胶质细胞界面上的信号

摘要

介绍

星形胶质细胞是不可电激发的细胞，传统上被认为是大脑的支持细胞。星形细胞功能仅限于“家务工作”的概念首先受到质疑，因为发现星形细胞积极传播钙信号(Cornell-Bell等人，1990年). 单个星形胶质细胞的刺激导致细胞内钙增量的扩大波，其与细胞培养物中的20-100个相邻星形胶质细胞结合(Charles等人，1991年;史密斯，1992年). 钙波很容易传递到邻近的神经元，这表明星形胶质细胞可能调节神经元的活动(内德加德，1994年;Parpura等人，1994年). 事实上，后来的大量研究表明，星形胶质细胞在包括共培养在内的几个不同系统中调节突触传递的强度(Araque等人，1998年)，完整的视网膜(纽曼和扎斯，1998年)和海马脑片(Kang等人，1998年)雪旺细胞是神经肌肉接头的活性成分(Robitaille，1998年). 在所有这些研究中，细胞溶质钙被确定为星形细胞激活及其积极参与三部分突触的关键因素(海登，2000). 然而，星形胶质细胞具有一种机制，可以在相对较短的时间内激活大量相邻的星形胶质细胞，这一观察尚未纳入星形胶质细胞的经典功能。例如，目前尚不清楚星形细胞钙信号是否调节血脑屏障（BBB）的代谢运输，或在局部血流调节中发挥作用。因为星形胶质细胞的许多功能与血脑屏障周围的结构组织有关(del Zoppo和Hallenbeck，2000年)，我们在这里询问了血管末端足在多大程度上能够产生钙波。最近在体外工作表明嘌呤能受体和缝隙连接蛋白Cx43在星形细胞钙波的产生和传播中起着核心作用(Cotrina等人，1998年;Guthrie等人，1999年;Arcuino等人，2002年). 我们观察到，嘌呤能受体在星形胶质细胞中强烈表达，尤其是在其末端。令人惊讶的是，Cx43的表达也集中在大中型血管周围，并将单个星形细胞终末足突起连接成血管壁上的连续片状。对装有钙指示剂Fluo-4/AM的急性制备脑片进行的多光子共焦成像显示，星形细胞血管末梢对局部应用ATP作出反应，并在局部电刺激后传播钙波。这些观察结果表明，先前在星形胶质细胞-神经沟通中涉及的星形胶质细胞钙信号也在胶质-血管界面表达。因此，钙信号可能在星形胶质细胞的支持功能中发挥调节作用，包括局部血流调节和代谢贩运。

材料和方法

免疫组织化学体重为150-175 mg（8-10周）的年轻雄性Sprague-Dawley大鼠通过腹腔注射戊巴比妥（40 mg/kg体重）进行深度麻醉。将大鼠垂直放置在15°的位置，并使用经左心室插入主动脉的21 gauge Teflon导管进行心内灌注。通过带有0.8 mm试管的Master flex泵控制器缓慢（0.3 ml/min）灌注500 ml PBS（西格玛，密苏里州圣路易斯）和2 ml/l肝素（5000 U/cc肝素溶液）。然后固定组织就地通过灌流1升含有4%多聚甲醛的PBS，在1小时内以高达7 ml/min的速度给药。取出大脑，在4%多聚甲醛中后固定4小时，随后在PBS中洗涤。制备100-150μm的振动体（TPI，圣路易斯，密苏里州）切片，并在4°C下浸入PBS中。

将大鼠脑切片分别置于24孔培养皿中，并在0.1中轻轻清洗数次米PBS公司。将切片透化并用1%的溶液封闭我-0.1中的赖氨酸盐酸盐（Sigma）米PBS和100μl Triton X-100在4°C下24小时。然后将组织切片置于一种在渗透阻断剂中稀释的一级抗体溶液中培养72小时：抗GFAP的单克隆抗体（G3893，1:100；Sigma）；针对水通道蛋白4（AQP-4）的多克隆抗体（AB3068，1:100；Chemicon International，Temecula，CA）；抗Cx43的多克隆抗体（71-0700，1:500；佐米德实验室，加利福尼亚州旧金山）；针对P2Y2受体和P2Y4受体的多克隆抗体（APR010和APR006，两种抗体均为1:50；以色列耶路撒冷阿洛蒙实验室）；抗大鼠内皮细胞抗原（RECA）-1抗原的单克隆抗体（MCA970，1:100；Serotec，罗利，北卡罗来纳州）；抗层粘连蛋白的多克隆抗体（L9393，1:75；Sigma）；抗结蛋白的单克隆抗体（M0760，1:100；Dako，Carpindia，CA）；以及一种针对平滑肌肌动蛋白的单克隆抗体（128M，1:75；BioGenex，加州圣拉蒙）。在0.1中多次清洗后米PBS、二级抗体Cy3-山羊抗兔（111-165-003；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）和FITC-山羊抗鼠（F0257，Sigma）分别以1:100和1:200的稀释液应用48小时。反应通过用0.1米PBS多次，并以慢衰减（Molecular Probes，尤金，俄勒冈州）将各部分安装在玻璃载玻片上。使用Bio-Read MRC1000共焦扫描显微镜和倒置显微镜（日本东京奥林巴斯IX81）观察免疫荧光。

切片准备按照前面的描述准备幼年大鼠[出生后第15天（P15）]的皮层切片(Kang等人，1998年;Kang和Nedergaard，2000年). 简而言之，切片被浸没在气体中（95%O₂和5%CO₂)在可控震源（TPI）上切割冰镇切割溶液和300μm厚切片。所含切削液（单位：m米)：2.5 KCl，1.25 NaH₂人事军官₄，10 MgSO₄，5氯化钙₂，10葡萄糖，26 NaHCO_三和230蔗糖。切片在人工脑脊液（aCSF）中培养1小时，然后加载Fluo-4/AM（10μ米)在含有0.05%（w/v）Pluronic F-127（微米）的CSF中放置1.5小时，并用5%CO充气₂和95%O₂温度为35°C。在选定的实验中，得克萨斯红葡聚糖（40000 kDa；1 m米; 300μl）在脑片制备前立即心内注射，以勾勒血管(莫里斯等人，1999年;Zhang等人，1999年). 将切片转移到一个记录室（1.5 ml），并用脑脊液持续灌注。所含aCSF（单位：m米)：126 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH₂人事军官₄，2氯化镁₂，2氯化钙₂、10葡萄糖和26 NaHCO_三，pH 7.4，当使用95%O气体时₂和5%CO₂通过使用多灯放大器（Axon Instruments，Foster City，CA）获得全细胞记录。使用P-97微量移液器从KG-33玻璃毛细管中拔出电阻为3-7Ω的记录电极（加州诺瓦托萨特仪器公司）。所含细胞内溶液（单位：m米)：140 KCl，2 MgCl₂，10 EGTA，10 HEPES，pH 7.2，含KOH。在记录之前，将荧光素黄CH（2 mg/ml；脱碘盐，Sigma L-0259）添加到溶液中，并将溶液加热到50-60°C以促进荧光素黄色的溶解性。

在差示干涉对比（DIC）显微镜下，星形胶质细胞通过没有可见突起的小而圆的细胞体（<10μm）、较高的静息膜电位（～80 mV）、较小的输入电阻<20 mΩ）以及去极化电压阶跃无法激发动作电位来区分。使用填充100μ的贴片吸管局部施用ATP米记录溶液中的ATP，pH 7.3。ATP由Picrospitzer（General Valve，新泽西州费尔菲尔德）通过1秒的吹气和3-4磅/平方英寸的气压输送。通过放置在切片表面的双极电极（世界精密仪器）进行局部电刺激（2秒，100 Hz脉冲，100μA）。

多光子激光扫描显微成像使用连接到共焦扫描系统（Fluoview，Olympus）的Mai Tai激光器（SpectraPhysics，Inc.）和直立显微镜（IX81W，Olymbus）进行钙成像实验。钙指示剂Fluo-4/AM（10μ米，1.5小时），在800nm处激发，在530-580nm处收集发射。每1.5秒采集三个连续光学切片，每个距离为5μm。将连续光学切片叠加，以在同一区域内观察更多细胞。记录后，将载玻片固定在4%多聚甲醛中48小时，并按照上述方法进行免疫组织化学处理。德克萨斯红葡聚糖在860 nm处激发，在575-645 nm处收集发射。荧光素黄在850 nm处激发，发射在575-645 nm处收集。

结果

星形胶质细胞的极化表型就地

星形胶质细胞通常通过其对GFAP的免疫反应进行鉴定，GFAP是大脑中星形胶质细胞唯一表达的中间丝。对成年大鼠制备的振动切片进行GFAP标记，结果显示星形胶质细胞均匀分布于皮层，每个覆盖范围约30-80μm(图1A类). 当用单克隆GFAP抗体观察时，单个星形胶质细胞呈星形，具有多个分支过程。这些过程逐渐变细，再加上与邻近星形胶质细胞的稀疏接触，形成了高度对称的组织，每个星形胶质细胞都创建了自己的结构域，正如Ellisman及其同事最初描述的那样(Bushong等人，2002年). 这种有序分布的例外是，大多数（如果不是全部）星形胶质细胞将一个或几个过程延伸到附近的血管。GFAP+血管突起通常直径较大。血管突起的尖端与相邻的端足相连，端足沿血管壁抹灰(图1A类). 端脚为圆形或细长型，平均直径为4-8μm。GFAP在个体末端足部被组织成两种不同的模式。一些端部支脚包含螺旋或货车车轮配置中的GFAP(图1C、 D类)而另一端足部的GFAP组织成围绕血管的环形纤维平行排列(图1E、 F类). 这些是值得注意的，因为它们垂直于血管的线性向量对齐。

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图1。

并非所有的血管星形细胞终足突都是GFAP阳性。A类皮层星形胶质细胞GFAP免疫标记。单个星形胶质细胞呈星形，对称分布，与相邻星形胶质细胞接触最少。维管突起与其他突起的不同之处在于直的、无分枝的和直径宽的（红色箭头）。大中型血管的表面被GFAP+星形细胞末端足紧密覆盖。插图，有两个血管突起的星形胶质细胞。B、，AQP-4（红色）和GFAP（绿色）的双重免疫标记。水通道蛋白-4免疫标记显示，包括毛细血管在内的整个血管网络被星形细胞过程覆盖，尽管GFAP阴性。较小的血管和毛细血管大多为GFAP阴性，但对星形胶质细胞特异性通道AQP-4显示强烈的标记。AQP-4标记显示星形细胞末端足持续覆盖。首席财务官，GFAP在较大血管周围星形细胞末端足的组织示例。C和D类展示血管末端足中GFAP细丝的车轮或玫瑰花结形成的例子，而E类和F类是垂直于血管长度的平行阵列的示例。C和E类根据GFAP（绿色）和AQP-4（红色）双重标记，而D类和F类仅对GFAP染色。比例尺：嵌入式，40μm；A类，10微米；B类，60微米；C、 E类，5微米；D、 F类，30微米。

GFAP+过程没有系统地覆盖较小的血管和毛细血管。偶尔GFAP+过程与小血管和毛细血管壁接触。GFAP不能定义星形胶质细胞的细胞质轮廓(Bushong等人，2002年)通过标记星形胶质细胞对抗水通道蛋白-4（脑内星形胶质细胞表达的水通道家族成员），可以观察到星形胶质细胞对血管系统的全面覆盖(尼尔森等人，1997年;Rash和Yasumura，1999年). 水通道蛋白-4的表达勾勒出了整个血管网络，表明星形细胞末端足虽然GFAP阴性，但完全覆盖了大脑血管系统(图1B类).

接下来，我们量化了贴在血管壁上的星形细胞终末足的GFAP表达程度。振动切片针对层粘连蛋白（多克隆）和GFAP（单克隆）进行双重标记。血管面积通过使用20×油透镜选择荧光发射高于基线荧光10倍的层粘连蛋白标记区域来定义(图2A类). GFAP染色百分比（>10倍基线发射）(图2B、 C类)在被选为层粘连蛋白+的区域内，使用变形金刚（宾夕法尼亚州西切斯特市通用成像）进行定量。根据层粘连蛋白标记，血管分为三组：大血管（>16μm）、中血管（8-16μm）和小血管（<8μm）。分析表明，大中型血管大多被GFAP+星形细胞突起覆盖，而小血管周围的GFAP标记与血管系统外（非血管）的GFAP标签百分比没有显著差异(图2D类). 海马脑片中发现GFAP阳性星形胶质细胞突起与大血管相对，GFAP阴性突起与小血管相对。

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图2。

量化贴在血管壁上的星形细胞终末足中GFAP的表达。A类-C，层粘连蛋白双重免疫染色(A类)和总建筑面积(B类)和覆盖(C)皮质层粘连蛋白（红色）和GFAP（绿色）。比例尺，20μm。D类GFAP在血管系统中表达的定量，作为血管大小的函数。大血管（>16μm；黄色箭头）和中型血管（8-16μm；红色箭头）约70%的血管壁被GFAP+星形细胞末端足覆盖。相反，与小血管（<8μm；绿色箭头）接触的星形细胞突起中只有19±2%为GFAP+。小血管周围GFAP表达的百分比与血管壁外GFAP表达百分比没有显著差异（13±2%非血管；第页= 0.33; 未成对的t吨测试）。^*第页< 0.0001; 未成对的t吨测试；n个=10片。

连接星形细胞末端脚的缝隙连接斑块

Cx43被认为是主要的星形细胞缝隙连接蛋白(Dermietzel等人，1991年;Giaume等人，1991年). 在培养的星形胶质细胞中，Cx43组织成缝隙连接斑块，均匀分布在细胞与细胞接触的区域。在成年大鼠的皮层中，我们发现Cx43免疫反应在大中型血管周围强烈存在(图3A类) (山本等人，1990年). 一般来说，血管周围的Cx43免疫反应性斑块较大，直径约为2-5μm，通常在血管周围以“蜘蛛网样”模式组织，描绘了相邻末端足之间的接触区域(图3A、 B类). 在脑实质内，例如血管壁外，Cx43免疫反应均匀分布在较小的斑块（<1μm）中，缺乏明显的组织模式。Cx43阳性斑块与GFAP在大血管周围严格共定位，并在血管壁周围贴上连续的薄片，以物理方式连接星形细胞末端足(图3B、 C类). 相反，在内皮细胞中未观察到Cx43免疫反应性穿孔(图3F类). 内皮细胞通过针对RECA的抗体鉴定(图3F类) (Duijvestijn等人，1992年)或通过标记葡萄糖转运蛋白GLU-1（数据未显示）(Simpson等人，2001年). 无论哪种情况，Cx43阳性斑块均位于内皮细胞外。周围组织中的内皮细胞在因血流紊乱或机械应力或损伤而经历湍流剪切应力的区域表达Cx43(加布里埃尔和保罗，1998年;Hong and Hill，1998年)但在大脑中没有观察到这种表达模式。根据早期报道，脑膜也显示Cx43的大量表达(图3D、 E类) (格拉夫斯坦等人，2000年).

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图3。

Cx43间隙连接斑块主要位于血管周围，并连接星形胶质细胞的末端。A类、针对GFAP（白色）和Cx43（红色）的双重免疫标记。Cx43免疫反应斑块在一条中等大小的血管周围形成蜘蛛网图案。插图，高倍图像显示星形细胞足突周围Cx43免疫反应斑块的分布。B、 C类，针对Cx43的双重免疫标记(B类)和GFAP。大的Cx43免疫反应斑块连接星形胶质细胞GFAP阳性端足。D、 E、，软脑膜和皮质穿透血管中Cx43免疫反应强；根据Cx43标记(D类，红色）和GFAP(E类，白色）。F、，Cx43免疫标记（红色）不与内皮细胞标记物大鼠内皮细胞抗原（RECA；白色）共定位；相反，Cx43位于RECA阳性细胞外，与星形胶质细胞中Cx43和GFAP的共同表达一致。比例尺：嵌入式，15μm；A类，4微米；B、 C类，50微米；D、 E类120微米；F类，40微米。

为了确定连接星形细胞末端脚的缝隙连接是否有功能，我们接下来使用多光子激光扫描显微镜分析新制备的皮质切片中Lucifer黄[分子量（MW）443]的扩散。从P15大鼠幼崽制备急性切片，用贴片吸管将荧光素黄填充到靠近血管系统的星形胶质细胞中，在DIC光学下通常可见终足突(图4). Lucifer黄填充细胞激发动作电位的失败图3A类低输入电阻是星形胶质细胞的典型特征。在20个实验中的8个实验中，路西法黄色沿着血管壁从末端到末端扩散，表明Cx43免疫反应斑块在图3是功能性的，例如，允许自由交换间隙连接渗透指示器。最初在Zahs和Newman报告的类似观察结果(1997)显示神经生物素在星形胶质细胞之间广泛扩散。综上所述，这些研究表明，血管末梢通过大量开放间隙连接相互连接，这种耦合可能使末梢发挥功能单位的作用。

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图4。

通过荧光素黄扩散观察星形细胞末端足的功能耦合。A类，一个星形胶质细胞，在新制备的皮质切片中充满缝隙连接渗透指示剂路西法黄。荧光素黄色优先沿着血管壁扩散。红色箭头表示路西法黄色填充吸管；黄色箭头表示容器壁。电流注入无法激发动作电位（底部面板）。B类，路西法黄沿血管壁细胞间扩散的另一个例子。用贴片电极（红色箭头）将路西法黄填充到星形胶质细胞中，导致细胞间广泛扩散到邻近的星形胶质细胞，并在血管周围勾画出它们的过程轮廓。插图，多光子成像后，固定切片，并在DIC光学和荧光显微镜下进行可视化，以描绘路西法黄色填充星形胶质细胞（红色箭头）相对于血管的位置（黄色箭头）。

嘌呤能P2Y受体优先在星形细胞末端足表达

最近的几项研究已确定核苷酸和嘌呤能信号传导是培养物中星形细胞钙波的关键介质(Cotrina等人，1998年;Guthrie等人，1999年;Arcuino等人，2002年). 星形胶质细胞在培养物中表达P2Y（1）、P2Y（2）、P2Y4和离子型P2X（7）受体(John等人，1999年;Jimenez等人，2000年)以及从大鼠海马急性分离的(Zhu和Kimelberg，2001年). 令人惊讶的是，我们发现针对P2Y（2）和P2Y（4）受体的大多数免疫反应性与血管周围星形胶质细胞中的GFAP共定位（图。​（图5，5,​,6).6). P2Y（2）和P2Y（4）标记在大、中型血管周围强烈，但小毛细血管也呈免疫反应性（图。​（图5，5,​,6).6). 血管外可见少量P2Y（2）和P2Y（4）免疫反应，内皮细胞无免疫反应，例如不表达P2Y（1）或P2Y（3）受体（图。4C、 E类,5D、 E类). 因此，对P2Y（2）和P2Y（4）的免疫反应的总体分布与Cx43阳性斑块相似，例如，血管周围有许多大尺寸的强染色斑点，而较小和较弱的染色斑点散布在血管外。然而，与Cx43表达的蜘蛛网模式不同，P2Y2和P2Y4受体在终足表面膜上呈弥散分布。成年大鼠大脑中P2Y（1）免疫反应较弱，与P2Y（2）表达在发育过程中下调的观察结果一致（数据未显示）(Zhu和Kimelberg，2001年). 针对P2X（7）受体的商业抗体引起了不一致且无特异性的染色模式（数据未显示）。

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图5。

P2Y（2）通过星形细胞末端足在胶质-血管界面表达。A、 B类大血管周围P2Y（2）免疫反应(A类，红色）和GFAP在同一字段中的表达(B类，白色）。CP2Y（2）（红色）和RECA（白色）的双重免疫反应。P2Y免疫反应位于RECA阳性内皮细胞周围。D类，GFAP阳性血管的横截面与P2Y（2）受体进行反染，显示共定位（红色）。E、，相比之下，P2Y（2）表达（红色）位于另一横截面的内皮细胞层（RECA；白色）之外。比例尺：A、 B类，20微米；C，35微米；D、 E类，40微米。

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图6。

P2Y（4）免疫标记在星形细胞过程中与GFAP强共表达。A类，针对皮质中P2Y（4）（红色）和GFAP（白色）的双重免疫标记。穿透较大的GFAP+血管显示出对P2Y（4）受体的强烈标记。B类，大血管的横切面显示P2Y（4）受体和GFAP的共定位。C，高倍放大B。D、 E类P2Y（4）和RECA的双重免疫标记。P2Y（4）免疫标记定位于内皮细胞层外，与其在星形胶质细胞中的表达一致。比例尺：A类，100微米；B类，15微米；C、 E类，10微米；D类，30微米。

基底层分离星形胶质细胞、内皮细胞和周细胞

基底层是一层由IV型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白组成的膜，介导于内皮细胞和星形细胞末端足之间(图7A、 B类) (del Zoppo和Hallenbeck，2000年). 使用针对层粘连蛋白的多克隆抗体，发现基底膜由两层膜组成。一层厚厚的深染膜面向星形细胞足突，而一层较薄的膜面向内皮细胞层。典型的是，内膜包含“囊”，通常呈垂直于血管长度的隧道形状(图7A类，箭头）。这两个膜经常被分离，很可能是在玻片制备过程中产生的伪影，这表明这些膜只是松散地连接在一起。基底层内膜的囊袋中含有结蛋白阳性的周细胞-平滑肌细胞(图7C) (Diaz-Flores等人，1991年;Nakano等人，2000年). 周细胞是细长的细胞，在较大的血管周围形成纤维网(图7D类). 一种针对平滑肌α-肌动蛋白的抗体，具有高度特异性——周细胞-平滑肌细胞的定位(图7E类). 大多数结蛋白或平滑肌α-肌动蛋白阳性细胞位于大血管周围，仅在毛细血管中观察到。Pericytes平滑肌细胞嵌入基底膜的内膜，从而与内皮细胞层分离，而基底膜的两层都将内皮细胞与星形胶质细胞分离。结果是血脑屏障中的所有三种细胞类型（内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞）在物理上相互分离。因此，不太可能在血脑屏障内建立不同类型细胞之间的异型缝隙连接。

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图7。

基底膜将血脑屏障的所有三种细胞类型从物理上分开。A类对大皮质血管的层粘连蛋白（白色）和RECA（红色）进行双重免疫标记。基底层由层粘连蛋白的外厚层和层粘连素染色较弱的内层组成。内层包含囊袋，其形状通常为垂直于血管长度的隧道（白色箭头）。插图，层粘连蛋白染色血管壁的高倍图像，显示了两个层粘连。B类，对层粘连蛋白（白色）和GFAP（绿色）染色的大血管。GFAP阳性的星形细胞终末足覆盖基底层。C，Desmin-阳性周细胞（红色）位于基底层的囊中（层粘连蛋白；白色）。D、，结蛋白阳性周细胞的高倍视野。E类，一种针对肌动蛋白平滑肌（周细胞特异性）的抗体表明，只有大血管被周细胞包围。毛细血管壁上没有周细胞，中等大小的血管中只观察到弱表达（白色箭头）。比例尺：A类，20微米；B类，30微米；C，20微米；D类，40微米；E类，100微米。

星形胶质细胞对嘌呤能激动剂有协同反应

为了确定胶质-血管界面中识别的嘌呤能受体是否有功能，我们接下来将新制备的皮质切片（P15）加载钙指示剂Fluo-4/AM，并使用多光子激发（800 nm）可视化胞浆钙的动态变化。在P10岁以上大鼠制备的切片中，星形胶质细胞优先负载钙指示剂(Kang等人，1998年;Kang和Nedergaard，2000年)通过多光子激发，可以成像位于表面以下60-120μm的完整血管。

为了识别血管，在准备脑片之前立即心内注射德克萨斯红葡聚糖（MW 200 kDa）(莫里斯等人，1999年;Zhang等人，1999年). 德克萨斯红葡聚糖清楚地勾勒出了整个血管网络，在860 nm处，可以使用适当的发射带通滤波器将激发与Fluo-4/AM信号分离（见材料和方法）。

在静息状态下，星形胶质细胞的胞浆钙水平较低且稳定(图8B类). 局部吹气ATP后（100μ米)在TTX（1μ米)细胞内钙水平显著升高。典型的是，星形细胞胞体及其血管突起对ATP都有反应。通常情况下，由于钙的基线水平较低，在添加ATP后，血管突起首先可见。星形细胞终末足突起中胞浆钙浓度的增加是均匀的，不可能区分各个突起(图8B类). ATP被洗脱后，贴在血管壁上的末端足部细胞浆钙水平保持在较高水平，持续数分钟。相比之下，星形胶质细胞体内的钙水平更快地恢复正常，导致星形胶质细胞足部高钙突起对血管系统的长期勾勒。针对GFAP的标记阳性地鉴定出几乎所有对ATP反应的细胞都是星形胶质细胞(图8A类).

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图8。

嘌呤能受体激动剂动员胞浆钙²⁺在星形细胞终足突中。A类，制备用于多光子成像的新制备的皮层脑片（P15）。最后一帧显示用于Ca的同一幻灯片的GFAP免疫反应性（绿色）和核染色（Sytox，蓝色）²⁺在中成像B类红色箭头表示两个GFAP阳性星形胶质细胞，其血管突起对ATP暴露作出反应。B、，胞浆Ca增加²⁺局部应用ATP诱发（100μ米)在同一艘船周围。在玻片制备前立即通过心内注射得克萨斯红葡聚糖对血管进行可视化。Fluo-4/AM为绿色；德克萨斯州红葡聚糖为红色。红色箭头表示GFAP阳性星形胶质细胞A类，最后一帧。C，焦场刺激（2秒脉冲，100 Hz，100μA）诱发Ca²⁺沿着血管壁传播的波（红色箭头表示刺激电极；虚线表示中等大小的血管）。星形胶质细胞参与钙²⁺波浪用黄色箭头表示，并根据其与钙的作用顺序进行编号²⁺发送信号。D类，Fluo-4/AM信号的相对增加（ΔF类/F类)中编号的星形胶质细胞C。比例尺：A、 B类，20微米；C，40微米。

接下来使用电场刺激来分析星形胶质细胞是否支持钙波的传播就地(图8C). 在TTX存在的情况下，通过电场刺激刺激星形胶质细胞钙信号，导致钙波，钙波通常沿着血管壁上的血管末端足明显迁移。在总共63个使用电刺激的实验中，我们发现37个（58%）波沿着血管壁传播。沿着血管壁的传播被定义为钙的连续增加，钙沿血管的线性向量迁移的最小距离为60μm。

综上所述，这些观察结果表明，星形胶质细胞上的嘌呤能受体具有功能，其激活导致细胞内钙的显著和长期动员，电刺激可以触发钙波，从而使星形胶质细胞参与急性切片。

讨论

这项研究的关键发现是，已知对细胞间钙信号至关重要的蛋白质主要由血管周围星形细胞末端足面向血管壁表达。具体而言，嘌呤能受体P2Y（2）和P2Y（4）以及由Cx43组成的缝隙连接在星形细胞末端足中大量存在（图。​（图3，三,​,5,5,​,6).6). ATP有效动员增加星形胶质细胞胞浆钙水平(图8). 在大多数实验中，不可能根据钙成像来概述单个过程，并且连接血管壁上涂抹的端脚的广泛缝隙连接网络可能将这些过程耦合成一个功能单元。局部电刺激触发钙波，钙波通常沿着血管壁传播(图8).

高尔基早在1885年就注意到星形胶质细胞经常与血管接触。血脑屏障的存在后来被大脑排除注射到血液循环中的染料的能力所认识（有关综述，请参阅沃尔堡和里索，1995年). 此后，许多研究证实BBB排除了神经活性物质，从而维持了一个最佳的突触传递环境(Grant等人，1998年;帕德里奇，1999年). 几乎所有物质都被BBB排除在外，但存在转运系统的小的亲脂化合物和底物除外(Drewes，1999年). BBB是由广泛的内皮紧密连接网络构成的内皮屏障(Kniesel和Wolburg，2000年). 星形胶质细胞在血脑屏障中的作用还不太明确，因为它们通过基底层与内皮细胞物理分离，不直接参与物理屏障。一些证据表明，星形胶质细胞的作用是为内皮紧密连接的形成提供适当的环境信号(Prat等人，2001年). 有趣的是，内皮细胞在诱导星形胶质细胞分化中的作用最近得到证实(Mi等人，2001年).

一些研究表明，星形胶质细胞参与了局部血流量的活动依赖性增加(Harder等人，2002年). 众所周知，细胞外钾浓度的增加会扩张脑小动脉，星形细胞终足突的高钾电导(纽曼，1986年)导致了这样一种假设，即神经元活动引起的星形细胞钾分流在局部血流调节中起作用(Paulson和Newman，1987年). 另一种可能性是，由强烈神经元放电引起的星形细胞钙信号介导活动诱导的局部血流增加。星形细胞钙信号与前列腺素的释放有关，前列腺素是有效的血管扩张剂(Kaley等人，1985年;巴拉德和阿契克，1998年;Bezzi等人，1998年). 最近的一项研究支持这样的观点，即突触传递过程中释放的谷氨酸刺激星形胶质细胞的钙信号，导致环氧合酶产物介导的血管舒张(Zonta等人，2003年). 根据我们的观察，星形胶质细胞的血管足突表达嘌呤能受体并动员钙以响应激动剂的暴露，确定嘌呤能够信号在局部血流调节中的作用对未来的研究至关重要(Anderson和Nedergaard，2003年).

我们没有详细检查内皮细胞和周细胞的钙反应，但总的来说，这些细胞对嘌呤能受体刺激的反应较弱。此外，在内皮细胞或周细胞中均未检测到P2Y（1）、P2Y（2）和P2Y（4）受体（图。​（图5，5,​,6).6). 星形胶质细胞通过对嘌呤能受体拮抗剂敏感的信号机制向共培养的内皮细胞传递钙信号(Paemeleire和Leybaert，2000年). 此外，培养的内皮细胞表达P2Y受体并动员胞浆钙以响应嘌呤能激动剂(Kunapuli和Daniel，1998年;Srinivas等人，1998年). 因此，P2Y受体表达的差异可以解释获得的看似相反的结果体内与在体外然而，值得注意的是，血脑屏障内的旁分泌钙信号可能受到基底膜的限制，基底膜将内皮细胞与星形胶质细胞物理分离。ATP是一种短程递质，可被胞外核酸酶迅速降解(伯恩斯托克，2002年)ATP不太可能通过完整的血脑屏障传递钙信号。在病理状态下，基底层厚度或组成的改变可能会引起异常信号通路(del Zoppo和Hallenbeck，2000年). 脑损伤后数小时内周细胞从血管系统迁移，表明新的信号回路可以迅速建立(Dore Duffy等人，2000年). 此外，嘌呤能受体的表达受到动态调节，培养的星形胶质细胞暴露于细胞因子IL-1β后，P2Y（2）嘌呤受体mRNA的表达出现短暂增加(John等人，1999年).

长期以来，星形胶质细胞一直被认为是大脑水分稳态的主要调节因子(del Zoppo和Hallenbeck，2000年). 我们在这里观察到AQP-4表达高度极化，大多数免疫反应出现在面向血管壁的星形细胞末端足。Freeze-fracture分析估计，由AQP-4组成的方形阵列横跨50%的表面积星形细胞末端脚(尼尔森等人，1997年;Rash和Yasumura，1999年). 正如免疫染色或冷冻断裂分析所观察到的那样，由于脑内皮细胞不表达水通道，它们的透水性可能较低(Verkman，2002年). 因此，AQP-4在胶质血管界面的高表达是无法解释的，但值得注意的是，几种细胞类型的细胞体积调节与嘌呤能信号传导有关(Wang等人，1996年;Feranchak等人，2000年). 因此，AQP-4和嘌呤能受体在血管旁的显著表达可能表明脑水稳态是由血脑屏障水平的星形胶质细胞控制的。

星形胶质细胞是就地高度极化，形态与他们培养的店员截然不同。我们在这里重新检查了大脑皮层中星形胶质细胞的结构组织，发现星形胶质细胞钙信号传导所需的关键元素，包括嘌呤能受体和缝隙连接，在面向血管壁的星形胶质细胞末端足中强烈表达。星形胶质细胞是电不兴奋细胞，依赖嘌呤能受体和缝隙连接进行远距离通信。血管周围星形胶质细胞中基本信号元件的异常高表达表明星形胶质细胞末端足专门参与活跃的信号传递过程。

脚注

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