生理学。如前所述，在稳定的转化子TRPV1、TRPV4和pCDNA3细胞系上进行全细胞斑贴记录(Caterina等人，1997年). 所含标准镀液（单位：m米)140氯化钠、5氯化钾、2氯化镁₂，2氯化钙₂，10 HEPES和10葡萄糖，pH 7.4（用NaOH调节）。所含移液管溶液（单位：m米)140 KCl、5 EGTA和10 HEPES，pH 7.4（用KOH调节）。在检查热诱发电流响应时，我们用预热溶液以约0.2°C/sec的速率提高浴温。当热激活电流开始失活时，灌流液变为22°C溶液。将热电偶放置在贴片电池4 mm范围内，在±0.1°C范围内监测室温度。保持电位为−60 mV。对于电流-电压分析，施加电压-放大器脉冲（−100至+100 mV）超过700毫秒。从40°C（TRPV4，pCDNA3）或45°C（TRAPV1）下的电流响应中减去加热前获得的电流响应。

抗体生成和免疫组织化学。用对应于TRPV4 C末端的肽（CDGHQQGYAPKWRAEDAPL）与血蓝蛋白偶联（Strategic Biosolutions，纽瓦克，DE）免疫兔子。通过肽色谱法（Ultralink、Pierce、Rockford、IL）从血清中纯化TRPV4抗体。通过检测TPV4转染的HEK 293细胞提取物的免疫印迹中的离散蛋白带，而不是转染pCDNA3、TRPV1或TRPV2的细胞提取物，可以确认抗体的反应性和特异性。成年雄性Sprague-Dawley大鼠用氯胺酮（100 mg/kg，i.p.）和木聚嗪（10 mg/kg，i.p.）麻醉，用PBS灌流，然后用4%冰镇甲醛/PBS灌流。组织固定过夜，冷冻保护（在30%蔗糖/PBS中48小时），包埋在OCT中（加利福尼亚州雷丁市特德·佩拉），并在16-30μm处冷冻切片。如前所述进行免疫染色(Caterina等人，1999年)使用亲和纯化的抗TRPV4或抗TRPV1（1μg/ml），然后使用生物素化的山羊抗兔IgG和镍增强的二氨基联苯胺检测（Vector，Burlingame，CA）或Cy3-结合的山羊抗家兔IgG（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）。抗体与TRPV4肽结合树脂孵育后的信号消融证实了染色的特异性，但与VR1肽结合树脂不孵育。

结果

TRPV4介导热诱发电流爪蟾卵母细胞

为了评估TRPV4作为一种可能的热传感器，我们在爪蟾卵母细胞表达系统。在2–7天内，注射编码TRPV4的互补RNA（cRNA）的卵母细胞在15秒内被加热到45°C（−1023±103 nA，−40 mV；n个=48）（图。​（图11B类). 水注入对照卵母细胞中观察到最小的热诱发电流（−33±10nA；n个= 28;第页<0.0001）（图。​（图11A类). 通过优化TRPV4表达条件，在90个TRPV4注射卵母细胞中的87个中观察到热诱发反应。这些电流可以在同一个卵母细胞中重复产生，在连续六次激发后振幅仅下降17±10%（图。​（图11C类,插入). 与低张刺激诱发的TRPV4反应一样(Strotmann等人，2000年)，钌红（100n米)在灌流液中，第三次和第四次加热时显著抑制热诱发电流（减少87±2%；n个= 4;第页<0.001）（图。​（图11C类,插入)，并且这些反应在10分钟冲洗后仅部分恢复。既不去除细胞外钙离子，也不添加4,4′-二异硫氰基苯乙烯-2,2′-二磺酸（DIDS；500μ米)降低了热诱发的TRPV4反应的幅度（数据未显示），表明钙激活的氯化物通量对电流的污染最小。如前所述(Caterina等人，1999年)，微注射编码TRPV1的cRNA的卵母细胞在高温下也表现出强大的内向电流，初始热诱发反应出现在略高于随后反应（36-38°C）的温度（40-42°C）（图。​（图11D类). 相比之下，表达TRPV4的卵母细胞中的典型热诱发电流通常在高于～27°C的温度升高时可检测到，并且总是在低于激活TRPV1所需的温度时开始。表达TRPV4的卵母细胞的温度反应曲线也比表达TRPV1的细胞浅。超过42°C的持续加热通常会导致TRPV4热诱发电流响应的振幅下降，即使温度继续升高（图。​（图11B–D类). 然而，尽管存在这种脱敏现象，36至42°C之间的温度波动也相应地诱发了波动的电流响应（图。​（图11E类)，如前所述TRPV1(Tominaga等人，1998年). 这些结果表明，TRPV4在生理范围内对温度变化作出动态响应。

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图1。

TRPV4介导热诱发电流爪蟾卵母细胞。A–C，双电极电压灯记录。所示为代表性秒(我)，第四(二)、和第六(三)热诱发电流对连续热斜坡的响应（在15秒内从27°C到45°C，在底部)用于注射水的对照卵母细胞(A类)和卵母细胞注射TRPV4 cRNA(B、 C类). 在C类，钌红(水平钢筋，100牛顿米)在第三次加热前30秒添加，并在第五次加热前冲洗10分钟。插入，响应II和III相对于响应I的振幅(开放式列)或不带(填充柱)钌红处理。数据表示平均值±SEM；n个= 4 (*第页< 0.01; ***第页< 0.001; 未成对的t吨测试）。D类，初始热刺激引起的代表性温度响应曲线(顶部)和第二次热刺激(底部)在表达TRPV4的卵母细胞中(V4版本)或TRPV1(第1版). 热刺激斜坡在15秒内从22°C上升到45°C。电流标准化为45°C时的振幅。E类，阈上温度波动的影响(底部)关于代表性TRPV4介导的电流反应(顶部).

TRPV4介导HEK 293细胞热诱发钙内流

接下来，我们检测了在巨细胞病毒启动子控制下瞬时转染TRPV4 cDNA的HEK 293细胞的热诱发反应。TRPV4在这些哺乳动物细胞中的表达从其升高的基底[Ca²⁺]_我（图。​（图22A、 B类)并经免疫荧光显微镜证实（数据未显示）。如前所述(Liedtke等人，2000年;Strotmann等人，2000年)，表达TRPV4的细胞在[Ca²⁺]_我暴露于低渗培养基（250 mOsm）后，而在表达控制载体pCDNA3的细胞中没有观察到这种反应（图。​（图22A类). 在对热刺激（25–40°C，约40秒）的反应中，对照细胞仅表现出轻微的[Ca升高²⁺]_我（0.079±0.018 fura比值单位，RU；n个=5）（图。​（图22B、 C类). 相比之下，转染TRPV4的细胞表现出明显更大的上升（0.251±0.033 RU；n个= 12;第页<0.001）。在转染TRPV1的细胞中观察到类似振幅的热诱发反应（0.341±0.08 RU；n个=3），但在转染了两种远相关通道蛋白中的任何一种的细胞中，果蝇属TRPL（0.059±0.004 RU；n个=3）或人类TRPC3（0.07±0.02 RU；n个=4）（图。​（图22D类). 尽管事实表明，这两种通道在哺乳动物细胞系中都表现出构成活性(Xu等人，1997年;Zitt等人，1997年)与TRPV4转染细胞一样，TRPL转染细胞在[Ca²⁺]_我（未显示数据）。

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图2。

TRPV4介导HEK 293细胞中热诱发的钙内流。A类，相对[Ca²⁺]_我在渗透压从290降至250mOsm后，用TRPV4或对照载体（每个四个）瞬时转染的HEK 293细胞中的fura-2发射（由340/380nm激发下的fura-2发射的比率表示）(水平钢筋)24°C时。B、 C类，相对[Ca²⁺]_我瞬时在HEK 293细胞中(B类)或稳定(C类)转染TRPV4或控制载体（每个四个），在24至40°C的热刺激期间，在～40秒内。D类，瞬时转染控制载体的细胞中热诱发（40°C）fura比率增加的比较(P（P）;n个=5），TRPV4(V4版本;n个=12），TRPV1(第1版;n个= 3),果蝇属TRPL公司(数据传输;n个=3），或人类TRPC3(小时;n个=4）或在使用控制向量生成的稳定转化子之间(P（P）;n个=8），TRPV4(V4版本;n个=15）或TRPV1(第1版;n个= 13). 数据表示所示数量的盖玻片的平均值±SEM。与控件进行比较*第页< 0.05; ***第页< 0.001;NS公司，不显著；未成对的t吨测试。

为了排除TRPV4表达细胞中观察到的热诱发反应是瞬时转染方法的伪影的可能性，我们生成了一个稳定的表达该蛋白的HEK 293细胞系。稳定的TRPV4转化子具有基线[Ca²⁺]_我与对照细胞相似，但表现出平均热诱发[Ca²⁺]_我该增加是瞬时转染TRPV4细胞中观察到的增加量的3.4倍（图。​（图22C类)与稳定的TRPV1转化子表现出的结果相当。对其他刺激的类似反应(Liedtke等人，2000年;Strotmann等人，2000年;Watanabe等人，2002年)，热诱发[Ca²⁺]_我钌红（200 n）可可逆地抑制TRPV4介导的增加米; 减少75±5%；n个= 3;第页与对照组相比<0.05）或从细胞外培养基中去除钙（减少90±3%；n个=3；第页<0.01 vs对照）（图。​（图3三A类). 相反，用thapsigargin（10μ米)和1-[β-（3-[4-甲氧基苯基]丙氧基）-4-甲氧基乙基]-1H-咪唑盐酸盐（20μ米)未能降低热诱发钙反应的振幅（数据未显示）。总之，这些发现表明，观察到的[Ca²⁺]_我结果主要来自通过TRPV4的热诱发钙内流激活，而细胞内储存的钙释放似乎对这种反应没有显著贡献。

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图3。

表达TRPV4的HEK 293细胞热诱发钙反应的特征A类，可逆抑制热诱发（升温至40°C；水平填充钢筋)钌红稳定表达TRPV4细胞内钙内流(右后; 200牛顿米;水平开口钢筋,顶部)或通过清除细胞外钙(水平开口钢筋,底部). 显示于正确的是钌红期间热诱发反应的相对振幅(阴影条;n个=3）或无钙(开放式酒吧;n个=3）激发（反应II/反应I）或返回正常浴液后（反应III/反应I）。控制(实心钢筋;n个=4）表示正常浴溶液中的三个连续响应。B类，载体稳定转化细胞热诱发钙反应的温度响应曲线(填充的正方形;n个=3–4），TRPV4(实心圆圈;n个=4–11），或TRPV1(开放的圆圈;n个= 4–12). 数据表示指示数量的独立微观场的平均值±SEM。C类，稳定TRPV4转化子中的发热钙反应(V4版本)或病媒控制细胞（病媒；P（P）)驯化（15分钟）至37°C后。左侧，每种类型四个细胞的代表性痕迹。赖特，呋喃比率的平均值±SEM增加(n个= 4). 数据表示所示数量的盖玻片的平均值±SEM。与对照组进行比较(A、 C类)或TRPV4和TRPV1之间(B类). *第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; 未配对的t吨测试。

与卵母细胞的结果一致，在HEK 293细胞中表达的TRPV4比TRPV1对热更敏感（图。​（图3三B类). 虽然在低至34°C的温度下可以观察到TRPV4介导的钙反应，但TRPV1介导的反应只有在温度升高2-4°C时才开始明显，在40°C以下反应相对温和。TRPV4热反应性的另外两个特征反映了在卵母细胞系统中观察到的特征。首先，TRPV4显示的温度响应曲线比TRPV1显示的曲线浅。其次，当环境温度从25℃升高到37℃并保持15 min时，产生的TRPV4介导的钙反应缓慢下降至基线（数据未显示）。然而，随着随后升高到42°C，观察到第二次钙反应，其再次显著大于pCDNA3转化的对照细胞中观察到的钙反应（图。​（图3三C类).

TRPV4介导HEK 293细胞热诱发电流

通过对稳定表达该蛋白的HEK 293细胞的全细胞电压灯研究，进一步证明了TRPV4的热诱发激活。当电池保持在−60 mV时，槽温从25°C升高到45°C超过80秒会产生内向电流（−238±80 pA；n个=5）显著大于pCDNA3转化子中观察到的任何一个（17.8±26 pA；n个= 5;第页<0.05）（图。​（图44A类). 温度响应曲线显示TRPV4激活的阈值温度（33.6±1.8°C；n个=5）类似于钙成像实验中获得的结果（图。​（图44B类). 虽然热诱发TRPV4反应的初始部分表现出强烈的温度依赖性(问₁₀= 9.9 ± 3.8;n个=5），响应在高于阈值几度的温度下脱敏。在阈上温度下进行的电流-电压分析显示，TRPV4介导的电流在0 mV附近存在反转电位（图。​（图44C类)，与非选择性阳离子电流一致。尽管如低渗诱发的TRPV4反应所报告的那样，所得到的轮廓是向外矫正的(Liedtke等人，2000年;Strotmann等人，2000年)校正程度明显低于TRPV1介导的热诱发电流（±100 mV:TRPV4的校正比为2.08±0.44；TRPV1为18.00±6.31；n个= 4).

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图4。

TRPV4介导HEK 293细胞中的热诱发电流。A类，HEK 293细胞的代表性全细胞电流迹线（−60 mV），在指示的温度斜坡期间用TRPV4或控制矢量稳定转化底部.B类，代表性温度响应曲线，来源于用TRPV4、TRPV1或控制载体稳定转化的细胞。C类，TRPV4转化细胞热诱发反应的代表性电流-电压关系(b条)，TRPV1(c（c）)，或控制矢量(一). 在每种类型的四个细胞中观察到类似的模式。

TRPV4在下丘脑的热敏区表达

为了确定TRPV4协同检测渗透压和温度可能具有生理相关性的解剖结构，我们在大鼠组织中进行了TRPV4免疫定位。在许多显示出特异性TRPV4免疫反应的大脑区域中，下丘脑视前区/前部，最显著的是内侧视前区（MPA）（图。​（图66A类)和MnPO（图。​（图66B类). 虽然我们通过Northern blot和RT-PCR检测到背根和三叉神经节中的TRPV4 mRNA，但我们在这些神经节的细胞体中没有观察到特异性TRPV4免疫反应（数据未显示）。然而，我们确实观察到足底皮肤基底层上角质形成细胞内强烈的TRPV4免疫反应（图。​（图66C、 D类).

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图6。

下丘脑前部和皮肤角质形成细胞中TRPV4的免疫组织学检测。A–DMPA的TRPV4特异性二氨基联苯胺免疫染色(A、 B类)和MnPO(C、 天)大鼠下丘脑区域。在B类和D类，用抗原TRPV4肽预先完成抗TRPV4。自动控制，前连合；3伏，第三脑室。E、 F类大鼠足底皮肤角质形成细胞的TRPV4免疫荧光(箭头)和汗腺(箭头). 在F类，用抗原TRPV4肽预先完成抗TRPV4。

讨论

我们发现异源表达的TRPV4介导热激活电流流入爪蟾卵母细胞和HEK 293细胞。在卵母细胞中，TRPV4的激活在>27°C的温度下变得明显，而在HEK 293细胞中，激活阈值为-34°C。因此，在这两个系统中，TRPV4可以通过适度升高（即温暖）的温度激活，该温度低于激活TRPV1所需的温度。长时间的阈上热刺激导致TRPV4介导的脱敏反应，这是之前报道的TRPV1现象(Caterina等人，1999年). 然而，具有潜在生理重要性的是，我们观察到，一旦表达TRPV4的HEK 293细胞在37°C下驯化，TRPV4仍然能够调节对环境温度进一步升高的反应。

尚不清楚为什么其他几个研究人员未能观察到TRPV4的热诱发激活(Liedtke等人，2000年;Strotmann等人，2000年;Delany等人，2001年). 一种可能的解释来自我们的观察，即在瞬时表达TRPV4的HEK 293细胞中，很大一部分TRPV4免疫反应位于明显的细胞内隔间，而在稳定的TRPV4转化子中，几乎所有TRPV4都明显与质膜相关（数据未显示）。瞬时转染细胞中TRPV4的不完全表面表达与较稳定转化体中观察到的较小的平均热诱发钙反应有关。此外，热刺激在控制载体转染细胞中产生“背景”钙增加，在45°C以上变得相对较大。由于低氧血症不会产生这样的背景，在那些对瞬时转染细胞中的热诱发反应进行评估的研究中，小的热诱发响应可能与低氧血症诱发反应不成比例地被掩盖了(Strotmann等人，2000年;Delany等人，2001年). 其他可能影响热诱发反应检测的因素包括GFP标记结构的使用(Strotmann等人，2000年)或在不频繁采样的缓慢温度斜坡期间热诱发反应的脱敏(Liedtke等人，2000年). 最后，TRPV4热诱发激活所需的辅因子可能在宿主细胞中有差异表达。

对离体膜贴片中TRPV1的单通道分析表明，热对该通道的开放概率有直接影响(Tominaga等人，1998年). 在缺乏对TRPV4的类似分析的情况下，我们还不能排除这种蛋白质被其他热刺激蛋白、热反应释放的小分子或热对质膜的物理化学效应间接激活的可能性。事实上，先前已经提出了培养的感觉神经元中某些热诱发反应的间接机制(Reichling和Levine，1997年).

我们的研究结果也支持TRPV4热信息和渗透信息的功能整合。在相对较低的渗透压下，热激发TRPV4反应较大，在高渗透压下几乎被烧蚀。先前的研究表明，相反的关系，即TRPV4的低极化响应与温度有关，在37°C时的响应比在22°C时更大(Liedtke等人，2000年). 这两个发现可能反映了相同的刺激趋同过程。然而，我们观察到，在低极化诱发反应脱敏后可以诱发全尺寸的热诱发反应，这表明TRPV4激活的这两种机制之间存在一定程度的独立性。TRPV1也观察到类似的情况，在这种情况下，质子、热和辣椒素诱发的反应在机械上是可以区分的，尽管它们相互作用(Jordt等人，2000年;Jordt和Julius，2002年). 与热一样，低氧极化激活TRPV4的机制尚不清楚。特别是，目前还不完全清楚TRPV4是否感觉到低渗透压本身、由此产生的细胞肿胀或响应肿胀释放的信号分子。无论如何，这些发现和最近证实的佛波醇衍生物激活TRPV4(Watanabe等人，2002年)这表明这种蛋白，像TRPV1一样，可以通过一系列部分收敛的物理和化学刺激进行调节。

在什么生理情况下，TRPV4的热激活可能是相关的？TRPV4蛋白在下丘脑前部MPA和MnPO区域的表达，以及其温度反应特征，表明它可能在这种情况下充当热传导器。对下丘脑前部器官型薄片的电生理学研究为热敏神经元中存在热激活的非选择性阳离子通道提供了证据，尽管该通道的分子特性尚不清楚(Hori等人，1999年). 这些研究还揭示了单个下丘脑前部神经元水平的热感觉和渗透感觉之间的复杂关系。虽然许多热敏神经元被局部高渗压抑制或被低渗压激活，但其他神经元则表现出相反的关系(Silva和Boulant，1984年;特拉维斯和约翰逊，1993年). 鉴于TRPV4对热刺激和渗透刺激的双重反应性，TRPV4可能会介导其中一些复合效应。与报告结果一致(Liedtke等人，2000年;舒马赫等人，2000年;Delany等人，2001年)，我们在外周感觉神经节中检测到TRPV4 mRNA，但在这些神经节的神经元胞体中未观察到TRPV 4免疫反应。因此，尚不清楚该蛋白在初级传入神经元中的表达程度，或是否有助于外周热传导。我们确实在皮肤角质形成细胞中观察到特异性TRPV4免疫反应。这些电池在热传感中没有直接作用。然而，它们与动物周围环境以及向中枢神经系统传递热和机械信息的神经的接近性使得这一观察非常有趣，特别是考虑到TRPV1也在角质形成细胞中表达的报道(Inoue等人，2002年). 鉴于这些发现，未来的研究应旨在使用天然制剂评估TRPV4热敏性、渗透敏感性以及在神经元和非神经元细胞中的表达的功能意义。此外，TRPV4的多模响应性创造了一个机会，可以利用结构-功能方法来探索热感觉和渗透调节的生物物理基础。这些研究可能揭示为什么对其中一种或两种模式的反应性是TRPV亚家族越来越常见的特征。

脚注

参考文献