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同行J。2019; 7:e7456。
2019年9月10日在线发布。 数字对象标识：10.7717/同行7456
预防性维修识别码：PMC6743450型
PMID：31565549

lncRNA TMEM51-AS1和RUSC1-AS1作为ceRNAs在喉鳞癌诱导和预后预测中的作用

连辉,1 王静（音译）,1 张嘉良,1和金龙通讯作者2
学术编辑：薛芬娟
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

背景

长非编码RNAs（lncRNAs）可以作为竞争性内源性RNAs与miRNAs相互作用，调节靶基因，促进癌症的发生和发展。lncRNAs和miRNAs的表达可以通过表观遗传调控。本研究的目的是在喉鳞状细胞癌（LSCC）中构建一个lncRNA-miRNA-mRNA-ceRNA网络，并揭示其甲基化模式，这是以前没有研究过的。

方法

基因表达综合数据库中的微阵列数据集用于识别LSCC和对照组之间差异表达的lncRNA（DEL）、miRNAs（DEM）和基因（DEG），然后与差异甲基化区域（DMR）重叠。通过相应的数据库筛选miRNA和lncRNA/mRNA之间的相互作用关系，建立了ceRNA网络。TCGA数据库用于识别预后生物标志物。

结果

五种DEL（下调：TMEM51-AS1，SND1-IT1；上调：HCP5，RUSC1-AS1，LINC00324）和无DEM与DMR重叠，但TMEM51-AS1的表达和甲基化水平仅呈负相关。5个DEL可与11个DEM相互作用，调节242个DEG，用于构建ceRNA网络，包括TMEM51-AS1-miR-106b-SNX21/TRAPPC10、LINC00324/RUSC1-AS1-miR-16-SPRY4/MICAL2/SLC39A14、RUSC1-AS1-miR-10-SCG5和RUSC1-ASC1-miR-7-ZFP1 ceRNAs轴。单变量Cox回归分析显示RUSC1-AS1和SNX21与总生存率（OS）相关；LINC00324、miR-7和ZFP1与无复发生存率（RFS）相关；miR-16、miR-10、SCG5、SPRY4、MICAL2和SLC39A14均与OS和RFS相关。此外，通过多变量Cox回归分析，TRAPPC10和SLC39A14被确定为独立的OS预后因素。

结论

DNA甲基化介导的TMEM51-AS1和非甲基化介介导的RUSC1-AS1可能作为ceRNAs诱导LSCC。它们及其ceRNA轴基因（尤其是TMEM51-AS1-miR-106b-TRAPPC10；RUSC1-AS1-miR-16-SLC39A14）可能是LSCC潜在的重要预后生物标志物。

关键词：喉鳞癌，长非编码RNA，Micrornas，竞争性内源性RNA，预后

引言

喉鳞状细胞癌是上呼吸道常见的恶性肿瘤之一，与环境恶化和职业压力增加有关。据估计，2017年美国诊断出13360例新病例，其中超过3660例死亡(Siegel、Miller和Jemal，2017年)。在中国，2015年估计还发生了26400例新的LSCC病例和14500例与癌症相关的死亡病例(Chen等人，2016)。尽管LSCC患者可以通过手术干预、放射治疗和化疗进行治疗，但总的五年生存率仍然很低（约60%）(鲁道夫等人，2011年)。因此，迫切需要深入了解LSCC致癌或进展的分子机制，以制定更有效的治疗策略。

越来越多的证据表明，非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。ncRNA大致分为小ncRNA和长非编码RNA（lncRNAs），它们在各种生物过程中都具有调节功能。有充分记录的小ncRNAs是microRNAs（miRNAs；～22个核苷酸长），通过与3′非翻译区（UTR）的互补序列结合来调节基因表达，导致翻译抑制或转录物降解(Jean&Mihaela，2014年)。尽管机制尚不清楚，但越来越多的证据支持，lncRNAs可以通过其miRNA反应元件（MRE）与miRNAs竞争性结合，从而发挥竞争性内源性RNAs（ceRNAs）的作用，并随后调节靶RNA的表达(Salmena等人，2011年)。这种ceRNA机制在解释许多恶性肿瘤（如胃癌）的发展和进展方面引起了很大的兴趣(Song等人，2018年)，甲状腺癌(赵等，2018)和肝母细胞瘤(刘等人，2017a)。最近的研究也初步揭示了LSCC中几种潜在的ceRNA调控相互作用。荧光素酶报告试验和Western印迹结果表明AC026166型.2-001可作为miR-24-3p的海绵，调节p27和cyclin D1的表达(沈等，2018)。lncRNA H19被证明是通过海绵miR-148a-3p来上调靶基因DNA甲基转移酶1来充当ceRNA(Wu等人，2016)。据报道，NEAT1通过调节miR-107来调节细胞周期蛋白依赖性激酶6的表达(Wang等人，2016年)。此外，基于对LSCC中6对临床样本的微阵列分析，还构建了包括30个基因、21个miRNA和19个lncRNA的ceRNA网络(Zhang等人，2016年)。然而，对样本量较大的LSCC的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的分析以及对其临床相关性的确认仍然缺乏。

此外，DNA甲基化已被确定为表观遗传学调节癌细胞基因表达的重要机制，它不仅调节蛋白质编码基因的表达，还影响miRNA和lncRNA。例如，观察到启动子区域的超甲基化导致母体表达基因3（MEG3）的lncRNA表达缺失。下调的MEG3不足以海绵化miR-9并阻断其对E-cadherin和FOXO1表达的抑制作用，从而导致食管鳞癌患者预后不良(Dong等人，2017年)。研究郭等人（2018a）也提示lncRNA CTC-276P9.1在食管鳞癌中是高甲基化的。CTC-276P9.1过度表达抑制癌细胞增殖和侵袭在体外可能是通过调节上皮-间充质转化。廖等（2015）使用一个免费的甲基Cap-seq数据集，在结直肠癌中鉴定出761个具有DNA超甲基化的lncRNA基因。Cheung&Lee（2010）发现三个miRNAs（即miR-199a-2、miR-124a-2和miR-184）的基因座与人类睾丸癌中的高甲基化差异甲基化区域（DMR）相关。然而，在LSCC中，miRNAs和lncRNAs的DNA甲基化调控机制鲜有报道。

本研究的目的是使用较大样本在LSCC中建立lncRNA-miRNA-mRNA-ceRNA网络，并研究其甲基化模式。我们的研究结果可能为生物学家进一步了解LSCC的发病机制提供新的线索。

材料和方法

数据来源

从基因表达综合数据库（GEO）检索lncRNA、miRNA、mRNA和甲基化数据(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)2018年1月，根据以下纳入标准：（1）lncRNA、miRNA、mRNA表达或甲基化谱；（2） 喉组织样本，而非血液、间质液或细胞；（3） 纳入控制；（4） 人体样本；（5）LSCC患者。

根据登录号获得了两个lncRNA微阵列数据集GSE59652标准（7个LSCC和7对相邻正常组织）(沈等，2014)和GSE84957型（9个LSCC和9对相邻非肿瘤组织）(Feng等人，2016年)。微阵列平台GSE59652标准和GSE84957型是Agilent-033010(GPL13825型，Arraystar人类LncRNA微阵列V2.0）和Agilent-042818(GPL17843公司，Agilent-042818 Human lncRNA Micorarray 8_24_v2）。

以登录号收集了两个miRNA微阵列数据集GSE70289标准（12个LSCC组织和4个相邻正常组织）(Karatas等人，2015年)和GSE62819标准（5个LSCC癌和5对相邻非肿瘤组织）。微阵列平台GSE70289标准和GSE62819标准是Agilent-031181(GPL15018标准，Unrestricted_Human_miRNA_V16.0_Microarray 030840）和Affymetrix多物种miRNA-3阵列(GPL16384公司)分别是。

有四个mRNA微阵列数据集可用于登录号1985年5月（10个LSCC和10对相邻正常组织），GSE84957型（9个LSCC和9个配对的相邻正常组织）(Feng等人，2016年),GSE59102标准（29个LSCC和13个正常边缘组织）和GSE58911标准（15个LSCC和15个远离LSCC的正常组织）(Sharon等人，2015年)。微阵列平台GSE51985标准,GSE84957型,GSE59102标准和GSE58911标准是Illumina HumanHT−12 V4.0(GPL10558号)，安捷伦-042818(GPL17843公司，人类lncRNA微阵列8_24_v2），Agilent-014850(GPL6480型、全人类基因组芯片4x44K G4112F）和Affymetrix人类基因1.0 ST阵列(GPL6244型)分别是。

一组DNA甲基化数据是在登录号下获得的GSE25093标准(Poage等人，2012年;Poage等人，2011年)其中包括213份血液和109份组织样本。在109份组织样本中，56份来自口腔，16份来自咽部，22份来自喉部，15份来源不明。因此，我们的研究仅使用了这22个喉源性样本（15个喉鳞癌组织和7个对照）。基因芯片平台GSE25093标准是Illumina HumanMethylation27珠片(GPL8490标准，人类甲基化27_270596_v.1.2）。

头颈部鳞状细胞癌（3级）的mRNA和miRNA Seq数据也从癌症基因组图谱（TCGA；网址：https://tcga-data.nci.nih.gov/)。样本条码筛选后，559份miRNA-mRNA匹配样本，其中18份分布于牙槽嵴，30份分布于舌根，22份分布于口腔粘膜，67份分布于口底，8份分布于硬腭，9份分布于喉，138份分布于喉咙，3份分布于唇部，38份分布于口腔镜，156份分布在舌，10份分布在口咽，扁桃体45例，位置不明15例。我们的研究仅使用了138个喉标本。

数据预处理

对于来自Affy平台的数据，CEL中的原始数据。使用oligo包（版本1.41.1；卡瓦略和伊里扎里，2010)在R中（版本3.4.1；R开发核心团队，2017年)包括数据转换、中值缺失值插补、MAS方法背景校正和分位数归一化。

对于来自安捷伦和Illumina平台的数据，TXT中的原始数据。使用微阵列数据线性模型（LIMMA）包（3.34.0版）对文件进行预处理；Ritchie等人，2015年)在R中，包括数据log2转换和中值归一化。

使用预处理核心包（版本1.40.0；博尔斯塔德，2019年)在R中。

差异表达分析

使用LIMMA方法从LSCC和正常对照组的两个微阵列数据集（lncRNA：GSE59652标准和GSE84957型; miRNA:gSE70289和GSE62819标准)。这个第页-以值<0.05和|logFC（折叠变化）|>0.263为截止点。上述两个数据集的重叠部分分别用于以下lncRNAs和miRNAs分析。

使用MetaDE鉴定了LSCC和正常对照之间的差异表达基因（DEG）。MetaDE包中的ES功能（版本1.0.5，https://cran.r-project.org/web/packages/MetaDE/)来自其四个包含的微阵列数据集的R(GSE51985标准,GSE84957型,GSE59102标准和GSE58911标准)。这个第页-以值<0.05和假发现率（FDR）<0.05为分界点。具有相同表达趋势的DEG（tau2统计=0，第页-在四个数据集中，选择基于齐方检验的Q值>0.05）进行以下分析。

Wilcoxon签名等级测试(http://www.bioconductor.org/help/search/index.html？q=wilcox.test网站/)用于筛选LSCC和正常对照之间的DMR。P（P）设定<0.05为阈值。人类注释数据取自GENCODE Release 19（GRCh37.p13）(https://www.gencodegenes.org/human/release_19.html（网址：https://www.gencodegenes.org/human/release_19.html）)。相应平台中miRNAs、lncRNAs和mRNAs的序列GPL8490标准用GRCh37.p13爆破，获得差异甲基化的miRNA、lncRNA和mRNA，然后将其与DEL、DEM和DEG重叠，分别筛选甲基化的相关DEL、DEM和DEG。

CeRNA调控网络构建

三个可靠的在线数据库，包括miRcode（版本11；http://www.mircode.org/)，starBase（版本2.0；http://starbase.sysu.edu.cn/index.php) (Li等人，2014)和DIANA-LncBase（版本2.0；http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php？r=lncbasev2/index-预测的) (Paraskevopoulou等人，2013年)用于筛选lncRNAs和miRNAs之间的相互作用。这三个数据集的结合用于以下分析。使用四种常用算法，包括TargetScan（7.2版；http://www.targetscan.org/vert_71/) (Agarwal等人，2015年)，miRBase（版本22；https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/) (Griffithsjones等人，2005年)，miRanda（版本1.9；http://www.microrna.org/microrna/home.do/) (John等人，2005年)和miRTarBase（7.0版；http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php) (Chou等人，2017年)。保留了至少两个数据库预测的靶基因以及与miRNAs的负相关。利用Cytoscape软件（3.4版；Shannon等人，2001-2008) (科尔、威斯和华夏出版社，2011年).

功能充实分析

注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）在线工具（版本6.8；http://david.abcc.ncifcrf.gov) (Da，Sherman&Lempicki，2009年)用于基因本体（GO）术语[包括分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞成分（CC）类别]以及ceRNA网络中基因的京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径富集分析。P（P）-以<0.05为截止值。

ceRNA网络中lncRNAs、miRNAs和mRNAs的临床相关性

从TCGA数据下载ceRNA网络中lncRNAs、miRNAs和mRNAs的表达水平。使用生存软件包（版本2.40.1；https://cran.r-project.org/package=生存)根据lncRNA、miRNA和mRNA的表达将样本分为两组：低表达组（<中位数）和高表达组（>中位数）。Kaplan–Meier方法和对数秩检验用于估计高表达组和低表达组之间OS和RFS的差异。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。此外，还使用生存数据包（版本2.40.1；Therneau&Lumley，2019年)评估lncRNAs、miRNAs和mRNAs的预后独立性。使用多元线性回归模型分析预测相关ceRNA网络中节点与其他临床特征的关联(https://stat.ethz.ch/R-manual/R-patched/library/stats/html/lm.html)在R中。

结果

差异表达分析

数据分析工作流显示在图1.数据规范化后(补充信息1——8)根据规定的阈值筛选LSCC和正常样本之间的DEL、DEM和DEG。结果显示，在以下数据集中发现了306个（156个下调和150个上调）和396个（252个下调和144个上调）DELGSE59652标准(图2A)和GSE84957型(图2B) (补充信息9)分别是。经过比较，发现这两个数据集中共有40个DEL，其中6个上调，20个下调，表达趋势一致(图3A) (补充信息9); 数据集中共发现1307个（765个下调，542个上调）和491个（126个下调，365个上调）DEM邮编62819(图2C)和GSE70289标准(图2D)分别为(补充信息9)。经过比较，发现这两个数据集中共有443个DEM，其中152个上调DEM和63个下调DEM的表达趋势一致(图3B) (补充信息9); 2975个DEGs在四种mRNA表达谱中显示出类似的表达趋势GSE51985标准,GSE84957型,GSE59102标准和GSE58911标准(图2E) (补充信息9)；在LSCC基因组中鉴定出4567个DMRGSE25093标准数据集，包括1616个低甲基化和2951个高甲基化(图2F) (补充信息9)。经过GENCODE注释和blast分析，在DMR中发现122个lncRNAs，但没有发现miRNAs。随后，将DMR中的lncRNAs和mRNAs与上述表达水平数据重叠，以获得甲基化相关的DEL和DEG。因此，筛选了五种DEL（TMEM51-AS1、HCP5、SND1-IT1、RUSC1-AS1和LINC00324）(图3C)。在这些DEL中，只有lncRNA TMEM51-AS1的表达和甲基化水平(图3D——3英尺)相反，表明其表达可能受甲基化调控。这些甲基化相关基因被用于构建ceRNA网络。

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数据分析工作流。
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层次聚类和热图分析。

识别的差异表达lncRNA的（A–B）热图GSE59652标准（A） 和GSE84957型（B） 数据集；（C–D），在GSE62819标准（C） 和GSE70289标准（D） 数据集；（E） 通过meta分析确定差异表达基因的热图GSE51985标准,GSE84957型,GSE59102标准和GSE58911标准数据集；（F） 中确定的差异甲基化区域的热图GSE25093标准数据集。从基因表达综合数据库收集的喉鳞状细胞癌数据集。红色，高表达（高甲基化）；绿色，低表达（低甲基化）。

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重叠基因鉴定。

Venn图显示了从基因表达综合数据库收集的喉鳞状细胞癌不同数据集中差异表达的lncRNA（A）和miRNA（B）的重叠，以及它们与差异甲基化区域（C）的重叠，以筛选甲基化相关的lncRNA和miRNA。重叠lncRNA的表达（D–E）和甲基化（F）水平以直方图显示。∗第页 < 0.05;**第页 < 0.01;∗∗∗第页 < 0.001. 反调节：lncRNAs或miRNAs在两个数据集中的表达趋势不同。上调或下调：lncRNAs或miRNAs在两个数据集中表现出类似的表达趋势，高表达或低表达。

CeRNA网络构建

使用miRcode、starBase和DIANA-LncBase数据库预测了5个DEL和14个DEM之间的20对相互作用(表1)。DEL和DEM的表达趋势相反。随后，使用四种算法预测了这14个DEM的目标基因，得到的交互对分别为TargetScan中的700对、miRBase中的486对、miRanda中的341对和miRTarBase中的268对。由于至少两个数据库的预测以及它们之间的负关联，最终总共留下了404个交互对。DEL和DEM之间以及DEM和DEG之间的这些相互作用对用于构建ceRNA网络，该网络包含258个节点（5个DEL、11个DEM和242个DEG）(图4)。在该网络中，TMEM51-AS1作为ceRNA通过海绵miR-106b调节SNX21（排序连接蛋白家族成员21）和TRAPPC10（转运蛋白颗粒复合物10）；LINC00324和RUSC1-AS1作为ceRNAs，通过海绵miR-16调节SPRY4（发芽RTK信号拮抗剂4）、PAWR（促凋亡WT1调节器）、MICAL2（微管相关单加氧酶、钙调素和LIM结构域包含2）和SLC39A14（溶质载体家族39成员14）；RUSC1-AS1通过竞争性结合miR-10调节SCG5（SCG5分泌粒蛋白V）和PRDM5（PR/SET结构域5）；RUSC1-AS1还通过与miR-7结合，充当ZFP1（ZFP1锌指蛋白）的ceRNAs；HCP5可与miR-143相互作用调节RRM2（核糖核苷酸还原酶调节亚单位M2）。

表1

lncRNA和miRNAs之间的相互作用关系。
lncRNA微小RNA
HCP5型hsa-miR-10、hsa-miR-16、hsa-milR-186、hsa-miR-214、hsa-miR-7、hsa-miR-641、hsa-micR-143、hsh-miR-4770、hsa-mitR-216b、hsa-minR-876
LINC00324（链接C00324）hsa-miR-143、hsa-miR-16、hsa-miR-214、hsa-micR-216b、hsa-milR-4770
俄罗斯1号机组-AS1hsa-miR-214、hsa-miR-10、hsa-miR-16、has-miR-216b、hsa-miR-7
TMEM51-AS1型hsa-miR-106b、hsa-miR-765
SND1-IT1系列hsa-miR-708、hsa-miR-4306
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喉鳞状细胞癌中lncRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源性RNAs（ceRNAs）相互作用网络。

（A） 上调lncRNAs、下调miRNAs和上调mRNAs之间的相互作用对；（B） 下调的lncRNAs、上调的miRNAs和下调的mRNAs之间的相互作用对。方形节点代表lncRNAs；三角形节点代表miRNAs；圆形节点代表mRNA。边缘代表lncRNAs、miRNAs和mRNAs之间可能的关联。红色，上调；绿色，下调。红线，lncRNAs和miRNAs之间的相互作用；灰色线，miRNA和mRNA之间的相互作用。

功能富集分析

对ceRNA网络中的DEG进行DAVID，以预测其在LSCC中的潜在功能。结果表明，17个显著的GO-BP术语得到了丰富，包括GO:0042981号～凋亡调节（PAWR），GO:0015031号蛋白转运（SNX21；SCG5）、细胞周期（PRDM5）和GO:0043407号～MAP激酶活性4（SPRY4）负调控。六条KEGG通路也得到了丰富，包括hsa05210：结直肠癌、hsa04210：凋亡和hsa05205：癌症中的蛋白聚糖(表2).

表2

ceRNA网络中基因的功能富集分析。
类别期限P（P）-价值基因
生物学过程 去：0006793～磷代谢过程0.00122STK38、SLC20A1、ERBB3、NUAK1、MKNK1、ABI1、PIP5K1A、TRIB1、MAP3K3、SRPK2、MINPP1、ADAM10、STK24、MSH2、PRKCI、PKN2、PTPN12、GAK、MAP4K4、MTMR11、MAPK6、GSK3B、DYRK1A、PTPN1、MAP3G14、ERC1、IKBKB、DUSP7
去：0006796～磷酸盐代谢过程0.00122STK38、SLC20A1、ERBB3、NUAK1、MKNK1、ABI1、PIP5K1A、TRIB1、MAP3K3、SRPK2、MINPP1、ADAM10、STK24、MSH2、PRKCI、PKN2、PTPN12、GAK、MAP4K4、MTMR11、MAPK6、GSK3B、DYRK1A、PTPN1、MAP3G14、ERC1、IKBKB、DUSP7
去：0006468蛋白质氨基酸磷酸化0.00498SRPK2、ADAM10、STK38、STK24、NUAK1、ERBB3、PRKCI、PKN2、MKNK1、ABI1、TRIB1、GAK、MAP4K4、MAPK6、MAP3K3、GSK3B、DYRK1A、IKBKB、ERC1、MAP3K14
GO:0016310号～磷酸化0.00801SRPK2、ADAM10、STK38、ERBB3、MSH2、STK24、NUAK1、PRKCI、PKN2、MKNK1、ABI1、PIP5K1A、TRIB1、GAK、MAP4K4、MAPK6、MAP3K3、GSK3B、DYRK1A、IKBKB、ERC1、MAP3K14
去：0008104～蛋白质定位0.01176STON2、SEC23A、XPO1、AP1M1、NUP160、PRKCI、CENPF、TMSB10、TRAM2、TAP2、GSK3B、NUP210、TAP1、PIKFYVE、SNX21、RAB23、SCG5、SUPT7L、SAR1B、RAB10、ERC1、KPNA2、KPNB1
GO:0043407号～MAP激酶活性负调控0.00991STK38、PTPN1、SPRY4、DUSP7
GO:0042981号细胞凋亡的调节0.0165DLC1、DPF2、IER3、ING3、SYVN1、ERBB3、MSH2、KLF10、PRKCI、AKAP13、CD70、PAWR、SOD2、TNFRSF10A、BAG4、TIAM1、GSK3B、GLO1、APBB2、IKB、MYC
GO:0043067号程序性细胞死亡的调节0.0181DLC1、DPF2、IER3、ING3、SYVN1、ERBB3、MSH2、KLF10、PRKCI、AKAP13、CD70、PAWR、SOD2、TNFRSF10A、BAG4、TIAM1、GSK3B、GLO1、APBB2、IKB、MYC
GO:0015031号～蛋白质转运0.0188STON2、SEC23A、XPO1、AP1M1、NUP160、PRKCI、CENPF、TRAM2、TAP2、GSK3B、NUP210、TAP1、SNX21、RAB23、SCG5、SAR1B、RAB10、ERC1、KPNA2、KPNB1
GO:0010941号调节细胞死亡0.0188DLC1、DPF2、IER3、ING3、SYVN1、ERBB3、MSH2、KLF10、PRKCI、AKAP13、CD70、PAWR、SOD2、TNFRSF10A、BAG4、TIAM1、GSK3B、GLO1、APBB2、IKB、MYC
GO:0045184号建立蛋白质定位0.0204STON2、SEC23A、XPO1、AP1M1、NUP160、PRKCI、CENPF、TRAM2、TAP2、GSK3B、NUP210、TAP1、SNX21、RAB23、SCG5、SAR1B、RAB10、ERC1、KPNA2、KPNB1
去：0008219～细胞死亡0.0211FUS、DPF2、DLC1、IER3、MICB、ERBB3、MSH2、AKAP13、RNF216、PAWR、ITPR1、SOD2、TNFRSF10A、BAG4、UNC5B、TIAM1、SIAH1、MYC、SPAST
GO:001033编号对有机物质的反应0.0217ADAM10、KAT2B、ERBB3、MSH2、KLF10、PRKCI、CALCOC2、APPL1、TRIB1、B2M、HDAC4、PRKAR2A、SDC1、HDAC2、ADM、TAP2、CTSC、PTPN1、MYC
GO:0016265号～死亡0.0225FUS、DPF2、DLC1、IER3、MICB、ERBB3、MSH2、AKAP13、RNF216、PAWR、ITPR1、SOD2、TNFRSF10A、BAG4、UNC5B、TIAM1、SIAH1、MYC、SPAST
GO:0044265号细胞大分子分解代谢过程0.0228ADAM10、SYVN1、USP1、RNH1、UBE2V2、RNF216、MYLIP、UBE2Q2、ZFP36L2、FBXW7、GMCL1、PSMD3、ZMPSTE24、SIAH1、PCYOX1、USP33、MYC、FBXO11、USP31
去：0007049～细胞周期0.0405E2F3、KAT2B、MSH2、PAPD7、CENPF、APPL1、GAK、SASS6、MAPK6、GSK3B、PRDM5、PSMD3、ZNF318、HBP1、SIAH1、APBB2、KPNA2、MYC、SPAST
去：0009057〜大分子分解代谢过程0.0427ADAM10、SYVN1、USP1、RNH1、UBE2V2、RNF216、MYLIP、UBE2Q2、ZFP36L2、FBXW7、GMCL1、PSMD3、ZMPSTE24、SIAH1、PCYOX1、USP33、MYC、FBXO11、USP31
KEGG途径hsa05210：结直肠癌0.0377MSH2、GSK3B、APPL1、MYC、FZD7
hsa04210：细胞凋亡0.0421TNFRSF10A、PRKAR2A、EXOG、IKBKB、MAP3K14
hsa00562：肌醇磷酸代谢0.0477MINPP1、TPI1、PIP5K1A
hsa05169:EB病毒感染0.00175POLR3F、XPO1、HDAC4、GTF2E2、HDAC2、GSK3B、PSMD3、MAP3K14、IKB、MYC
hsa05166:HTLV-I感染0.0122WNT5A、XPO1、E2F3、KAT2B、MAP3K3、GSK3B、MAP3G14、IKBKB、MYC、FZD7
hsa05205：蛋白质聚糖与癌症0.0267WNT5A、EIF4B、SDC1、TIAM1、ERBB3、MYC、FZD7、ITPR1

ceRNA网络中lncRNAs、miRNAs和mRNAs的临床相关性

在138个miRNA-mRNA匹配的TCGA数据样本中，114个具有OS，82个具有RFS信息。对138个样本进行单因素Cox回归分析表明，32个RNA与OS显著相关，包括1个DEL（RUSC1-AS1）、2个DEM（hsa-miR-16和hsa-miR-10）和29个DEG（即PAWR、SCG5、SPRY4、MICAL2、SNX21、TRAPPC10和SLC39A14）；而25个RNA与RFS相关，包括一个DEL（LINC00324）、三个DEM（hsa-miR-16、hsa-miR-10和hsa-miR7）和21个DEG（即PRDM5、SCG5、SPRY4、MICAL2和ZFP1）(表3)。单独提取OS和RFS相关的ceRNA网络，如图5A和​和5B5亿.

表3

ceRNA网络中与预后相关的lncRNAs、miRNAs和mRNAs。
总体生存率无复发生存
核糖核酸exp（系数）第页核糖核酸exp（系数）第页
微小RNAhsa-miR-160.5060.00048微小RNAhsa-miR-100.6780.0135
hsa-miR-100.6530.016hsa-miR-160.5230.00355
lncRNA俄罗斯1号机组-AS11.090.01hsa-miR-71.750.011
信使核糖核酸ADAM10型2.010.0435lncRNALINC00324（链接C00324）1.380.0205
AHCYL2型0.7390.0315信使核糖核酸楼面竣工标高42.430.036
CNPY3公司0.6020.048CELSR2级0.5760.041
DLC1型1.560.025ERBB3号机组0.3920.041
E2F3型0.6610.0355LRRC8E型0.5770.029
保险丝0.5310.0345地图4K42.120.0475
HPN公司0.8780.036MICAL2公司1.760.0115
ITPR1公司2.190.036西北高压40.7020.0265
LRRC40型2.560.042PCYOX1型0.4840.0445
MICAL2公司1.490.0325项目风险管理模型51.640.0135
西北高压40.7220.032PTBP1型8.80.047
额定功率1.570.037PTPN1号机组3.260.038
PRPSAP2型0.5630.045PYGO2型0.2520.036
PTPN12号机组2.190.0485建议零售价22.320.043
公用事业单位10.6680.0385SCG5公司1.840.00065
PYGO2型0.3340.0485SDC10.4590.042
RAB10型1.590.0295SLC39A14型1.850.042
SAR1B型1.620.039SLC44A1型0.4450.011
SCG5公司1.40.0295喷洒42.280.007
SLC39A14型1.780.027ST3镀锌22.340.033
SNX21系列0.5020.048主题40.2780.006
SOD2标准0.7360.038ZFP1公司3.350.032
速度41.980.023
ST3镀锌21.870.0345
TAP2型0.680.0425
TCFL5公司0.6130.033
陷阱C100.3240.037
TSC22D2型1.360.0295
TSEN15公司1.580.0415
保存图片、插图等的外部文件。对象名称为peerj-07-7456-g005.jpg
预后相关的竞争性内源性RNA（ceRNAs）相互作用轴。

（A） 整体生存的lncRNA-miRNA-mRNA网络；（B） lncRNA-miRNA-mRNA网络用于无复发生存。方形节点代表lncRNAs；三角形节点代表miRNAs；圆形节点代表mRNA。边缘代表lncRNAs、miRNAs和mRNAs之间可能的关联。红色，上调；绿色，下调。；Kaplan-Meier分析关键ceRNA轴的lncRNA（C）、miRNA（D）和mRNA（E），其中所有lncRNA、miRNA和mRNA都与预后相关，mRNA是独立的预后因素。

随后，多元Cox回归显示TRAPPC10和SLC39A14是OS的独立因素；RRM2是RFS的独立因素(表4)。虽然SOD2、SLC44A1和THEM4也被筛选为显著，但根据其表达水平，它们的危险比（HR）与预期不一致。结合单变量结果，我们认为TRAPPC10和SLC39A14相关的ceRNA轴（TMEM51-AS1-miR-106-TRAPPC10；RUSC1-AS1-miR-16-SLC39A14）可能特别重要。绘制了这些lncRNAs、miRNAs和mRNAs的Kaplan–Meier曲线。正如预期的那样，miR-16的低表达(图5D)与预后不良和RUSC1-AS1高表达有关(图5C)，SLC39A14(图5E)和TRAPPC10(图6A)与较短的操作系统相关。

表4

多元Cox回归分析LSCC的独立预后因素。
操作系统RFS公司
身份证件P（P）-价值人力资源95%置信区间身份证件P（P）-价值人力资源95%置信区间
下限上限下限上限
陷阱C100.01060.09410.015350.5768SLC44A1型0.00550.17190.04960.5958
酒0.02520.03910.002290.668主题40.01010.22150.070230.6988
SLC39A14型0.02899.371.2669.8建议零售价20.015134.85621.99009610.503
SOD2标准0.04562.7481.019927.4038年龄0.08750.065020.002831.494
SCG5公司0.05158.60.98675.1T型0.18820.097210.003023.129
等级0.05360.00530.0000251.09阶段0.188314.21940.27247742.056
MICAL2公司0.08720.1410.01491.33ZFP1型0.21083.57090.4864926.2105
俄罗斯1号机组-AS10.08941.14340.979571.3347LINC00324（链接C00324）0.21341.54290.779213.0549
性别0.10570.0021.08E−063.72PCYOX1型0.22060.165860.0093622.939
CNPY3公司0.106943.10.4444170摄氏2度0.22330.124750.0043763.556
公用事业单位10.15340.09270.003542.43西北高压40.24290.586880.2399351.435
HPN公司0.15380.3980.1121.41性别0.25070.113270.0027544.658
hsa-mir-16-20.16260.55740.245391.266PTPN1号机组0.256717.12320.1264452318.83
年龄0.16410.03230.0002564.07楼面竣工标高40.309317.528820.0701564379.665
PTPN12号机组0.20442.70.1314000PYGO2型0.32180.061180.00024315.379
ADAM10型0.2450.1360.004723.93SLC39A14型0.33031.59190.624364.0587
LRRC40型0.24670.03330.00010610.5喷洒40.35741.67160.559734.9922
阶段0.25891850.0215158000等级0.49530.242060.00410414.277
RAB10型0.27790.00667.71E-07年57.1地图4K40.49730.219960.00277517.436
T型0.28140.02140.00002023.3hsa-mir-16-20.501050.70010.247781.978
TSC22D2型0.30881.73220.601294.99ERBB3号机组0.61932.561130.06268104.645
保险丝0.32620.01282006年11月21日77.1PTBP1型0.6298.468840.0014649149.03
数据链路C10.32790.1680.004725.99烟草0.69010.590730.044427.856
PRPSAP2项目0.3280.05980.00021216.9SCG5公司0.70401.20360.462633.1314
TSEN15公司0.32952.18530.4539710.5197项目风险管理模型50.71081.453920.2010610.514
ST3镀锌20.36431.49160.628823.5381N个0.79030.699630.050309.731
PYGO2型0.46086.860.04121140LRRC8E型0.79140.708970.055459.065
E2F3型0.47362.690.1840.2MICAL2公司0.82441.26760.1561610.289
N个0.50370.2030.0018821.8SDC10.84761.13550.310794.1489
喷洒40.55511.30260.541323.1346hsa-mir-7-20.85561.13050.301754.2351
TAP2型0.5740.71120.216792.3332hsa-mir-10a0.91860.96920.531891.7661
西北高压40.64860.7840.2762.23ST3镀锌20.93850.94820.245243.666
TCFL5公司0.69540.74360.168663.278酒0.99371.018030.0118787.316
烟草0.7171.670.10526.5
SNX21系列0.82530.87030.253592.9871
hsa-mir-10a0.83920.94510.547391.6316
额定功率0.8421.70.00918315
SAR1B型0.91061.250.024464.3
ITPR1公司0.91211.190.053926.3
AHCYL2型0.97671.060.023647.5

注意事项。

P（P）-值<0.05，以粗体显示。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为peerj-07-7456-g006.jpg
lncRNA TMEM51-AS1 ceRNA相关mRNA的Kaplan–Meier曲线。

（A） TRAPPC10是一个独立的预后因子；（B） SNX21，在单变量Cox回归分析中与总生存率相关。

此外，还分析了与OS和RFS相关的DEL、DEM和DEG，以研究它们与LSCC其他临床特征的相关性，进一步证实它们的重要性。结果表明，RUSC1-AS1与病理性N显著相关；OS和RFS相关的SPRY4与病理性M相关；OS相关MICAL2与病理N和病理分期相关；RFS相关的ZFP1和SLC39A14与病理性N相关；OS相关SNX21和RFS相关SCG5与性别相关(表5)。这些发现暗示SPRY4、MICAL2、ZFP1、SNX21和SCG5相关的ceRNAs（LINC00324/RUSC1-AS1-miR-16-SPRY4/MICAL2、RUSC1-AS1-miR-7-ZFP1，TMEM51-AS1-miR-106-SNX21，RUSC1-ASC1-miR-10-SCG5）对LSCC也至关重要。SNX21的卡普兰-迈耶曲线如所示图6B其他DEG显示在图S1和S2系列.

表5

预后ceRNA网络中与lncRNAs、miRNAs和mRNAs相关的临床特征。
临床特征重大关联
lncRNA微小RNA信使核糖核酸
年龄（≥60/<60岁）————MICAL2保险丝ADAM10，LRRC8E型
性别（男/女）————DLC1、HPN、PTPN12、SNX21、ST3GAL2、，LRRC8E、NXPH4、PTPN1、SCG5、，
饮酒（是/否）————CNPY3、PYGO2、SLC39A14、TAP2
病理_M（M0/-）————ADAM10、CNPY3、E2F3，喷洒4,LRRC8E、MAP4K4、PTBP1、RRM2
病理_N（N0/N1/N2/N3/-）俄罗斯1号机组-AS1——DLC1、FUS、MICAL2、SOD2、，PCYOX1、RRM2、SLC39A14、ZFP1
病理_T（T1/T2/T3/T4/-）————LRRC40、PRPSAP2、SOD2、TSEN15、，CELSR2、PTPN1
病理_分期（I/II/III/IV/-）————MICAL2、PRPSAP2、SPRY4、，CELSR2、MAP4K4、PCYOX1、PTPN1
等级（G1/G2/G3/G4）——-AHCYL2、DLC1、PCYOX1、PTPN1、RRM2
烟草使用（改革/当前/从未）————HPN、RAB10、SAR1B、SOD2、TAP2

注意事项。

下划线基因与无复发生存相关；其他基因与总体生存相关。粗体基因既无复发，又与总生存率相关。

讨论

虽然表观遗传学修饰已被证明可触发癌症中lncRNA的沉默或过度表达(Dong等人，2017年;郭等人。，2018年b;周等，2018)，lncRNA的异常甲基化介导的表达变化在LSCC中仍不清楚。我们首次发现lncRNA TMEM51-AS1的下调可能通过超甲基化介导。很少有研究探讨TMEM51-AS1在癌症中的作用，除了一项研究表明，下调的TMEM51-AS1与肾嫌色细胞癌中的低OS显著相关(He等人，2016年)。在本研究中，我们预测TMEM51-AS1可能作为ceRNA通过海绵miR-106b调节SNX21和TRAPPC10。证据表明，在LSCC中miR-106b上调(Lu等人，2014年;Xing等人，2014年)我们的微阵列研究也证实了这一点。据报道，miR-106b通过靶向RUNX3促进LSCC细胞的增殖和侵袭(Ying等人，2013年)同时通过抑制肿瘤抑制因子RB诱导细胞周期G0/G1阻滞(蔡、王、宝，2011)。尽管没有研究表明SNX21在癌症中的作用，但其家族基因，如SNX1(Zhan等人，2018年)，SNX5(Jitsukawa等人，2017)和SNX9(Bendris等人，2016年)被认为与肿瘤抑制因子有关。因此，理论上，在LSCC中SNX21可能被miR-106b下调。与此假设相一致，我们的研究表明，SNX21在LSCC组织中的表达较少，而SNX21高表达的患者OS发生率较高。迄今为止，只有一项研究表明TRAPPC10的作用，并表明TRAPPC1是预测乳腺癌患者不良预后的致癌因素(Pongor等人，2015年)这似乎与我们的结果相反，暗示TRAPPC10可能是LSCC的一个新的抑癌基因。TRAPPC10的抑瘤作用可能与其激活GTPase RAB11的潜能有关(Milev等人，2018年)和Rab偶联蛋白，其靶向性缺失导致加速肿瘤发病(Boulay等人，2016年).

此外，我们还鉴定了其他几个ceRNA轴，尽管它们与甲基化无关，包括LINC00324/RUSC1-AS1-miR-16-SPRY4/MICAL2/SLC39A14、RUSC1-AS1-miR-10-SCG5和RUSC1-ASC1-miR-7-ZFP1。所有这些lncRNAs、miRNAs和mRNAs均与OS和/或RFS显著相关，表明这些ceRNA轴也可能是潜在的治疗靶点。

尽管相关报告很少，但RUSC1-AS1(Jian等人，2015年)和LINC00324(Militello等人，2017年)已表明在癌细胞中高度表达，这在LSCC样本中也得到了类似的证实。越来越多的证据也证明了miR-16、miR-7和miR-10在各种癌症中的作用。miR-16在肺癌组织样本和细胞系中可能下调(Ke等人，2013年)和骨肉瘤(焦、王、王，2018)。miR-16的异位表达抑制细胞增殖、集落形成体内迁移和入侵在体外通过调节其靶基因RAB23和Smad3(焦，王，王，2018;Zhang等人，2018)。miR-10a在喉上皮癌前病变中表达下调，异型增生程度增加(胡等，2015)。miR-10a的过度表达通过调节上皮-间充质转化（EMT）抑制细胞转移(刘等人，2017b)。miR-7-5p在乳腺癌脑转移灶中表达较低(Hiroshi等人，2013年)miR-7-5p的使用模拟抑制细胞增殖和诱导凋亡(Shi等人，2015年)通过调节Kruppel样因子4的表达。与这些研究一致，我们还发现这三种miRNAs在LSCC中表达较少（尤其是miR-10和miR-7），并且与OS和/或RFS呈负相关。尽管已经如上所述报道了这些miRNA的下游靶基因，但它们在LSCC中的功能仍知之甚少。我们预测，SPRY4/MICAL2/SLC39A14、SCG5和ZFP1可能分别是LSCC中miR-16、miR-10和miR-7的潜在靶点，这一点之前尚未得到验证。然而，对这些二甘醇分子机制的研究可以间接解释其潜在的相互作用。SPRY4在睾丸生殖细胞肿瘤中的表达上调(Tian等人，2018年)。MICAL2是最近发现的一种原癌基因，它可以促进细胞增殖以加速肿瘤生长，并促进EMT相关蛋白的表达以增加细胞转移(Mariotti等人，2016年;Wang等人，2018年)。免疫组化分析显示SLC39A14在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，且与生存时间呈负相关(Gartmann等人，2018年)。此外，肿瘤细胞中SLC39A14的上调可能归因于其相互作用基因p53（一种肿瘤抑制因子）的缺失(赵等，2017)。虽然没有研究讨论SCG5在癌症中的作用，但其家族成员分泌粒蛋白II和III在前列腺癌中过度表达(Courel等人，2014年)和小细胞肺癌(Togayachi等人，2017年)，提示SCG5也可能对LSCC致癌。锌指蛋白也被观察到促进鼻咽癌细胞生长和转移(Li等人，2015年)。与这些发现一致，SPRY4、MICAL2、SLC39A14、SCG5和ZFP1在LSCC中均上调，且与预后不良相关。

这项研究有一些局限性。首先，尽管公共数据库中的所有已知微阵列或测序数据都已包含在内，但样本量仍然不大，这可能会影响结果。因此，用较大样本进行额外的临床试验可能对确认其表达和预后至关重要。其次，我们只是初步预测这些ceRNA轴可能与LSCC的发展和预后有关。lncRNAs和miRNAs以及miRNAs和mRNAs之间的调节关系需要进一步的实验证实在体外和体内（即双荧光素酶报告物分析或功能丧失）。第三，TMEM51-AS1的表达是否受到甲基化的调节，应使用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷进行验证。第四，尽管我们已经对来自不同平台的数据进行了标准化，但这仍可能导致一些潜在的偏见。

结论

本研究确定了LSCC发生发展的几个重要机制：（1）甲基化介导的lncRNA TMEM51-AS1上调可能作为miR-106b的ceRNA调节SNX21和TRAPPC10；（2） 生存相关的RUSC1-AS1/LINC00324可能作为ceRNA来海绵miR-16、miR-10或miR-7，然后分别调节SPRY4/MICAL2/SLC39A14、SCG5/PRDM5和ZFP1。总之，这些lncRNA、miRNAs或mRNAs可能是LSCC潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

补充信息

补充信息1

的原始数据GSE59652标准:

补充信息2

的原始数据GSE84957型:

补充信息3

的原始数据邮编62819:

补充信息4

的原始数据GSE70289标准:

补充信息5

的原始数据GSE51985标准:

补充信息6

的原始数据GSE58911标准:

补充信息7

的原始数据GSE59102标准:

补充信息8

的原始数据GSE84957型:

补充信息9

所有数据集中差异表达的lncRNA、miRNAs、基因和差异甲基化区域：

图S1

lncRNA、miRNAs和mRNAs的Kaplan–Meier曲线用于与总体生存相关的竞争性内源性RNAs相互作用轴：

图S2

无复发生存相关竞争性内源性RNA相互作用轴的lncRNA、miRNAs和mRNAs的Kaplan-Meier曲线：

资金筹措表

本研究得到了中国辽宁省自然科学基金（No.20170541050）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

附加信息和声明

竞争性利益

作者们声明没有相互竞争的利益。

作者贡献

连辉构思和设计实验，进行实验，分析数据，提供试剂/材料/分析工具，准备图表，撰写或审阅论文草稿，批准最终草稿。

王静（音译）进行实验，提供试剂/材料/分析工具，批准最终草案。

张嘉良分析数据，提供试剂/材料/分析工具，批准最终草案。

金龙构思和设计实验，撰写或审查论文草稿，批准最终草稿。

数据可用性

提供了以下关于数据可用性的信息：

原始数据可在补充文件.

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