神经元活性调节星形胶质细胞自发钙瞬变的相关网络特性现场

摘要

自发的神经元活动是发育中大脑的一个重要特性。它对神经元迁移、轴突和树突生长以及神经连接和突触的形成和完善至关重要(Katz和Shatz，1996年;Komuro和Rakic，1998年;Feller，1999年;斯皮策等人，2000年;Stellwagen和Shatz，2002年). 细胞内钙的变化和振荡²⁺浓度（[Ca²⁺]_我)是自发活动控制神经发育的主要机制(Berridge，1998年). 这种活动的另一个特点是协同活动神经元出现同步模式，通过协调大量细胞中的神经活动和基因表达来放大神经发育中的活动功能(Yuste等人，1992年;Buonanno和Fields，1999年;Feller，1999年;O'Donnovan，1999年;Wong，1999年;Ben-Ari，2001年).

直到最近，神经元被认为是唯一参与自发和诱发神经传递以及大脑兴奋性的突触控制的可兴奋细胞。然而，培养和就地星形胶质细胞通过增加[Ca²⁺]_我(Verkhratsky等人，1998年). 例如，神经元刺激触发谷氨酸和GABA介导的[Ca²⁺]_我脑切片中星形胶质细胞的增加(Dani等人，1992年;波特和麦卡锡，1996年;Pasti等人，1997年;Kang等人，1998年); 相反，星形胶质细胞[Ca²⁺]_我增加通过神经胶质释放的谷氨酸调节神经元中的EPSCs和IPSC(Pasti等人，1997年,2001;Araque等人，1998年a,b条;Bezzi等人，1998年;帕普拉和海登，2000年). 因此，星形胶质细胞和神经元之间可能存在交互信号，从而动态调节神经兴奋性(库珀，1995年;Vesce等人，1999年;卡米尼奥托，2000年;Araque等人，2001年;Bezzi和Volterra，2001年;海登，2001).

皮质星形胶质细胞在体外显示自发[Ca²⁺]_我振荡(Fatatis和Rusell，1992年;查尔斯，1994年;Harris-White等人，1998年). 最近，有研究表明，脑片中的星形胶质细胞也表现出自发的[Ca²⁺]_我振荡就地(Parri等人，2001年;Nett等人，2002年). 此外，丘脑中自发的星形胶质细胞振荡通过NMDA谷氨酸受体触发神经元兴奋(Parri等人，2001年). 通过对转基因小鼠中大量星形胶质细胞进行成像，以识别这些胶质细胞，我们发现自发的[Ca²⁺]_我瞬变是所有被检测脑区静止星形胶质细胞的共同特征，但在反应性星形胶质细胞中消失。大多数自发活动的星形胶质细胞是同步的，形成了多达数十个星形胶质细胞的复杂相关网络，而这些星形胶质细胞又与自发神经元网络同步。最重要的是，用河豚毒素（TTX）阻断动作电位或用GABA调节神经元活动_A类以及离子型谷氨酸受体拮抗剂，我们发现自发的神经元活动控制着星形胶质细胞网络活动的性质和复杂性。

材料和方法

动物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）/绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠(Zhuo等人，1997年)从Jackson Laboratories（ME巴尔港）购买。将GFAP/GFP菌落置于受控温度（22±2°C）、湿度（40–60%）和光照（12小时循环）下，并按照欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）进行处理。刺伤损伤如前所述(马修森和贝里，1985年). 简言之，出生后第22天（P）22只GFAP/GFP小鼠用氯胺酮-甲苯噻嗪注射液麻醉（分别为150和6μg/g）,他们的头被固定在立体定向框架上。然后用手术刀沿矢状方向刺伤大脑皮层。伤口深1mm，长3mm，距离右侧顶叶皮质中线2mm。2天后使用受损小鼠。反应性星形胶质细胞被增加的GFP荧光信号和它们典型的肥大形态所识别(Latov等人，1979年;马修森和贝里，1985年;Salhia等人，2000年;Nolte等人，2001年).

材料.Fura-2 AM和pluronic acid购自Molecular Probes（尤金，俄勒冈州）。（±）-2-氨基-5-磷酸戊酸（APV），6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮（CNQX），（+）-α-甲基-4-羧基苯基甘氨酸（MCPG），（−）-甲基碘化荷包牡丹碱（BMI），TTX，（±）-2-辛醇，1-庚醇，18α-甘草次酸（α-GA），反式-(1S公司,3R（右）)-1-氨基-1,3-环戊烷二甲酸(t吨-ACPD）和EGTA来自Sigma（密苏里州圣路易斯）。苏拉明、4-氯-m-甲酚（4-CmC）和他培沙金来自加州生物化学-新生物化学公司（加州拉霍亚），以及{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“CGP55845”，“term_id”：“875097176”，“term_text”：“CGP55845“}}CGP55845型来自托克里斯·库克森（英国巴克赫斯特山）。药物溶解在蒸馏水和二甲基亚砜中。

钙²⁺成像。P2–P24和成年（3–11个月龄）GFAP/GFP小鼠通过低温或氯胺酮-甲苯噻嗪注射液（分别为150和6μg/g）麻醉。他们的大脑和脊髓被移除并放置在含有（单位：m）的冷人工脑脊液（ACSF）中m） ：氯化钠120，氯化钾3，d日-葡萄糖10，NaHCO_三26，NaH₂人事军官₄2.25，氯化钙₂2、硫酸镁₄1，pH 7.4，用95%O起泡₂和5%CO₂用振动棒切割冠状和水平组织切片（300μm厚），在成像之前，将其保存在含有ACSF的储存室中至少1小时，其中ACSF在95%氧气中连续冒泡₂和5%CO₂室温（22–25°C）下。[加利福尼亚州²⁺]_我用溶于含有0.001%普鲁尼酸的二甲基亚砜中的膜渗透性呋喃-2AM乙酰氧基甲酯测定切片中的含量。将组织切片在3–5μl 5 m的培养基中培养米呋喃-2 AM 2分钟，然后在3 ml 10μ米如前所述，在ACSF中染色30分钟(Schwartz等人，1998年;Aguiló等人，1999年). 切片始终保存在含氧ACSF中。

在配备380 nm和340 nm激发滤波器和差分干涉对比光学系统的荧光直立显微镜（BX50WI；日本东京奥林巴斯）台上，将加载了Fura-2的切片转移到一个连续超熔记录室。[Ca的记录²⁺]_我在室温（22-25°C）下，用20×和40×水浸物镜对变化进行成像。使用硅增强管相机（滨松C2400–08）和连接到Macintosh计算机（加利福尼亚州库比蒂诺市苹果计算机公司）的帧抓取器（LG-3；Scion Corporation，Frederick，MD）拍摄图像。在NIH Image程序控制的最长20分钟内，使用380 nm带通滤波器以4秒的间隔（每个时间点平均15帧）在单个激发波长下采集Fura-2荧光图像。为了防止光漂白，使用了由自定义宏控制的快门（UniBlitz）。

网络分析为了分析光学记录的协同网络，我们采用了前面详细描述的方法(Schwartz等人，1998年;Aguiló等人，1999年). 使用交互式数据语言（Research Systems，Inc.，Boulder，CO）编写的程序分析多个细胞中荧光的变化。荧光随时间的变化定义为Δ前/后= (F类₀−F类₁)/(F类₀). 每个细胞的每一次钙瞬变的开始都是使用一种算法来确定的，该算法将开始定义为Δ前/后变化大于给定的设定阈值，通常每帧变化三到五个像素值单位。该阈值算法非常敏感，但在一些细胞中产生假阳性，其中噪声基线值被视为瞬态值，由目视检查确定。[加利福尼亚州]²⁺]_我仔细检查程序检测到的瞬态，并消除虚假事件。在光栅图中标记每个细胞的每个钙瞬变的起始时间。这些图用于计算所有细胞对之间的非对称相关系数矩阵，即当另一个细胞也处于活动状态时，一个细胞变为活动状态的时间比例。然后使用列联表，χ²进行测试以检测哪个相关系数显著大于预期。显著相关系数用于生成一个相关图，在该图上，线连接非对称相关系数显著的神经元(第页<0.01），其中连接任意两个单元格的线的厚度代表单元格之间较大的非对称相关系数的大小。

测试[Ca²⁺]_我瞬变显示了网络中细胞之间的联系，我们测量了记录中同时激活的数量，并将其用作统计测试。要确定其第页值，通过蒙特卡罗模拟计算独立瞬变零假设下的统计分布。这个第页然后，将该值计算为1000次重复中统计检验超过根据实际数据计算的统计检验的比例。为了模拟瞬态的独立实现，保留了每列中的瞬态数，但时间是随机选择的。这种方法相当于假设瞬变分布表现为具有不同基本速率的泊松过程。我们用一个控制计算来测试这个假设第页使用每列列车的随机开始时间和包裹终点的数值，没有发现不同的结果。我们还对每个样本进行了额外的测试，以检测同时激活多次的细胞组，并将此数字用作统计测试(Schwartz等人，1998年;Aguiló等人，1999年). 再次使用蒙特卡罗模拟来评估此统计测试的重要性。

学生的t吨测试用于比较所有测量值。数据表示为平均值±SEM。

结果

静止而非反应性星形胶质细胞显示自发[Ca²⁺]_我中枢神经系统瞬变

检查星形胶质细胞是否具有自发性[Ca²⁺]_我振荡就地，我们使用了在GFAP启动子控制下表达GFP的转基因小鼠的急性脑切片(Zhuo等人，1997年). GFAP/GFP阳性细胞显示了所有受检脑区和年龄段星形胶质细胞的典型大小和形态（图。​（图11A类–C类, 2B类,D类, 4A类,B类)与早期研究一致(Zhuo等人，1997年;Nolte等人，2001年). 当转基因切片中加入钙时²⁺指示剂fura-2，用钙标记的神经元²⁺指示剂不表示GFP（图。​（图11A类,B类). 因此，GFAP/GFP转基因切片的fura-2负载可以明确鉴定大量星形胶质细胞。

在单独的窗口中打开

图1。

自发[Ca²⁺]_我振荡是星形胶质细胞的常见特征就地.A类,B类，成对荧光显微照片显示fura-2下的相同场(A类)和GFP(B类)荧光，显示P7 GFAP/GFP小鼠新皮质第II–III层中GFP/fura-2标记的星形胶质细胞。双标记星形胶质细胞表示为箭头; 缺少GFP荧光的锥体神经元表示为箭头.C类，荧光显微照片，显示装载呋喃-2-的Bergmann胶质细胞(箭头)在P25小脑切片中。缺乏呋喃-2负载的浦肯野细胞被标记为星号.D类，fura-2荧光信号的代表性自发变化（ΔF类/F类)在P6–P25 GFAP/GFP小鼠不同CNS区域的星形胶质细胞体中记录的随时间变化。新皮质星形胶质细胞的自发活动曲线与A类和B类.注意爆裂和振荡Ca²⁺分别在丘脑和海马中显示的实例的变化。比例尺：A类,B类，20微米；C类，12微米。摩尔，分子层；P（P），浦肯野细胞层；德国劳埃德船级社颗粒细胞层。

我们监测了自发[Ca²⁺]_我别处描述的高分辨率成像系统的变化(Schwartz等人，1998年;Aguiló等人，1999年). 随时间变化的记录显示自发[Ca²⁺]_我对应于星形胶质细胞的大量GFAP/GFP阳性细胞体的变化。这些自发的星形细胞[Ca²⁺]_我CNS的不同区域发生了变化，包括新皮质、海马、内嗅皮质、纹状体、小脑、丘脑、下丘脑和脊髓（图。​（图11A类–D类). 星形细胞[Ca²⁺]_我瞬变早在P2（检查的最早阶段）就被检测到，并且在出生后的前2周内很常见。例如，71%的GFAP/GFP阳性星形胶质细胞记录在P5–P9（11片236个细胞中的167个），显示自发Ca²⁺海马体中的信号（图。​（图11D类,​,44C类,D类). 因为装载呋喃-2-的电池数量随着年龄的增长而减少(Yuste和Katz，1991年)P15后，较少GFAP/GFP阳性星形胶质细胞被fura-2负载。然而，几乎一半这些装载呋喃-2-的星形胶质细胞表现出自发的[Ca²⁺]_我P24的瞬变（例如，44%；新皮质55个细胞中的24个）（图。​（图22F类). 自发[Ca²⁺]_我成年星形胶质细胞中仍能检测到振荡，尽管其频率（例如，26%；两只动物四个新皮质切片中的31个细胞中有8个细胞）低于出生后阶段。大多数自发[Ca²⁺]_我事件很长（通常为10–45秒）（图。​（图11D类,​,22F类,​,3三B类–D类, 4C类)即使在同一脑区，振幅也会发生变化。活动的频率和模式是可变的，包括随机剖面，也包括节律振荡和爆发活动（图。​（图11D类). 我们得出结论，自发[Ca²⁺]_我瞬变是中枢神经系统发育中星形胶质细胞和成年星形胶质细胞的共同特征。

在单独的窗口中打开

图2。

反应性星形胶质细胞缺乏自发[Ca²⁺]_我瞬态。A类，顶叶皮层刺伤病灶位置示意图(箭头)P24 GFAP/GFP新皮质和损伤48小时后记录到自发星形细胞活动的区域(我,二、和三).B类,C类，显示GFAP/GFP阳性星形胶质细胞的低放大率显微照片(箭头)在区域III中(B类，静息星形胶质细胞）和I(C类反应性星形胶质细胞）。注意，病灶周围星形胶质细胞的星形胶质细胞数量和GFP荧光强度显著增加。D–G型、III区典型GFAP/GFP阳性静息星形胶质细胞的高倍显微照片(D、 E类)和I区反应性GFAP/GFP阳性星形胶质细胞(F、 G公司). 强GFP阳性反应星形胶质细胞有较大的体细胞和肥大过程(F类)比静止的GFP细胞(D类). 在两次休息中(E类)和反应性(G公司)星形胶质细胞，fura-2指示剂也同样被加载。H（H），[钙²⁺]_我损伤部位附近记录的800秒代表性GFAP/GFP阳性星形胶质细胞的轮廓(反应性星形胶质细胞; 区域I）和对侧半球(静止星形胶质细胞; 区域III）。比例尺：A类，1毫米；B类,C类，40微米；D类–G公司，5微米。

在单独的窗口中打开

图3。

自发[Ca的药理学分析²⁺]_我海马星形胶质细胞的短暂变化。A类，直方图显示海马P2–P6 GFAP/GFP阳性星形胶质细胞显示自发Ca的百分比²⁺给药一系列神经递质受体拮抗剂、TTX和钙阻滞剂后的活性²⁺动员。EGTA，Co后观察到显著减少²⁺和thapsigargin治疗(*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001). 每个实验条件至少分三个切片进行。数据表示为控制值的百分比（平均值±SEM）。B类，[Ca的代表图²⁺]_我在灌注正常ACSF（基础和洗脱）、Ca和Ca的P6小鼠的相同GFAP/GFP阳性星形胶质细胞中记录到的振荡²⁺-自由ACSF（2 m米EGTA，0米米[加利福尼亚州²⁺]_o个)和thapsigargin（2μ米).C类,D类，[钙²⁺]_我灌注钙后，P5 GFAP/GFP阳性星形胶质细胞中记录的振荡消失²⁺-免费ACSF。添加t吨-ACPD和4-CmC(箭头)名义上为Ca²⁺-游离ACSF引起[Ca的短暂和逐渐增加²⁺]_我分别是。缩写在材料和方法中定义。

在单独的窗口中打开

图4。

自发[Ca²⁺]_我海马星形胶质细胞的振荡属于相关的神经元/星形胶质细胞网络。A、 B类，成对荧光显微照片显示许多GFAP/GFP阳性星形胶质细胞(A类)海马CA1区（P6）也标记有fura-2（例如圈子) (B类). 显示随时间自发荧光变化的Fura-2负载细胞标记为正方形.黑色正方形标记GFP阳性星形胶质细胞，而GFP阴性神经元（主要位于锥体层）标记为白色方块.C类，fura-2荧光自发变化代表图（ΔF类/F类)CA1海马区的星形胶质细胞和神经元超过800秒。每个[Ca的起始²⁺]_我振荡由一个厚标记在底部情节。D类，显示自发[Ca特性的直方图²⁺]_我星形胶质细胞的振荡(白色条)和神经元(黑色条). 自发Ca的持续时间和振幅²⁺星形胶质细胞的激活率高于神经元，而活性细胞的比例和振荡率在两个群体中相似。E类，光栅图表示80个活动细胞中每个细胞的激活情况，如B类超过800秒。在光栅图中，每个活动单元格由线、和每个粗线条标志着[Ca的开始²⁺]_我瞬态。细胞1–27对应于星形胶质细胞，并且28–80对应于神经元。虚线在星形胶质细胞光栅图中，至少有两个细胞同时激活。也可以清楚地看到大量神经元之间的同步协同激活。F类，显示每种活动星形胶质细胞的相关性图B类(黑色方块)，其中具有统计显著相关系数的单元格通过以下方式连接线. The厚度的线与重要性成正比。大多数活跃的星形胶质细胞似乎属于一个相关网络。G公司，表示所有星形胶质细胞之间同步相关的相关图(黑色方块)如所示F类和七个有代表性的神经元(白色方块,箭头在光栅图中）。观察有多少星形胶质细胞与神经元细胞同步连接。H（H），实际数据中发现的成对相关性分布(箭头)蒙特卡罗测试获得的1000个模拟结果(钟形曲线)星形胶质细胞的数量B类。注意实际数据集中相关事件的数量(箭头)超出了模拟数据中的预期。相应的第页值如所示F类.我，蒙特卡罗平均值第页值显示任意两个细胞同时激活的次数是偶然引起的。尽管所有病例都发生在两个星形胶质细胞中（6例中的6例；A类)神经元（6/6；N个)都很重要(第页<0.05），星形细胞值高于神经元值。J型，蒙特卡罗平均值第页显示相同细胞同时被激活至少两次的概率的值是偶然产生的。每组神经元群给出0第页值（第6个，共6个；N个)而在星形细胞中，只有六分之四的病例是显著的(第页< 0.05) (A类). 两者都有我和J型说明自发[Ca的较高同步相关水平²⁺]_我神经元之间的振荡比星形胶质细胞之间的振荡。K（K），直方图总结了具有统计显著相关系数的自发活动细胞的比例：星形胶质细胞(A类→A类)，在神经元之间(N个→N个)，与神经元协同作用的星形胶质细胞百分比(A类→N个)和与星形胶质细胞相互作用的神经元百分比(N个→A类). 统计显著性：*第页< 0.0001. 比例尺，40μm。锶，辐射层；服务提供商金字塔层；所以，地层定向。

星形胶质细胞具有许多功能，包括细胞外“环境”的稳态控制、突触功能的调节以及中枢神经系统损伤后的保护作用(Kettenmann和Ransom，1995年). 研究自发[Ca²⁺]_我星形胶质细胞的变化取决于它们的功能状态，我们确定了这些自发振荡是否在反应性星形胶质细胞中持续存在。我们比较了Ca²⁺刺伤48小时后反应性和静息性星形胶质细胞的信号转导(马修森和贝里，1985年)在P22 GFAP/GFP转基因小鼠的新皮质中（图。​（图22A类). 如内源性GFAP和转基因报告表达所述(Latov等人，1979年;马修森和贝里，1985年;Salhia等人，2000年;Nolte等人，2001年)在GFAP/GFP转基因切片中，位于伤口损伤周围（100–500μm）的大量星形胶质细胞在细胞体和突起中均表现出较强的GFP表达（图。​（图22B类,C类). 此外，伤口同侧半球的星形胶质细胞表现出典型的刺伤反应性星形胶质细胞增生(Latov等人，1979年;马修森和贝里，1985年;Salhia等人，2000年;Nolte等人，2001年). 因此，尽管对侧皮层中静止的星形胶质细胞大小为～4μm，且突起非常薄（图。​（图22D类,E类)，反应性星形胶质细胞显示GFAP/GFP荧光增强，并且具有较大的胞体（大小约10μm）和肥大的突起（图。​（图22F类,G公司). 82个反应性星形胶质细胞中只有2个（在距离病灶100–200μm处成像）自发[Ca²⁺]_我振荡，振幅很低（五只动物的七片切片之一）。剩下的反应性星形胶质细胞没有自发[Ca²⁺]_我即使在记录15分钟后也会发生变化（图。​（图22H（H）). 特征性的是，位于伤口附近的其他GFAP/GFP阴性、形状和大小与神经元相似的细胞体频繁自发[Ca²⁺]_我瞬态（未显示数据）。相反，GFAP/GFP阳性细胞的比例随着其与病变的距离成比例增加（图。​（图22A类). 例如，51%（33个中的19个）和44%（55个中的24个）的星形胶质细胞表现出自发[Ca²⁺]_我分别在病变同侧和对侧半球2.5–3 mm处出现振荡（四只动物的六个切片中的六个）（图。​（图22H（H）). 这些数据表明²⁺]_我振荡是静息星形胶质细胞的一种常见功能特性，当星形胶质细胞对机械损伤作出反应时，这种特性就会消失。

自发星形胶质细胞钙瞬变的网络特性受神经元活动的调节

受刺激的星形胶质细胞[Ca²⁺]_我振荡(Pasti等人，1997年,2001;Araque等人，1998年a,b条;Bezzi等人，1998年:帕普拉和海登，2000年;Parri等人，2001年). 相反，有证据表明，星形胶质细胞激发的活性可能在神经元刺激后增加(Dani等人，1992年;波特和麦卡锡，1996年;Pasti等人，1997年;Kang等人，1998年). 因此，我们研究了神经元活动是否调节自发星形胶质细胞活动及其在时空相关网络中的组织。首先，我们使用TTX消除GFAP/GFP转基因海马脑片（P5-P7）中的神经元动作电位。Na孵化⁺通道阻断剂TTX（2μ米)受损的自发性[Ca²⁺]_我海马神经元的瞬态（图。​（图55A类). 因此，TTX显著减少了显示[Ca²⁺]_我振荡和剩余活动神经元的激活率（图。​（图55C类,D类). 此外，如光栅图和相关图所示，Na⁺通道阻断显著地破坏了剩余活动神经元的活动模式，导致了非常简单的神经元网络（图。​（图55A类,B类). 这些观察结果得到了协作神经元数量显著减少的支持（图。​（图55E类,N个→N个)以及蒙特卡洛的急剧上升第页值，反映了整体网络去相关（图。​（图55F类).

在单独的窗口中打开

图5。

TTX治疗后，自发性星形细胞相关网络活动受损。A类，光栅图显示星形胶质细胞（细胞1–16)和神经元（细胞17–52)P6 GFAP/GFP小鼠海马CA1区(基底的)TTX给药后。虽然在星形胶质细胞群中未观察到重大变化，但神经元活动受到极大损害。B类，所有活动星形胶质细胞的相关图(黑色方块)和一部分有代表性的活动神经元(白色方块,箭头在光栅图中），如所示A类TTX治疗后，活性神经元及其相关性几乎消失，而相关的星形胶质细胞活性持续存在。C类，自发活动的星形胶质细胞(白色条)和神经元(黑条)与服用TTX后的基础状况有关。D类，星形胶质细胞活性率(白色条)和神经元(黑条)与TTX给药后的控制有关。E类，直方图总结了TTX后具有统计显著相关系数的自发活动细胞在星形胶质细胞中的比例(A类→A类)，在神经元之间(N个→N个)，与神经元协同作用的星形胶质细胞百分比(A类→N个)和与星形胶质细胞相互作用的神经元百分比(N个→A类).F类，蒙特卡罗平均值第页值显示任意两个细胞同时激活的次数是偶然引起的。两个星形胶质细胞(A类)和神经元(N个)在基础条件下表现出非常显著的值，而TTX治疗与两个神经群体的自发活动无关。大幅削减(*第页<0.05）。比例尺，40μm。锶，辐射层；服务提供商金字塔层；所以，地层定向。

相反，TTX导致活性星形胶质细胞数量及其[Ca²⁺]_我振荡速率（图。​（图55A类,C类,D类). 此外，尽管在Na治疗后，星形胶质细胞相互连接的比例得以维持⁺通道封锁（图。​（图55E类,A类→A类)如相关图所示（图。​（图55B类)和更高的蒙特卡洛第页平均值（图。​（图55F类). 此外，TTX给药后，与活动神经元相关的星形胶质细胞百分比显著下降（图。​（图55E类,A类→N个). 因此，尽管Na⁺自发星形胶质细胞活动的产生不需要通道和神经元活动，它们与神经元和星形胶质细胞的相关网络特性极大地依赖于动作电位。

为了证实这些发现，我们研究了神经元活动水平的增加是否改变了自发的星形胶质细胞活动。为此，我们通过给予BMI（30μ米)到浴缸。阻断离子型GABA消除GABA能抑制性神经传递_A类BMI受体诱导皮层脑片高兴奋性和癫痫持续状态(琼斯和兰伯特，1990年;Albowitz等人，1997年;Badea等人，2001年). 应用BMI后，我们观察到自发[Ca²⁺]_我瞬态及其振荡速率（图。​（图66A类,C类,D类). 此外，大多数活动神经元被招募到重复的同步波中，这证实了先前的研究(Albowitz等人，1997年;Badea等人，2001年)，并导致高度互动的光栅图和相关图（图。​（图66A类,B类). 有趣的是，GABA后自发活动的GFAP/GFP阳性星形胶质细胞数量及其激活率也显著增加_A类受体阻断（图。​（图55A类,C类,D类). 更重要的是，BMI孵育后与其他星形胶质细胞（A→A）和神经元（A→N）相互作用的星形胶质细胞数量分别增加了41和80%（图。​（图66E类)这导致了非常复杂的相关图（图。​（图66B类)星形胶质细胞整体同步性高（图。​（图66F类). 神经性癫痫样波征集了许多星形细胞[Ca²⁺]_我振荡，使大多数活动的星形胶质细胞与神经元激活波同步（见图中的光栅图和相关图）。​图6）。6). 因此，BMI治疗不仅增加了自发的星形胶质细胞活性，还增加了星形胶质细胞之间以及星形胶质细胞和神经元之间的相关活性。

在单独的窗口中打开

图6。

BMI诱导的癫痫状态下自发星形胶质细胞相关网络活动增加。A类，光栅图显示星形胶质细胞（细胞1–26)和神经元（细胞27–55)P9 GFAP/GFP小鼠海马CA1区(基底的)以及BMI给药后。BMI增强星形细胞和神经元群体的自发活动。B类，显示所有活动星形胶质细胞的相关图(黑色方块)和一部分有代表性的活动神经元(白色方块,箭头在光栅图中），如所示A类BMI治疗后，星形胶质细胞和神经元细胞的相关活性增加。C类，自发活动星形胶质细胞百分比(白色条)和神经元(黑条)与BMI给药后的基础状况有关。D类，星形胶质细胞活动率百分比(白色条)和神经元(黑条)与BMI给药后的控制有关。E类，根据BMI给药后与基础条件相关的相关图计算出的具有统计意义的同步性的活动星形胶质细胞和神经元的比例。BMI孵育后，星形胶质细胞增加了与星形胶质细胞和神经元的同步相关性。F类，蒙特卡罗平均值第页值显示任意两个细胞同时激活的次数是偶然引起的。两个星形胶质细胞(A类)和神经元(N个)在基础条件下表现出非常显著的数值，而BMI治疗降低第页星形胶质细胞的值。统计显著性：*第页< 0.05. 比例尺，40μm。锶，辐射层；服务提供商金字塔层；所以，地层定向。

总的来说，我们的结果表明，尽管自发星形胶质细胞活动的产生不需要神经元活动，但其网络特性在很大程度上受神经元兴奋的控制。

激活离子型谷氨酸受体是产生相关星形胶质细胞网络活性所必需的

缝隙连接和细胞外信使，如谷氨酸、ATP和一氧化氮，被认为可以控制诱发钙的传播²⁺星形胶质细胞网络的激活(Cornell-Bell等人，1990年;Dani等人，1992年;Finkbeiner，1992年;Venance等人，1997年;Guthrie等人，1999年;Willmott等人，2000年;纽曼，2001;Schipke等人，2002年). 确定星形细胞网络自发活动的相关机制就地，我们在P5–P7 GFAP/GFP海马切片上使用了几种阻断剂。用缝隙连接阻断剂α-GA（100μ米)没有干扰活性星形胶质细胞的数量（图。​（图3三A类,​,77A类–C类,J型). 此外第页反映整个星形胶质细胞群之间相关性的数值被完全保留（图。​（图77A类–C类,J型). 其次，由于神经元活动是与自发星形胶质细胞Ca相关的必要条件²⁺激活后，我们分析了谷氨酸受体的作用。添加AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂（20μ米CNQX）对浴液的星形胶质细胞网络相关性显著受损（图。​（图77J型). 通过清洗CNQX（图。​（图77J型). 此外，灌流NMDA受体拮抗剂APV（50μ米)也废除了星形细胞网络相关性（图。​（图77D类,E类,J型). 再次，星形胶质细胞协同激活在冲洗后恢复（图。​（图77F类). 相反，MCPG（1 m）对谷氨酸代谢性受体的阻断米)没有去关联自发星形细胞网络活动（图。​（图77J型). 我们的结论是，激活离子型谷氨酸受体对产生自发的星形胶质细胞活动是不必要的就地但这种激活是它们在相关网络中时空协调的主要调节器。此外，大多数阻断剂仅轻微改变了自发[Ca²⁺]_我神经元的振荡（数据未显示），而APV治疗使活动神经元的数量减少了36.8%，这与以前的报告一致(Ben-Ari等人，1997年,Garaschuk等人，1998年).

在单独的窗口中打开

图7。

海马区自发星形细胞活动的网络相关性控制机制。A–C，显示P6星形胶质细胞网络在基础条件下协调活动的相关图(A类)，与缝隙连接阻断剂α-GA孵育后(B类)和冲洗后(我)带α-GA(C类). 请注意，蒙特卡罗表示的网络相关性第页价值(底部图中），不受阻挡间隙连接的干扰。D–F型，显示NMDA受体阻断对P5星形胶质细胞网络的影响的相关图²⁺未处理星形胶质细胞中的事件(D类)APV潜伏期减少(E类)并在清洗拮抗剂后恢复(F类).G–I型，BMI处理海马切片中的网络星形胶质细胞相关性(G公司)添加CNQX后显著降低(H（H）)并通过清洗非NMDA拮抗剂恢复(我).J型，显示蒙特卡洛平均值的柱状图第页值(黑条,左边)和活跃星形胶质细胞的百分比(白色条,正确的)在基底GFAP/GFP海马脑片中加入缝隙连接阻断剂和谷氨酸受体拮抗剂后。K（K），星形胶质细胞网络相关性的平均值(黑色条,左边)和活性星形胶质细胞百分比(白色条,正确的)在BMI处理的海马脑片中给予离子型谷氨酸受体拮抗剂后。每个实验条件至少在三个不同的切片中进行。统计显著性：*第页< 0.05. 比例尺，45μm。锶，辐射层；服务提供商金字塔层；所以，地层定向。

众所周知，缺乏抑制性GABA_A类-经BMI处理的海马脑片中介导的反应显著增加了神经元的兴奋性和谷氨酸的释放，从而导致癫痫的发生(布拉德福德，1995). 我们分析了离子型谷氨酸受体在BMI诱导癫痫模型中生成星形细胞网络相关性中的作用。向P8–P11 GFAP/GFP海马脑片注射BMI可增加相关的星形细胞活性（图。​（图66,​,77G公司,K（K）). 添加CNQX（20μ米)BMI–ACSF显著消除了星形细胞Ca的相关性²⁺活动（图。​（图77G公司,H（H）,K（K）). 通过用BMI–ACSF冲洗谷氨酸拮抗剂，这种阻塞被逆转（图。​（图77我,K（K）). CNQX对BMI处理的星形胶质细胞网络的去相关作用伴随着自发活动星形胶质细胞数量显著减少37.2%（22±2.7 vs 14.5±1.5活动星形胶质胶质细胞；四片；第页< 0.05; 成对的，成对的t试验)（图。​（图77G公司,H（H）,K（K）). 相反，在BMI治疗的海马脑片中阻断NMDA受体并没有改变星形胶质细胞网络的相关性（图。​（图77K（K）). 此外，显示[Ca²⁺]_我BMI–ACSF的变化（21±3.8活性星形胶质细胞；三片）未受到APV的干扰（18±2.5活性星形细胞；三块；第页= 0.46; 成对的，成对的t吨测试）（图。​（图77K（K）). 同样，BMI诱导的癫痫切片与CNQX孵育后，活动神经元数量减少了75.6±8%(第页< 0.05; 成对的，成对的t吨试验），而与APV孵育并没有改变活动神经元的数量(第页= 0.28; 成对的，成对的t吨测试）。这些数据表明，在神经元超兴奋状态下，如癫痫，自发星形细胞网络活动的相关性主要由AMPA/红藻氨酸受体调节。

讨论

自发[Ca²⁺]_我星形胶质细胞的振荡已经在游离和器官型培养物中被描述(Fattis和Rusell，1992年;查尔斯，1994年;Harris-White等人，1998年). 最近，自发[Ca²⁺]_我已报告瞬态就地平行纤维突触周围小脑Bergmann胶质细胞的微区以及丘脑和海马星形胶质细胞的胞体(Grosche等人，1999年;Parri等人，2001年;Nett等人，2002年). 在这里，我们显示来自包括大脑皮层在内的许多大脑区域的星形胶质细胞表现出自发活动就地在所研究的所有发育阶段和成人中。星形胶质细胞激活模式是可变的，从随机事件到突发活动，这一发现增加了与发育或区域特异性神经元活动模式相关的可能性。

虽然静止的星形胶质细胞与突触传递的调节有关(Araque等人，2001年;Bezzi和Volterra，2001年)活化的星形胶质细胞在创伤相关过程中发挥着重要作用，如瘢痕愈合、细胞外基质修复、碎片清除和血液-中枢神经系统界面控制(Raivich等人，1999年). 因此，反应性星形胶质细胞缺乏[Ca²⁺]_我瞬变现象不仅表明自发的星形胶质细胞活动取决于这些细胞的功能状态，而且表明与神经传递的调节有关。因为[Ca的变化²⁺]_我控制基因表达与细胞分化(斯皮策等人，2000年)缺乏自发[Ca²⁺]_我星形胶质细胞中的瞬态可能有助于星形胶质细胞的激活。综上所述，上述数据表明²⁺]_我振荡是大多数脑星形胶质细胞的一种常见特性，损伤后激活时会丢失。

虽然某些神经递质，如谷氨酸和ATP，触发[Ca²⁺]_我和振荡(Cornell-Bell等人，1990年;Charles等人，1991年;Parpura等人，1994年;Pasti等人，1997年;波特和麦卡锡，1997年;Reetz等人，1997年;Verkhratsky等人，1998年;Guthrie等人，1999年)，我们的结果表明海马星形胶质细胞自发活动的产生就地主要独立于ATP信号传导和谷氨酸能和GABA能受体的激活，以及神经元活动，这与最近的报道一致(Parri等人，2001年;Nett等人，2002年;Thasiro等人，2002年). 此外，我们还表明，自发振荡严重依赖于细胞外和细胞内钙²⁺这可能导致[Ca的典型大而持久的轮廓²⁺]_我星形胶质细胞的振荡。因此，可以想象，细胞外钙的清除²⁺可能废除Ca²⁺激活星形胶质细胞所必需的神经末梢神经递质的流入依赖性基线释放。然而，使用选择性V-ATP酶抑制剂bafilomycin A1进行治疗，该抑制剂可抑制囊泡神经递质的释放(Araque等人，2000年;Zhou等人，2000年)，不阻止星形胶质细胞[Ca²⁺]_我振荡就地(Nett等人，2002年)，表明直接需要[Ca²⁺]₀产生自发的星形细胞活动。最后，在星形细胞[Ca²⁺]_我丘脑的振荡(Parri等人，2001年)海马体（目前的结果）支持这样的观点，即自发的星形胶质细胞活动是由几个脑区共同的机制触发的。

发现星形胶质细胞和神经元中自发活动细胞的百分比及其振荡率非常相似，这表明星形胶质细胞的活动是一种强有力的现象。使用允许监测自发[Ca的方法²⁺]_我在大量星形胶质细胞发生变化的情况下，我们展示了相关、同步星形胶质细胞的庞大而复杂的网络。我们发现，海马区约80%自发活动的星形胶质细胞显示同步星形胶质细胞对星形胶质细胞[Ca²⁺]_我事件，形成复杂的网络，招募数十个星形胶质细胞，通常位于很远的地方。有趣的是，这里描述的海马体自发协同激活的模式就地比以前在分离的器官型培养物和新皮质切片中观察到的要复杂得多(Dani等人，1992年;查尔斯，1998年;Harris-White等人，1998年;Thasiro等人，2002年). 同样，在丘脑就地,Parri等人（2001）描述了多达五个相邻星形胶质细胞之间的自发同步相关性。出生后海马神经元的高同步激活特征(Ben-Ari等人，1997年;Garaschuk等人，1998年;本·阿里，2001年)这可能是网络复杂性差异的原因。然而，我们赞成这样的观点，即本研究中使用的联合转基因/成像方法是为了筛选大量星形胶质细胞的活性，从而能够检测到这些复杂的相关网络。最后，由于星形细胞网络在出生后的不同阶段出现在海马体中（目前的数据），丘脑(Parri等人，2001年)以及其他区域，如新皮层（F.Aguado、J.F.Espinosa-Parrilla和E.Soriano，未发表的观察结果），网络活动可能是大多数星形胶质细胞的特性体内.

在我们的实验中，许多自发活动的星形胶质细胞（61%）含有钙²⁺事件与海马神经元相关，这表明自发神经元和胶质细胞活动之间的关系。事实上，以前的研究已经描述了神经元和星形胶质细胞之间的结构和功能相互作用，如缝隙连接和细胞外信使(Dani等人，1992年;波特和麦卡锡，1996年;Pasti等人，1997年,2001;Araque等人，1998年a,b条;文图拉和哈里斯，1999年;Alvarez-Maubecin等人，2000年;Rouach等人，2000年;Rochon等人，2001年). 虽然用TTX阻断动作电位后，活性星形胶质细胞的百分比及其振荡率没有显著变化，但出生后海马中星形胶质细胞网络的整体同步活动被取消，这表明神经元活动需要调节自发活动星形胶质细胞的时空模式和同步性。相反，BMI引起的痫样放电引起的神经元活动水平升高不仅会增加活动星形胶质细胞的数量(Tashiro等人，2002年)但显著增加了星形胶质细胞与星形胶质细胞和神经元之间的网络相关性。事实上，在荷包牡丹碱癫痫模型中，许多星形胶质细胞被招募到海马神经元诱导的高度同步的癫痫样波中，证明了神经元对胶质细胞自发活动的快速时空控制。因此，当神经元活动水平超过阈值时，星形胶质细胞振荡及其协同激活程度由神经元调节，如癫痫状态。

缝隙连接控制Ca²⁺培养星形胶质细胞中的波传播(Giaume和McCarthy，1996年;查尔斯，1998年;Giaume和Venance，1998年). 本研究表明，自发星形胶质细胞钙的相关性²⁺活动与间隙连接无关，同时诱发Ca²⁺急性脑切片中的波不受缝隙连接阻滞剂的影响(Schipke等人，2001年)，表明不同的机制与钙相关²⁺在培养和就地星形胶质细胞。相反，抑制NMDA和非NMDA谷氨酸受体会损害自发的星形胶质细胞活性，这与其他研究一致，这些研究表明谷氨酸受体的激活与星形胶质细胞钙的增殖有关²⁺信号(Cornell-Bell等人，1990年;Cornell-Bell和Finkbeiner，1991年;Dani等人，1992年;Finkbeiner，1992年;Venance等人，1997年). 因为除了神经元外，星形胶质细胞还表现出钙²⁺-依赖性谷氨酸释放(Bezzi等人，1998年,Araque等人，2000年;Innocenti等人，2000年)神经元和星形胶质细胞的谷氨酸均可控制星形胶质细胞网络的活动。值得注意的是，TTX和离子型谷氨酸受体拮抗剂以类似的方式去相关星形胶质细胞网络，而不改变活性星形胶质细胞的数量。这些观察表明，去极化神经末梢释放的谷氨酸有助于星形胶质细胞钙的相关性²⁺活动。这一观点也与星形胶质细胞中NMDA和非NMDA受体功能表达的数据一致(波特和麦卡锡，1995年;Schipke等人，2001年).

我们还表明，CNQX（而非APV）可逆转BMI诱导的星形胶质细胞自发活动水平的增加及其时空协调。因为AMPA/红藻氨酸受体的激活而非NMDA受体的激活是参与BMI治疗海马癫痫样放电的产生和传播的主要机制(琼斯和兰伯特，1990年;Albowitz等人，1997年;Stoop和Pralong，2000年)神经释放的谷氨酸与星形胶质细胞网络活动相关的观点得到了进一步支持。综上所述，目前的数据表明，神经元谷氨酸调节自发星形细胞钙的网络特性²⁺通过激活离子受体发出信号。

总之，我们得出结论：[Ca²⁺]_我星形胶质细胞的振荡及其网络特性是由内在机制产生的体内然而，这是由神经元活动和快速谷氨酸受体调节的。因此，结合数据显示星形胶质细胞刺激导致神经元放电(Pasti等人，1997年,2001;Araque等人，1998年a,b条;Bezzi等人，1998年;Parpura和Haydon，2000年;Parri等人，2001年)，我们的结果指向一个复杂的功能场景，其中自发的星形胶质细胞和神经元活动以动态方式双向调节。考虑到自发和诱发的神经元活动在神经元发育和突触可塑性的各种事件中的重要作用(Katz和Shatz，1996年)复杂的神经元/星形胶质细胞网络可能在这些过程中发挥关键作用。此外，我们的数据表明星形胶质细胞[Ca的一种未被探索的功能²⁺]_我神经病理过程中的信号传导，如癫痫。

参考文献