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分子热学。2019年9月4日；27(9): 1612–1620.
2019年5月30日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.ymthe.2019.05.016
预防性维修识别码：PMC6731467型
PMID：31204210

放射C6细胞衍生微泡疫苗治疗恶性胶质瘤促进抗肿瘤免疫反应

本杰明·皮内达,1,∗ 弗朗西斯科·哈维尔·桑切斯·加西亚,2 诺拉·凯伦·奥拉斯科加,1 维罗尼卡·佩雷斯（Verónica Pérez de la Cruz）,三 阿列利·萨拉扎,1 塞尔吉奥·莫雷诺·希门尼斯,4 诺玛·埃尔南德斯·佩德罗,5 阿德里安·马尔克斯-纳瓦罗,6 阿尔玛·奥尔蒂斯·普拉塔,7和朱利奥·索特洛1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，诊断后平均生存14个月。其不良预后表明需要新的治疗方法。众所周知，辐射可诱导全身抗肿瘤作用。肿瘤细胞产生并释放微泡以应对细胞损伤，如辐射。微泡含有过多的生物活性分子，包括参与调节免疫反应的抗原。在本研究中，我们对照射C6细胞衍生微泡作为C6恶性胶质瘤的治疗性疫苗进行了表征和评估。培养的C6胶质瘤细胞用单剂量50Gy照射以获得微泡。当肿瘤直径达到2cm时，皮下植入C6细胞，皮下注射未照射和照射的C6细胞衍生的微泡。测定肿瘤生长、凋亡和免疫表型。与对照组相比，照射C6细胞衍生微泡治疗组的肿瘤体积减少（超过50%）（p=0.03）。与对照组相比，免疫大鼠肿瘤中浸润性辅助性、细胞毒性和调节性T淋巴细胞以及凋亡细胞的百分比增加。这些发现使基于微泡的疫苗接种成为一种有希望的胶质母细胞瘤免疫治疗方法。

关键词：恶性胶质瘤、微泡、疫苗接种、抗肿瘤免疫反应

Pineda等人。表征并使用辐照C6细胞衍生微泡（IR-MV），以证明基于IR-MV的疫苗接种可以诱导对恶性胶质瘤的抗肿瘤免疫反应。他们认为IR-MV可以作为胶质母细胞瘤患者的治疗方式。

介绍

恶性脑瘤是毁灭性的癌症1在美国每年造成15000人死亡。2多形性胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最恶性、最常见的原发肿瘤。三GBM的治疗包括广泛的手术切除，然后放疗和化疗。4放射治疗被用作延缓肿瘤生长的一种手段。5辐射诱导形成各种损伤相关分子模式（DAMP），从而激活先天免疫系统；这种现象称为免疫原性细胞损伤。此外，接受局部放射治疗的转移性肿瘤患者表现出全身免疫激活；这个特征被称为abscopal效应（源自拉丁语ab范围，“远离目标”）。6直到癌症免疫疗法问世，数十年来人们才认识到脱落效应的治疗可能性。当辐射与CTLA-4或PD-1等免疫检查点的阻断有关时，脓肿反应的临床病例更为频繁，CTLA-4或PD-1可提供持久的抗肿瘤免疫反应。7,8然而，仅通过DNA断裂和微核诱导进行免疫激活还不足以获得有效的治疗效果。此外，肿瘤细胞释放的细胞外小泡（EV）的释放尚未充分用于潜在的治疗应用。9这些小泡是脂质双层膜的颗粒，可以从体液中分离出来10并在压力下被肿瘤细胞释放。在这种情况下，微泡（MV）（也称为微粒或外体）是一种EV的亚型，通过向质膜外部的裂变释放到细胞外空间；它们的尺寸从200纳米到1微米以上。11,12在MV释放的部位，磷脂酰丝氨酸（通常位于膜的细胞质侧）被重新定位到膜的外层，而膜蛋白的拓扑结构保持不变。13

MV的重要性在于他们能够将其内容传输到其他单元（本地或系统）。MV的组成在很大程度上取决于原始细胞，尽管MV的膜组成可能因重塑而与亲本细胞不同。14癌细胞MV中包含的分子包括参与免疫调节的分子、跨膜受体和配体、癌蛋白、抑癌蛋白、脂质、mRNA、microRNA以及基因组或线粒体DNA。15这些MV可以与各种组织相互作用，建立转移前生态位，促进细胞侵袭、血管生成和免疫阻断。16,17

已有文献证明，胶质瘤的电离辐射改变MV的丰度和组成，促进迁移表型。16最近，Baulch等人。18研究表明，人脑胶质瘤的放射引发了前氧化表型，增加了参与调节细胞重编程和旁分泌相互作用的基因的表达，这些似乎由MVs介导，在金属蛋白酶2（MMP-2）的参与下，导致肿瘤存活和侵袭性。此外，已经证明电离辐射会诱导MV的释放，并有助于DAMP的形成，19它可以由坏死细胞被动释放，也可以由暴露于压力下的受损细胞分泌，通过模式识别受体（PRR）刺激先天免疫系统。20,21受辐射肿瘤细胞释放的MV可能产生肿瘤相关抗原（TAAs）和MV内的DAMP，使其具有免疫原性；这种效应可以部分解释abscopal效应。因此，我们研究了C6胶质瘤细胞MV的免疫能力，以C6细胞衍生MV（IR-MV）作为胶质瘤大鼠的治疗性疫苗，促进对恶性胶质瘤的抗肿瘤免疫反应，并将其与非IR-MV进行了比较。

结果

胶质瘤C6细胞中辐射诱导的MV

C6胶质瘤细胞系的MV是在标准条件下培养的C6细胞获得的，而其他MV则是在C6细胞接受50 Gy的单次辐射后获得的。与对照细胞相比，辐射后的细胞表现出形态学变化，辐射后细胞产生更多MV(图1A） ●●●●。透射电镜（TEM）观察两组细胞（辐照和未辐照）的MVs；观察到直径约为350nm的球形颗粒(图1B） ●●●●。

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C6胶质母细胞瘤细胞和微泡的显微照片

（A） C6胶质瘤细胞（N）和照射剂量为50Gy的C6胶质细胞（I）的清晰视野显微镜图像。（B） 用Annexin V-gold标记的未辐照C6细胞衍生微泡（MV）和照射C6细胞派生微泡（IR-MV）的透射电镜图像。比例尺代表300 nm。

为了确定MV的大小，进行了纳米颗粒跟踪分析（NTA）。图2A–2D显示了分析的代表性图像和MV尺寸分布图。MV的平均大小为395.0±202.6 nm，IR-MV为339.9±139.0 nm(图2E） ●●●●。

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MV的尺寸确定

（A–D）使用NTA 3.2 Dev Build 3.2.16 NanoSight软件，从NanoSight-纳米颗粒跟踪分析视频中获得的MV尺寸分布图像[从MV（A）和IR-MV（C。（E） 中压平均尺寸。

辐射诱导C6胶质瘤细胞MVs蛋白质含量的变化

为了确定MV的辐射特性，从C6胶质瘤细胞和MV中提取蛋白质，并用SDS-PAGE进行分析。C6胶质母细胞瘤细胞的完全裂解物具有更多的蛋白质，其次是IR MV和MV；此外，在其中三个样本中观察到不同的条带模式(图3).

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MVs的蛋白质特性

图中显示的是从MV、IR-MV和C6细胞获得的蛋白质的15%聚丙烯酰胺凝胶中的SDS-PAGE。KDa，分子量标记。

免疫IR-MV可减少肿瘤体积

为了确定MVs治疗性疫苗接种是否能诱导免疫反应，从而减少先前植入C6胶质瘤细胞的大鼠的肿瘤体积，我们对皮下C6胶质细胞瘤大鼠注射了MVs和IR-MV。我们观察到，与对照组和MV组相比，IR-MV治疗组大鼠的肿瘤体积减少了50%以上（p=0.03）。与对照组相比，用MVs治疗的大鼠组没有明显变化(图4).

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IR-MV对肿瘤生长动力学的影响

100万个活的C6细胞被植入Wistar大鼠皮下。在治疗后第0天、第7天、第14天和第21天测定对照组大鼠和接受MVs和IR-MV治疗的大鼠的肿瘤体积。结果表示为平均值±SEM。*p=0.031，IR-MV与对照。

IR-MV疫苗促进抗肿瘤免疫反应导致胶质母细胞瘤细胞凋亡

为了确定MVs疫苗在肿瘤细胞上诱导细胞死亡的机制，我们测定了接种MVs或IR-MVs后21天大鼠肿瘤中凋亡和坏死细胞的百分比(图5). 我们发现，与MVs或对照组相比，IR-MV治疗大鼠的肿瘤细胞凋亡百分比增加了三倍（p=0.038）。

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辐照和非IR-MV对大鼠细胞凋亡和肿瘤坏死的影响

（A–E）流式细胞术分析对照组和MVs和IR-MV治疗的大鼠肿瘤中活细胞（Annexin V−/PI−，A）、早期凋亡（Annessin V+/PI−，B）、晚期凋亡（Angexin V+/PI+，C）、坏死细胞（Angelin V−/PI+，D）和凋亡细胞总数（E）的百分比。结果表示为IR-MV与对照组相比的平均值±SEM。*p=0.027早期凋亡，*p=0.02晚期凋亡，*p=0.038总凋亡。在坏死方面没有观察到显著差异。

免疫IR-MV可增加辅助性和细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤的浸润

特异性抗肿瘤免疫反应的诱导伴随着T淋巴细胞百分比的变化。我们通过流式细胞术测定血液、脾脏和肿瘤中淋巴细胞的百分比。与对照组相比，经IR-MV治疗的大鼠肿瘤浸润CD4+淋巴细胞的百分比显著增加了三倍（p=0.036）。在接受MVs治疗的大鼠中未观察到任何差异。与对照组或任何治疗组相比，脾脏或血液中CD4+淋巴细胞的百分比没有变化(图6). 同样，与对照组相比，IR-MV治疗组大鼠的浸润CD8+细胞百分比显著增加两倍（p=0.036）；MVs治疗组大鼠无明显变化。此外，与对照组相比，免疫组的血液和脾脏中CD8+淋巴细胞的百分比没有明显变化(图7).

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辐照与非IR-MV治疗大鼠血液、脾脏和肿瘤中辅助T细胞的比较研究

（A–C）使用MVs、IR-MV或PBS治疗21天后，对血液（A）、脾脏（B）和肿瘤（C）中的CD4+细胞进行流式细胞术分析（对照组）。结果表示为平均值±SEM。*p=0.036，IR-MV与对照。

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血液、脾脏和肿瘤中细胞毒性T细胞的比较研究

（A–C）在对照组和用MV或IR MV治疗的大鼠中进行CD8+的流式细胞术分析。结果表示为平均值±SEM。*p=0.04，IR-MV与对照。

关于调节性T细胞（CD4+CD25+FoxP3+），与对照组相比，在接种IR-MV的大鼠组中观察到这些肿瘤浸润细胞的百分比略有增加（1.5%，p=0.037）。在用MVs处理的组中或在血液中这些细胞的百分比上没有观察到差异(图8). 类似地，自然杀伤（NK）细胞（NKR-P1）和单核细胞和巨噬细胞（CD68+）在血液、脾脏和肿瘤浸润中的百分比在治疗组和对照组之间没有显著差异（数据未显示）。

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血液和肿瘤中调节性T淋巴细胞的比较研究

（A和B）对来自对照大鼠和接受MVs或IR-MV治疗的大鼠的血液（A）和肿瘤（B）中的CD4+/CD25+/FoxP3+细胞进行流式细胞术分析。结果表示为平均值±SEM。*p=0.037，IR-MV与对照。

讨论

尽管GBM的诊断和多模式治疗取得了进展，但这类肿瘤对目前的治疗仍然很难治愈，在过去20年里，患者的生存率和生活质量没有显著改善。22在脑肿瘤中，胶质母细胞瘤仍然是一种致命的疾病，这主要是因为肿瘤细胞能够通过高浸润能力、新生血管生成、诱导免疫抑制和对当前治疗的多重耐药性来改变其微环境并快速适应不利条件。23在这种情况下，重编程是一种允许细胞适应由放射或化疗引起的微环境变化的机制。24几项研究表明，GBM中的MV含有血管生成蛋白、若干mRNA（包括来自突变癌基因的mRNA）以及microRNA甚至基因组DNA，25这使得它们能够抑制免疫系统，增加肿瘤进展，促进侵袭和转移，并产生多药耐药性。26,27,28,29

癌症患者的临床研究测试了从肿瘤细胞中提取的EV的免疫治疗。在对15例III/IV期转移性黑色素瘤患者进行的一期研究中，证实了来自装载MAGE3肽的单核细胞的自体树突状细胞产生EV；皮下给药没有伴随毒性（高于II级）。30在另一项研究中，13名晚期非小细胞肺癌（I–II级毒性）患者皮内注射来源于负载肺癌肽的单核细胞树突状细胞的EV；一些患者经历了疾病的长期稳定和免疫效应物的激活。31Dai等人。32对40例III期和IV期结肠癌患者进行了一期临床研究，这些患者接受了仅从腹水中获得的自体EV或联合粒细胞和单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）治疗；虽然没有观察到相关的治疗反应，但这种治疗是安全的，并诱导了针对肿瘤的特异性细胞毒性T反应。32

考虑到最初的临床经验，我们从非辐射和辐射C6胶质母细胞瘤细胞中分离出MV，以研究其免疫原性潜力，并确定皮下接种应激肿瘤细胞中的MV是否可以刺激实验宿主的免疫系统，从而减少肿瘤生长。值得注意的是，这是首次尝试将辐照自体胶质瘤细胞的MV作为治疗性疫苗接种的研究。在大鼠胶质母细胞瘤模型中，预防性接种外泌体（含MV）可诱导免疫系统激活，刺激体液和细胞免疫，阻止肿瘤植入，并获得长期记忆反应。9然而，尽管诱导了细胞和体液免疫反应，但使用这些外泌体进行治疗性免疫并没有提高植入脑内胶质母细胞瘤的小鼠的存活率。在本研究中，我们观察到接种IR-MV的大鼠肿瘤体积减少了50%以上，而接种MV的大鼠组肿瘤体积没有类似的减少。最近的研究表明，作为对这种应激的反应，辐射诱导MV的释放模式，从而导致细胞代谢和基因表达的改变，从而改变原发性胶质瘤细胞的表型。18同样，当肿瘤细胞暴露于电离辐射等应激条件时，MV上抗原的表达模式会发生变化，从而促进TAA的生成。18此外，众所周知，肿瘤细胞在应激刺激下表达DAMP，如热休克蛋白（HSPs）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）分子、核苷酸和尿酸，它们与MV一起释放；这些DAMP被抗原呈递细胞（APC）表面表达的Toll样受体（TLR）识别，有利于免疫细胞的激活和成熟。18,19IR-MV中包含的DAMP促进TAA的摄取，并通过主要组织相容性复合物（MHC）1类向肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CD8+）表达TAA。为了确定MV疫苗诱导细胞死亡的机制，我们测定了细胞凋亡和坏死的百分比。与非IR-MV组相比，IR-MV治疗组的细胞凋亡显著增加（三倍）。放射治疗可以直接诱导抗肿瘤免疫的激活和调节，促进免疫原性细胞死亡。33,34此外，辐射诱导免疫原性MV的释放；辐射后，肿瘤细胞会释放DAMPS，尤其是HSPs。35这些分子可以被先天免疫系统的细胞识别，有利于特定的抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤细胞的凋亡。36,37我们的结果表明，IR-MV可以促进免疫原性介导的肿瘤细胞死亡。为了分析IR MV治疗是否改变了免疫效应细胞群，我们测量了血液、脾脏和肿瘤浸润中辅助性和细胞毒性T细胞、NK细胞、巨噬细胞和调节性T细胞的百分比。我们的结果表明，携带经IR-MV治疗的皮下胶质瘤的大鼠肿瘤浸润效应细胞的百分比增加。几项研究表明，浸润到肿瘤中的免疫效应群体的增加与更好的预后相关。38,39我们观察到免疫IR-MV的动物肿瘤中CD4+和CD8+淋巴细胞显著增加，调节性T（Treg）细胞略有增加。理论上，肿瘤细胞表达一组抗原，能够刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞的免疫反应，并有利于其增殖和迁移到肿瘤部位。40然而，这种情况并不总是发生，因为这些MV中包含的大多数分子也可能具有免疫抑制作用；因此，有效的免疫治疗必须刺激抗肿瘤效应细胞的增殖，使其能够迁移到肿瘤部位并有效清除肿瘤细胞。根据我们的结果，辐射促进具有特定抗原库的MV的释放(图3)诱导蛋白质含量的变化，并提供有效的抗肿瘤免疫反应，可能通过释放TAAs而增加。在这种情况下，接种IR-MV有助于效应T细胞的扩增，使其能够迁移到肿瘤中，并通过凋亡诱导免疫原性细胞死亡。辐射可能会诱导MV释放出更广泛的抗原库，并表达被宿主免疫系统识别的DAMP，从而产生更有效的抗肿瘤免疫反应。41,42,43我们的结果保证了用IR-MV作为免疫治疗方法的免疫治疗的进一步研究。我们小组建议的一种可能的应用是在诊断后立即应用来自人类胶质母细胞瘤细胞系的IR-MV（手术治疗前最多三次，然后继续化疗和放疗方案）。目前，我们正在进行新的调查，将IR-MV与阻断不同免疫检查站相结合。

结论

鉴于MV在细胞间通讯中的相关性以及肿瘤放疗后的脱落效应中的潜在作用，我们在本研究中表明，免疫IR-MV可能是一种治疗恶性胶质瘤的免疫疗法。IR-MV可能是治疗应用中的新型药物，如肿瘤疫苗接种。使用IR-MV可能是治疗胶质母细胞瘤患者的一种治疗方式。

材料和方法

动物

在整个研究过程中，选用了来自国家神经病学研究所（墨西哥城）动物房的雄性Wistar大鼠（n=30，230-250 g）。在将动物用于实验之前，每笼5只动物被安置在丙烯酸笼子中，并提供标准的商业大鼠饮食（美国印第安纳州里士满市实验室啮齿动物饮食5001，PMI饲料）和水随意.房间保持恒定温度（25°C±3°C）、湿度（50%±10%）和照明（12小时光照和黑暗循环）。根据NIH《实验动物护理和使用指南》和墨西哥卫生部动物伦理使用地方指南，对动物进行所有程序。在解剖过程中，尽一切努力减少动物的痛苦。

细胞培养

C6胶质瘤细胞取自ATCC（美国马里兰州罗克维尔）。细胞在37°C的无菌条件下在5%CO控制的潮湿环境中培养2补充10%胎牛血清（FBS）（Gibco）、4 mM谷氨酰胺、100单位/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM（Gibco-）。

胶质瘤衍生MV的抑制和量化

MV是通过线性加速器TrueBeam Stx（Varian and Brainlab，USA）从非辐射或50 Gy辐射的C6细胞培养物中获得的。辐射72小时后，收集培养基并在200×克去除活细胞和细胞碎片。然后，将上清液以14000×克将MV沉淀20分钟，再悬浮在无菌PBS中。为了定量，MV用Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）（Annexin-V-FLUOS染色试剂盒，罗氏）标记，该试剂盒对磷脂酰丝氨酸具有高亲和力，并通过流式细胞术（FACSCalibur，BD Biosciences）进行分析，考虑到每个样本在30 s内采集的采集速度（采集量和时间）、计数的事件数以及Annexin V阳性事件的百分比。为了进行数据分析，使用了Cell QuestPro（BD Bioscience，USA）和Flow Jo V.10软件。

MV特征

使用NTA检查获得的MV的大小。将获得的MV样品放置在Malvern NanoSight NS300仪器上（NanoSiht，Amesbury，UK），该仪器配备蓝色激光（488 nm）和互补金属氧化物半导体（CMOS）相机，可快速自动分析直径为10至2000 nm的纳米颗粒的粒径分布和浓度，根据仪器的配置和样品的类型。将制剂测量为一式三份（温度22°C；粘度0.95摄氏度[cP]），持续10秒。用于捕获和分析数据的软件为NTA 3.2 Dev Build 3.2.16。

超微结构分析

将来自C6神经胶质瘤细胞的4μL MVs样品在14000×克在4°C下保持20分钟。将获得的颗粒重悬于PBS中。然后将一滴置于先前覆盖有火棉胶（巴洛迪翁）膜的镍格栅上（电子显微镜科学公司，华盛顿，宾夕法尼亚州，美国）。用3%醋酸铀酰对镍栅进行负染，并在60 kV下用Jem 1400 Plus电子TEM（日本东京明岛Jeol）放大40000倍观察。

蛋白质含量

蛋白质提取用1×106C6胶质瘤细胞，106MV和106IR-MV使用ProteoJET细胞质和核蛋白提取试剂盒（发酵剂），并由Lowry定量。使用生物活性蛋白染色试剂分析所得含量。使用Precision Plus分子量标记物（Bio-Rad，Paris），用15%SDS-PAGE凝胶电泳分离C6胶质母细胞瘤细胞和C6胶质瘤细胞的MV的蛋白质含量。凝胶用考马斯蓝染色。

大鼠恶性C6胶质瘤

当C6细胞培养物汇合时，通过胰蛋白酶处理收集细胞并在DMEM中重新悬浮。1 × 107将500μL DMEM中的C6细胞腹腔接种到雄性Wistar大鼠体内，以获得大量C6细胞用于皮下植入肿瘤。3周后，取出腹膜肿瘤并进行机械分解；细胞在DMEM中重新悬浮。1×10的悬浮液7将500μL生理盐水中的活细胞皮下接种到12周龄雌性Wistar大鼠的左大腿。细胞植入后18至20天内，80%的动物出现皮下肿瘤；肿瘤直径达2cm。在这种大小下，没有观察到自发退化。因此，我们只纳入了直径至少为2 cm的皮下C6胶质瘤的大鼠。

C6胶质瘤模型的实验设计

将30只皮下胶质瘤大鼠分为三组。第一组注射PBS（对照组），第二组注射MVs，第三组注射IR-MV（1×10）8MV）。PBS和治疗均用弗氏佐剂（1:1）乳化，并在第0天和第7天皮下注射到肿瘤的对侧大腿。每周评估一次肿瘤生长情况。最后一次注射MVs后21天，通过抽血（事先用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉）将动物处死。测量肿瘤大小，并采集肿瘤、血液和脾脏样本进行进一步分析。

肿瘤体积的测定

每周测量肿瘤的校准游标卡尺；体积计算公式为π/6×长×宽×高。

巨噬细胞、NK细胞和T淋巴细胞亚群

血液、脾脏和肿瘤样本中辅助性（CD4+）和细胞毒性（CD8+）T淋巴细胞、调节性T细胞（CD4+CD25+FoxP3+）、NK杀伤细胞（NKR-P1+）和单核细胞和巨噬细胞（CD68+）的百分比通过流式细胞术使用抗CD4-藻红蛋白（PE）、抗CD8-PE、抗NKR-P-FITC、抗CD25-FITC（Biosource，Washington，USA）进行测定、抗Foxp3-APC（eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥）和标记有与APC偶联的二级抗体的抗CD68单克隆抗体（Biosource，华盛顿，美国）。简言之，将30μL血液或脾脏或肿瘤匀浆与5μL单克隆抗体（1:10稀释）孵育30分钟。随后，加入200μL红细胞裂解液（BD Biosciences），孵育10 min，用PBS洗涤。加入200μL渗透液（BD-Bioscinces），孵化10 min，洗涤，用抗FoxP3-APC孵育30 min，最后用1%多聚甲醛在PBS中洗涤固定。使用CellQuest Pro（BD Biosciences）和flow Jo版本10通过流式细胞术（FACSCalibur，BD Biosciences）分析细胞。

细胞凋亡与坏死分析

部分肿瘤匀浆用于评估凋亡和坏死。用PBS清洗细胞，并用Annexin V和碘化丙啶（PI）（Annexin-VFLOUS染色试剂盒，罗氏）在100μL培养缓冲液中在室温黑暗中染色15分钟。随后，添加200μL缓冲液，并使用Cell QuestPro（BD Biosciences）和flow Jo版本10通过流式细胞术（FACSCalibur，BD Bios ciences。

统计分析

进行Shapiro-Wilk正态性检验以确定参数值。进行方差分析，然后进行Tukey检验。p<0.05的值被认为是显著的。统计测试使用SPSS Statistic 23.0软件（IBM SPSS Statics for Windows，版本23.0，Armonk，NY，USA）。

作者贡献

B.P.构思了实验和理论设计，进行了数据分析，并撰写了手稿。F.J.S.G.构思了实验和理论设计，并进行了数据分析。N.K.O.进行细胞培养，获得、量化和实验表征MV。V.P.C.进行流式细胞术。A.S.R.设计了实验性C6胶质瘤模型。S.M.-J.进行了所有放射治疗。N.H.P.进行了统计分析。A.M.N.分析了MV的蛋白质含量。A.O.P.对MV进行了结构分析。J.S.为数据分析和论文的起草、撰写和批判性修订做出了贡献。所有作者都对手稿进行了审阅、讨论并达成了一致意见。

利益冲突

作者声明没有相互竞争的利益。

致谢

该项目得到了国家科学技术委员会拨款226201的支持。我们感谢费尔南多·拉莫斯博士的部分财政支持。我们感谢Dra。Shantal Lizbeth Baltierra Uribe（ENCB-IPN免疫科核心实验室设施），帮助使用NanoSight仪器。

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