NMDA受体激活钙调神经磷酸酶和树突状肌动蛋白重塑对A激酶锚定蛋白79/150–cAMP-依赖性蛋白激酶突触后靶向性的调节

AKAP79/150在海马神经元树突状棘上的突触后定位

在培养8 DIV的神经元中，AKAP79/150在体细胞和树突中显示出不均匀的膜定位，包括精细的丝足结构（图。​（图11A类). 然而，在8 DIV时，AKAP79/150几乎没有共同分布，PSD-95的点状物主要位于树状轴上。到16 DIV时，AKAP79/150和PSD-95 punta的共同定位更加广泛（图。​（图11A类). 在培养的第三周，AKAP79/150和PSD-95的体脂共定位发展得更多，到22-26 DIV时，大多数PSD-95点刺与AKAP79/120点刺重叠，尤其是在树突棘上（图。​（图11A类). 然而，即使在22–26 DIV时，仍有AKAP79/150染色的部位未对PSD-95染色呈阳性，反之亦然（图。​（图11A类; 看见箭头放大复合板）。在中高密度神经元培养物中也获得了类似的结果，这些培养物比低密度培养物形成更多的突触并更快成熟。在中高密度培养2–3周的神经元显示AKAP79/150与PSD-95广泛但仍未完全的树突状共定位（图。​（图11B类,箭头). 神经元对AKAP79/150和突触蛋白的协同作用表明，在这些树突中看到的大多数AKAP79/120点与突触前终末密切相反（图。​（图11B类). AKAP79/150定位于兴奋性抑制性突触的特异性在树突状AKAP79/120和GABA之间几乎没有重叠_A类受体穿孔（图。​（图11B类).

AKAP79/150突触后定位依赖于树突状肌动蛋白细胞骨架

AKAP79/150与PSD-95共定位的发展过程与其他人阐明的形成富含F-actin的树突状棘和谷氨酸受体和PSD-95向棘突触募集的时间进程密切相关(Rao等人，1998年;Pickard等人，2000年;Okabe等人，2001年;张和本森，2001). 重要的是，AMPA受体的突触后定位依赖于F-actin，并被actin聚合抑制剂latrunculin A破坏(Allison等人，1998年,2000;Shen等人，2000年;Zhou等人，2001年). 与先前关于AMPA受体的研究一致，作为阳性对照，latrunculin a治疗导致GluR1-AMPA受体与PSD-95的树突状共定位减少（图。​（图2A）。2A） ●●●●。与AKAP79/150可能针对突触后肌动蛋白的靶向性一致，在未经处理的神经元中，AKAP79/120在树突状棘上与含鬼臼苷的F-actin和PSD-95共定位（图。​（图22B类,C类). 在latrunculin治疗后，AKAP79/150在树突中呈现出更为弥漫的模式，几乎没有F-actin共定位（图。​（图22B类,C类). 重要的是，latrunculin治疗也破坏了AKAP79/150与PSD-95的共分布（图。​（图22B类,C类)如之前的研究所示，它仍然是点状的(Allison等人，1998年,2000). latrunculin对AKAP79/150与F-actin和PSD-95在树突状棘上共定位的这些影响在去除药物和恢复期后是可逆的，以允许脊椎actin的重新聚合（图。​（图22B类). 这些发现表明，与AMPA受体一样，树突状F-actin细胞骨架对维持AKAP79/150突触后定位很重要。

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图2。

AKAP79/150与F-actin、PSD-95、PKA和钙调神经磷酸酶在树突棘上的共定位依赖于肌动蛋白细胞骨架：用latrunculin A破坏。A类，AMPA受体GluR1(红色)与PSD-95的树突状共定位(绿色)被latrunculin A预处理破坏(+中校A; 5 μ米，2小时）。B类，海马神经元中的树突状棘共定位（见白色在里面复合板)AKAP79/150的(红色)含F-actin(绿色)和PSD-95(蓝色)被latrunculin A治疗（2μ米; 2小时），并且在药物洗脱和恢复（16小时）后是可逆的。C类，AKAP79/150的树突状脊柱共定位(红色)带有CaN和PKA以及PSD-95和F-actin（标记；全部在绿色)被latrunculin A（5μ米，2小时）。显示了树枝晶的放大。定量见结果。

多个实验中神经元的定量(n个=3-5）显示F-actin的AKAP150整合共定位指数（见材料和方法）为65±9%，PSD-95（PSD）为66±3%_有限公司)在未经处理的神经元中。latrunculin治疗后，F-肌动蛋白和PSD的这些指数分别降至22±6%和19±6%_有限公司分别是。这种AKAP79/150从PSD的缺失可能会导致锚定在其上的PKA和CaN的定位发生相应的变化。在对照神经元中，PKA-RIIβ和CaNB染色都显示出与AKAP79/150在树突棘上的广泛点状共分布，共定位指数为150-RII_有限公司=73±4%和150-CaN_有限公司分别=68±3%（图。​（图22D类) (n个= 3–5). 然而，用latrunculin处理神经元后，PKA和CaN与AKAP79/150的点状共分布丢失，所有三种蛋白都主要表现为弥漫性树突定位（图。​（图22D类). 在latrunculin治疗后，如果没有大量AKAP150、PKA-RIIβ或CaNB puncta进行定量，则无法计算准确的共定位指数。然而，归一化平均荧光值的计算（见材料和方法；D/T比）显示，对AKAP150[81±3%对照；63±3%latrunculin A（LtrA）]、PKA-RIIβ（70±3%对照）、53±2%LtrA和CaNB（76±4%对照）进行latrunculan治疗后，树突整体定位相应减少了17–21%；55±3%LtrA），表明大量PKA和CaN可能与AKAP作为一个单位移动。因此，肌动蛋白细胞骨架对于维持AKAP79/150支架多组分的正确树突状定位是必要的。

AKAP79 N末端基本结构域结合F-actin并介导靶向COS7细胞的皮层膜细胞骨架

根据这些latrunculin研究的结果以及AKAP N末端基本结构域与MARCKS效应域的相似性，我们分析了纯化的重组AKAP79WT、N末端靶向结构域（1-153）片段和C末端（154-427）控制片段（图。​（图3三A类)使用共沉淀法与F-actin直接结合。我们观察到AKAP79与F-actin的直接结合，如AKAP79在F-而非G-actin颗粒组分中的共沉淀所示（图。​（图3三B类). 对非特异性聚集的另一个控制是，AKAP79在G-或F-缓冲液条件下，在没有肌动蛋白的情况下不会沉积。重要的是，与先前映射的基本膜靶向和PI-4,5-P相对应的重组N末端（1–153）片段₂结合域也表现出与F-actin的特异性共沉积（图。​（图3三B类). 相反，C末端（154-427）控制片段缺乏基本结构域，但包含CaN和PKA锚定结构域（图。​（图3三A类)未与F-actin共沉淀（图。​（图3三B类).

接下来，我们试图确定这个结合F-actin的N-末端基本结构域是否在体外在模型细胞系统中，可能也足以靶向膜肌动蛋白细胞骨架。我们用GFP标记的全长AKAP79转染COS7细胞(钱，1998)然后将F-肌动蛋白与阴茎倍体蛋白进行共染色（图。​（图3三C类). 在对照细胞中，AKAP79–GFP表现出质膜定位，其特征是在膜皱褶中显著富集F-actin，而不是细胞质应力纤维（图。​（图3三C类). 在用聚合抑制剂细胞松弛素D破坏F-actin后，AKAP79–GFP与F-actin的共定位被消除，AKAP呈弥漫性质膜定位，在细胞膜结构和聚集物中显著积累（图。​（图3三C类). 重要的是，N-末端（1-153）-GFP蛋白也显示出对F-肌动蛋白褶皱的特异性定位，并且这种定位对细胞松弛素D的破坏敏感（图。​（图3三D类). 相反，缺乏N末端基本结构域的GFP-（150–427）控制融合蛋白是细胞质的，在COS7细胞中没有与膜或皮质肌动蛋白的定位（图。​（图3三E类). 因此，AKAP79的N末端基本区域对于靶向细胞中的皮层/膜肌动蛋白结构似乎是必要和充分的。

我们的上述发现表明，抑制神经元中的F-actin聚合可能通过AKAP79/150的错误定位破坏PKA和CaN的树突棘定位。为了支持这个模型，当在COS7细胞中单独表达时，PKA–RII–GFP和mycCaNA亚基是细胞质的（图。​（图3三F类,G公司)但当与AKAP79共压制时，靶向膜并富含褶边（图。​（图3三H（H）,我). 重要的是，细胞松弛素D对F-actin的破坏导致PKA或CaN与AKAP79的膜皱褶定位丢失、扩散质膜定位以及这些蛋白在细胞内结构中的出现（图。​（图3三H（H）,我). 因此，阻断突触后靶向AKAP79/150（PSD中主要的AKAP）也可能改变PKA和CaN在神经元中的树突棘定位，如图所示​图2。2此外，从所有这些COS7研究的结果来看，在latrunculin处理的神经元中，AKAP79/150、PKA和CaN的弥漫性树突定位似乎是突触外侧膜扩散和细胞内膜重新分布的产物。

我们之前的研究表明，AKAP79碱性靶向结构域，如MARCKS效应结构域，可以通过非特异性静电相互作用与含有酸性磷脂（如PI-4，5-P）的膜结合₂有趣的是，使用PLCδ-PH的细胞成像研究，其与PI-4，5-P以高亲和力和特异性结合₂，显示PI-4,5-P富集₂质膜皱褶中含有肌动蛋白(Tall等人，2000年). 因此，我们想研究AKAP79 N末端基本结构域是否也可能与PI-4,5-P共定位₂在膜褶边。为了使这一调查成为可能，我们生成了AKAP79全长和（1–153）标记的氰基CFP和标记黄色YFP的PLCδ-PH域，用于活细胞同步成像。AKAP79–CFP的共表达（图。​（图3三J型)或（1–153）–CFP（图。​（图3三K（K）)通过PLCδ-PH–YFP显示CFP和YFP荧光在COS7活细胞膜皱褶中广泛共分布。AKAP79和（1–153）-CFP的一些胞内囊泡膜定位也与PH-PLCδ-YFP无关（图。​（图3三J型,K（K）). 然而，褶边中AKAP79（1–153）与PLCδ-PH的广泛重叠清楚地表明AKAP靶向结构域和PI-4,5-P的显著富集₂在相同的质膜结构中。这些发现表明，三个AKAP79 N端碱基区域（如MARCKS碱基结构域）的多重静电相互作用可能使AKAP连接质膜PI-4,5-P₂褶边中的皮质肌动蛋白。

AKAP79 N末端基本结构域介导靶向海马神经元树突状棘

接下来，我们想建立针对皮质肌动蛋白和PI-4,5-P的相同N末端基本区域₂COS7细胞的膜结构也参与了AKAP79靶向神经元树突状棘的过程。以前，我们证明该区域可以靶向显微注射的皮层神经元中的体脂质膜；然而，在突触与F-actin或PSD–MAGUK的特异性共定位没有得到解决(Dell'Acqua等人，1998年). 全长AKAP79–GFP或（1–153）–GFP的表达仅包含N末端基本结构域，导致GFP靶向转染神经元胞体和树突的质膜部位（图。​（图44A类). 相比之下，GFP本身明显是细胞质的，弥散分布于胞体和树突（图。​（图44A类). AKAP79和（1–153）的树突状定位以树突状棘上的点状富集为特征（图。​（图44A类)，其中可以看到与F-actin或PSD-95的共定位（图。​（图44B类). 通过AKAP79的平均棘/轴归一化平均荧光比高30-50%（1.55±0.1；n个=10）和（1-153）–GFP（1.33±0.03；n个=13）仅相对于GFP（1.05±0.06；n个=11），表明树突棘和树干之间分布均匀。这些发现表明，N-末端基本结构域足以将AKAP79靶向海马神经元的树突状棘。

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图4。

AKAP79 N末端基本结构域靶向海马神经元的树突状棘。A类，靶向AKAP79–GFP和N末端基本结构域（1–153）–GFP，但不单独靶向GFP（均在绿色)转染神经元的树突状棘。B类AKAP79–GFP和（1–153）–GFP的克隆化绿色)含F-actin和PSD-95（两者红色)树突棘上。有关定量和详细信息，请参见结果和材料与方法。

通过磷酸化和钙调素结合调节AKAP79靶向结构域与F-肌动蛋白的结合

AKAP79靶向结构域的三个基本区域包含丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点和结合Ca²⁺–CaM公司(Faux和Scott，1997年;Dell'Acqua等人，1998年). 我们之前已经表明在体外AKAP79（1–153）靶向结构域与PI-4,5-P的结合₂受PKC磷酸化和钙调节²⁺–CaM绑定(Dell'Acqua等人，1998年). 因此，AKAP79靶向结构域和F-actin的结合也可能受到PKC和CaM的调节。与这些预期一致，AKAP79（1–153）与CaM在Ca存在下预孵育²⁺在共沉淀试验中抑制与F-actin的结合（图。​（图55A类). CaM的这种抑制作用是Ca²⁺依赖性且在缺乏钙的情况下未观察到²⁺加上螯合剂EGTA。同样与之前的工作一致，以前用PKC磷酸化（1–153）（很容易在电泳迁移率变化中看到）也抑制了F-actin的共沉积（图。​（图55B类). 对于MARCKS蛋白，效应域和Ca的PKC磷酸化²⁺–CaM结合，两者调节目标功能，相互竞争(阿德雷姆，1992年). 为了评估AKAP79的这种可能性，我们在钙的存在下用PKC磷酸化（1–153）²⁺–钙。钙显著抑制PKC磷酸化²⁺–CaM，但不是CaM和EGTA（图。​（图55C类). 这些发现表明，CaM与AKAP基本靶向结构域的结合阻止了对PKC磷酸化位点的访问。因此，在细胞中，磷酸化、多种CaM结合事件或通过三个基本区域作用的两个过程的某种组合可能调节AKAP79膜/细胞骨架相互作用，以响应Ca²⁺信号。

F-actin与磷酸化和钙调蛋白结合竞争调节AKAP79靶向结构域

因为F-actin结合、磷酸化和CaM结合都集中在相同的三个基本区域，所以当靶向结构域与细胞中的皮质肌动蛋白结合时，基本区域可能不容易进行磷酸化或CaM结合。这种情况可以解释为什么在以前的研究中PKC或CaM的活化从HEK-293膜组分中释放出很少AKAP79(Dell'Acqua等人，1998年). 为了从生物化学角度验证这个想法，我们改变了（1–153）靶向结构域与PKC或Ca的孵育顺序²⁺–CaM和F-actin。与上述结果一致，在控制条件下，大多数（1–153）用F-actin沉淀，（1–151）用PKC磷酸化或用Ca孵育²–与F-actin孵育前的CaM强烈抑制了这种沉积（图。​（图55D类). 相反，先前用F-actin孵育（1–153）显著减弱PKC或Ca的能力²⁺–CaM然后从F-actin中释放靶向结构域，如上清液和颗粒之间几乎相等的分布所示（图。​（图55D类). 总的来说，这些发现有助于确认介导膜靶向和PI-4,5-P的相同基本区域₂结合还调节与F-肌动蛋白的相互作用。

谷氨酸对树突F-肌动蛋白和AKAP79/150突触后靶向的调节

根据观察，AKAP79靶向可能受到钙离子的调节²⁺信号和肌动蛋白聚合，我们想看看AKAP79/150的突触后定位是否能被升高Ca的神经元信号通路调节²⁺重组树突状肌动蛋白细胞骨架。我们用50μ米谷氨酸作用10分钟，然后固定并染色，以可视化AKAP79/150相对于F-actin、PSD–MAGUK（包括PSD-95和SAP97；pan-PSD–MAGU抗体）和突触蛋白的定位（图。​（图6）。6). 对海马神经元进行类似的谷氨酸处理已被证明可以刺激AMPA受体的快速内吞和树突状F-actin的重组(Halpain等人，1998年;卡罗尔等人，1999b;Lissin等人，1999年;Beattie等人，2000年;Zhou等人，2001年). 与早期的研究一致，谷氨酸暴露导致树突中F-actin的重组，表现为树突棘上F-actin点的丢失和沿树突轴的肌动蛋白丝染色增加（图。​（图66A类) (Halpain等人，1998年). 同样与之前的工作一致，谷氨酸治疗并没有显著改变突触后MAGUK的点状分布（图。​（图66B类)或突触素标记的突触前终末（图。​（图66C类) (Halpain等人，1998年). 谷氨酸处理还导致AKAP79/150的急剧重新分布，表现为体细胞性点状突起消失，树突轴染色弱且弥散，胞质荧光增强（图。​（图66A类). AKAP79/150从树突定位到体细胞的这种转变反映在树突荧光降低（D/T=89±2%对照，n个= 6; D/T=56±4%谷氨酸，n个=5）和增加的体细胞荧光（S/T=131±6%对照；S/T=175±7%谷氨酸），可以一起表示为平均树突状荧光与体细胞荧光的比率降低（D/S=69±4%对照；D/S=32±2%谷氨酸）。重要的是，这种谷氨酸刺激的AKAP79/150重新分布导致与PSD–MAGUK失去共定位（图。​（图66B类)（见下文）和突触蛋白（图。​（图66C类).

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图6。

谷氨酸对海马神经元中AKAP79/150突触后定位和树突状棘F-actin的调节。A类海马神经元对谷氨酸的反应中AKAP79/150的重新分布和树突状F-actin的重组。B类谷氨酸处理后AKAP79/150与突触后PSD-95家族MAGUK支架的共定位丢失。C类突触素标记的突触前终末附近AKAP79/150定位的谷氨酸调节。使用（+）或不使用（−）谷氨酸（50μ米)AKAP150染色前(红色)、F-肌动蛋白-指骨样蛋白、PSD-95家族成员（包括PSD-95和SAP97）或突触蛋白（均在绿色). 所示图像代表了在每种情况下的多个（>3）实验中拍摄的神经元图像。

NMDA受体激活对AKAP79/150突触后定位的调节

树突状棘F-actin的重组和AMPA受体的内吞都可以由NMDA或AMPA受体单独激活触发(Halpain等人，1998年;Carroll等人，1999b;Beattie等人，2000年;Lin等人，2000年;Man等人，2000年;Zhou等人，2001年). 然而，为了调节海马LTD的一些重要形式，Ca²⁺通过NMDA受体的流入被认为是关键的信号事件。与之前的研究一致，作为NMDA受体调节AMPA受体的阳性对照，NMDA治疗明显干扰了GluR1与PSD-95的树突状共定位（图。​（图77A类). 如上所示，在未经处理的神经元中，AKAP79/150与PSD-95（PSD_有限公司= 64 ± 3%;n个=6），谷氨酸处理导致AKAP79/150从树突快速重新分布（D/S=32±2%），表现为与PSD-95（PSD）失去树突共定位_有限公司= 8 ± 3%;n个=5）（图。​（图77B类,C类). 在EGTA存在下短暂预培养神经元以螯合细胞外钙²⁺主要阻止谷氨酸刺激的AKAP79/150从树突中重新分布（D/S=69±4%），并保持与PSD-95（PSD）的共定位_有限公司= 56 ± 5%;n个=5）（图。​（图77C类). 与钙的主要作用一致²⁺在这种反应中，通过NMDA受体内流，谷氨酸刺激的AKAP79/150重新分布被NMDA受体拮抗剂AP-V（100μ米; D/S=65±6%；屏蔽门_有限公司= 62 ± 4%;n个=6），添加AMPA受体拮抗剂CNQX（50μ米; D/S=63±2%；屏蔽门_有限公司= 67 ± 8%;n个=3）（图。​（图77B类,C类). 此外，50μ米NMDA足以引起AKAP79/150从突触后特化的重新分布（D/S=40±4%；PSD_有限公司= 7 ± 2%;n个=7）以AP-V敏感方式（D/S=64±4%；PSD_有限公司= 58 ± 3%;n个=12）（图。​（图77B类,C类). 因此，我们的结论是NMDA受体的激活对于钙的激活是必要的和充分的²⁺-调节AKAP79/150定位到突触后位点的依赖性信号通路。

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图7。

NMDA受体激活对AKAP79/150突触后定位的调节。A类，GluR1 AMPA-受体缺失(红色)与PSD-95的树突状共定位(绿色)在NMDA处理的神经元中。B类，AKAP79/150损失(红色)与PSD-95共定位(绿色)谷氨酸或NMDA处理的神经元。用谷氨酸（50μ米)或NMDA（50μ米). NMDAR拮抗剂AP-V（100μ米，预处理15分钟）。大型面板在树突和胞体中分别显示AKAP150和PSD-95定位。这个放大倍率面板显示AKAP150、PSD-95和混合成的用于在单个树枝晶中定位的图像，以更好地显示细节。C类，树突和体细胞之间AKAP79/150平均荧光强度分布的定量(%D/S公司,红色)以及与PSD-95集成的协同定位(屏蔽门_有限公司,蓝色)通过多次实验确定B类以及下面描述的其他条件。有关更多详细信息，请参阅结果、材料和方法。细胞外钙的螯合作用也阻断了AKAP79/150靶向性的谷氨酸调节²⁺带EGTA（5 m米). 在存在谷氨酸和AP-V的情况下，AMPAR拮抗剂CNQX（50μ米，预处理15分钟）。50μA选择性激活AMPA受体米AMPA（存在100μ米AP-V）虽然对AKAP79/150突触后定位有一定影响，但并没有像NMDA或谷氨酸那样导致显著的重新分布（数据未显示）。NMDAR拮抗剂AP-V（100μ米，预处理15分钟）。

激活磷酸酶钙调神经磷酸酶而非蛋白激酶是调节AKAP79/150靶向NMDA受体所必需的

钙的一个潜在重要靶点²⁺树突状棘F-actin的NMDA受体调节和AMPA受体定位涉及的内流是Ca²⁺-活性磷酸酶CaN-PP2B(Halpain等人，1998年;Beattie等人，2000年;埃勒斯，2000). CaN刺激树突状棘F-actin重塑可能在调节AKAP79/150细胞骨架连接（维持其在突触处）中发挥积极作用。与此假设一致，CsA对CaN的抑制作用（D/S=47±4%；PSD_有限公司= 46 ± 4%;n个=8）或FK506（D/S=50±3%；PSD_有限公司= 55 ± 3%;n个=9）与未经治疗相比，主要阻止了NMDA调节的AKAP79/150重新分布（对照组D/S=57±3%；PSD_有限公司= 61 ± 2%;n个=14）和NMDA处理的细胞（NMDA D/S=37±3%；PSD_有限公司= 4 ± 1%;n个=10）（图。​（图88A类,B类). 雷帕霉素对NMDA处理的细胞没有影响，雷帕霉素是一种与CsA和FK506等免疫亲和素结合但不抑制CaN的药物（数据未显示）。重要的是，CaN直接锚定在AKAP79/150上，因此可能处于最佳位置以参与对NMDA受体激活的突触后肌动蛋白细胞骨架的调节。然而，NMDA受体Ca²⁺信号也可以激活激酶，如PKC、CaMKII和PKA（通过Ca²⁺-调节腺苷酸环化酶）。此外，前面的工作和研究表明，AKAP79靶向结构域的PKC磷酸化可以调节PI-4,5-P₂和F-actin结合在体外（图。​（图5）5) (Dell'Acqua等人，1998年). 然而，与对磷酸酶而非激酶的依赖性一致，NMDA介导的AKAP79/150再分布对白屈菜红素-CHE抑制PKC不敏感（D/S=34±3%；PSD_有限公司= 5 ± 2%;n个=5），CaMKII与KN-62（D/S=29±2%；PSD_有限公司= 5 ± 1%,n个=3），或PKA与H-89（D/S=33±3%；PSD_有限公司= 5 ± 2%;n个=4）（图。​（图88B类).

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图8。

蛋白磷酸酶-2B钙调神经磷酸酶的激活和F-actin的重组是NMDA受体调节AKAP79/150突触后定位所必需的。A类，CaN的激活和F-肌动蛋白的重组是NMDA调节AKAP79/150定位所必需的。神经元未经治疗或用指定的CaN–PP2B磷酸酶抑制剂CsA（1μ米，30分钟）或FK506（1μ米，30分钟），肌动蛋白稳定药物茉莉酮内酯（2μ米或NMDA受体拮抗剂AP-V（100μ米，30分钟）米，10分钟）。然后固定神经元，并对其进行AKAP79/150染色(红色)和PSD-95(绿色).大型面板在树突和胞体中分别显示AKAP150和PSD-95定位。这个放大倍率面板显示AKAP150、PSD-95和混合成的用于在单个树突中定位的图像，以更好地显示细节。B类钙调磷酸酶而非蛋白激酶活性是NMDA调节AKAP79/150定位所必需的。树突和体细胞之间AKAP79/150平均荧光强度分布的定量(%D/S公司,红色)以及与PSD-95集成的协同定位(屏蔽门_有限公司,蓝色)通过多次实验确定A类以及下面描述的附加条件。有关更多详细信息，请参阅结果、材料和方法。神经元也用指示的PKA激酶抑制剂H-89（500 n）预处理30 min米); PKC、CHE（10μ米); 或CaMKII，KN-62（5μ米)NMDA治疗前（50μ米，10分钟）。酪蛋白激酶II抑制剂（DRB，50–100μ米)或多种激酶抑制剂（H-89、CHE、KN-62、DRB）对NMDA处理的细胞中AKAP150的再分配没有影响（数据未显示）。

树突状棘F-actin的重组是NMDA受体调节AKAP79/150突触后定位的必要条件

CaN调节的F-actin重塑的NMDA受体激活肯定可以控制AKAP79/150的定位，如上所示，通过latrunculin阻断AKAP79/120突触后靶向性抑制肌动蛋白聚合（图。​（图2）。2). 然而，尽管F-actin重组伴随着谷氨酸或NMDA处理后AKAP79/150的重新分布（图。​（图66A类)（数据未显示），在这些实验中，AKAP似乎并不与F-actin直接运动。尽管如此，根据NMDA受体激活进行的肌动蛋白重塑可能是必要的第一步，使AKAP从PSD释放，并在膜外进行二次再分配（见下文）。为了测试F-actin的重组是否真的对NMDA受体调节的AKAP79/150的再分配是必要的，我们用茉莉糖苷预处理神经元，茉莉糖甙是一种稳定F-actin丝并阻止NMDA诱导的树突状棘F-actin重组的药物(Halpain等人，1998年). 预防用茉莉花苷内酯预处理2小时（D/S=59±3%；PSD_有限公司= 46 ± 4%;n个=7）NMDA介导的AKAP79/150从PSD-95的重新分布（D/S=37±3%；PSD_有限公司= 4 ± 1%;n个=10），类似于对CaN的抑制（见上文），并且几乎与AP-V的受体阻滞（D/S=64±4%；PSD_有限公司= 58 ± 3%;n个=12）（图。​（图88A类,B类). 因此，F-actin对CaN激活的反应重构可能会将AKAP79/150靶向结构域从突触后细胞骨架中解封。这些结果加上对激酶抑制的不敏感性，与F-actin重组使靶向结构域可用于后续Ca的模型最为一致²⁺–CaM粘结（图。​（图55D类). CaM结合可介导AKAP79/150从质膜的二次再分配，并阻止NMDA受体激活后与树突状F-actin的再结合。不幸的是，这种预测的AKAP79/150易位中CaM结合的二次参与不能用CaM抑制剂进行研究，因为它们也抑制CaN活化。

肌动蛋白聚合抑制和NMDA受体激活均调节AKAP79/150-PKA复合物与PSD–MAGUKs的关联

上述免疫细胞化学研究表明，肌动蛋白聚合的抑制和NMDA受体的激活都会导致突触AKAP79/150的丢失，表明与PSD–MAGUK复合物分离。为了独立证实AKAP79/150–MAGUK复合物的分解，我们从用latrunculin或NMDA处理的神经元制备的细胞提取物中免疫沉淀AKAP79/150，并通过免疫印迹分析免疫沉淀中的AKAP150、PSD–MAGUKs（泛PSD–MAGUK抗体）和PKA-RIIβ亚基。从未处理的对照神经元和latrunculin或NMDA处理的神经元制备的细胞提取物中，AKAP79/150、PSD–MAGUKs和PKA-RIIβ的水平基本相同，表明这些蛋白质没有因处理而显著的蛋白水解损失（图。​（图99A、 B类). 在来自对照组和latrunculin或NMDA处理的神经元的AKAP150免疫沉淀物中检测到大约等量的AKAP15和PKA-RIIβ，表明这些处理后AKAP-PKA复合体仍然完好无损（图。​（图99A类,B类). 相反，PSD–MAGUK蛋白很容易与来自对照神经元的AKAP150共沉淀，但在latrunculin或NMDA处理的神经元的AKAP 150沉淀物中无法检测到（图。​（图99A类,B类)即使长时间曝光（数据未显示）。因此，由latrunculin治疗或NMDA受体激活引起的F-actin重组不仅导致免疫细胞化学观察到的AKAP79/150亚细胞靶向性的改变，还导致生化检测到的AKAP–MAGUK复合物的破坏。AKAP–MAGUK复合物的破坏反过来会破坏AKAP79/150与谷氨酸受体的连接。虽然我们无法通过共沉淀直接解决这个问题，因为从培养的神经元中提取了少量提取物，但我们的免疫细胞化学支持这一预测。Latrunculin A和NMDA都会触发AKAP79/150的丢失，以及GluR1与PSD-95的共定位，但GluR1s仍然呈点状，与向内体的转运一致(埃勒斯，2000)而AKAP79/150则变得更加分散和无目标（图。​（图22,​,77).

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图9。

通过抑制肌动蛋白聚合和NMDA受体活化，调节AKAP79/150-PKA与PSD–MAGUKs的关联。A类，用latrunculin A抑制F-actin聚合会破坏AKAP79/150与PSD–MAGUK的关联，但不会破坏从海马神经元细胞提取物分离的复合物中PKA的关联。B类NMDA受体激活破坏AKAP79/150与PSD–MAGUK的关联，但不破坏从海马神经元细胞提取物分离的复合物中PKA的关联。培养板上高密度生长的神经元要么未经治疗，要么用latrunculin A治疗(+中校A; 5 μ米，4小时）(A类)或NMDA（50μ米，10分钟）(B类)在收获和分解以制备全细胞提取物之前。然后免疫沉淀AKAP79/150(IP：阿卡普150)从这些提取物制备的Triton X-100可溶组分中提取。然后用免疫印迹法分析免疫沉淀物和全细胞提取物(国际银行：)用于AKAP150、PSD-MAGUK家族成员和PKA-RIIβ调节亚单位，如图所示。所示数据代表了在每种条件下对两到四个样品进行的三次实验。

AKAP79/150和AMPA受体突触定位的类似机制

有趣的是，我们阐明的AKAP79/150的靶向机制与其他人研究的AMPA受体的靶向机理非常相似，AMPA受体可以通过SAP97与AKAP连接(Colledge等人，2000年). 例如，AKAP79/150和AMPA受体突触后定位均通过用latrunculin抑制肌动蛋白聚合而被破坏，并通过用茉莉花内酯稳定F-肌动蛋白而被维持(Allison等人，1998年,2000;Shen等人，2000年;Zhou等人，2001年). AMPA–GluR1和SAP97都与4.1N/G-actin结合蛋白结合，提供了与细胞骨架的可能联系(Lue等人，1994年,1996;Wu等人，1998年;Shen等人，2000年). 然而，我们的研究结果表明，AKAP79/150可能为SAP97–GluR1复合物提供脊椎肌动蛋白的另一个附着点。重要的是，在LTP期间，AMPA受体向突触募集以响应NMDA受体和CaMKII激活需要SAP97识别的GluR1 C末端PDZ结合位点(Leonard等人，1998年;Hayashi等人，2000年;Passafaro等人，2001年;Shi等人，1999年,2001)以及F-actin(Kim和Lisman，1999年;Krucker等人，2000年). 因此，AKAP79/150与F-actin和SAP97结合可能在AMPA–GluR1受体的突触传递中发挥作用，这一过程似乎与PKA磷酸化有关(埃勒斯，2000;Lee等人，2000年).

AKAP79/150还通过PSD-95与NR2A/B结合与NMDA受体相连(Colledge等人，2000年). 然而，尽管PSD-95和NMDA受体也与肌动蛋白细胞骨架有关，但PSD-95与NMDA受体的突触定位并不需要F-actin，也不受谷氨酸的快速调节(Allison等人，1998年,2000;卡罗尔等人，1999b;Lissin等人，1999年). 尽管如此，AKAP79/150与PSD-95的复合物不仅对调节NMDA受体，而且对附近的AMPA受体的调节也很重要，这与SAP97的连接无关。事实上，虽然NMDA受体定位正常，但缺乏功能性PSD-95的小鼠表现出异常的海马突触可塑性，其特征是LTP增强而无LTD，这表明与AMPA受体调节通路的耦合发生改变(Migaud等人，1998年). PSD-95调节AMPA受体定位的一种方式是通过PDZ与AMPA受体相关的Stargazin结合(Chen等人，2000年;El-Husseni等人，2000b). 因此，AKAP79/150支架也可能通过PSD-95与AMPA受体相连。