监测神经活动和[Ca²⁺]含基因编码钙²⁺指标

摘要

介绍

钙²⁺是大脑中普遍存在的第二信使，其在流入水平上的调节、与效应蛋白的结合和挤压决定了其控制的各种生理反应(Berridge，1998年). 使用合成钙的成像方法²⁺指示器可探测[Ca²⁺]具有亚微米空间和亚毫秒时间分辨率的动力学(Yasuda等人，2004年). [加利福尼亚州²⁺]成像可以用来监测神经元的活动(Callaway和Ross，1995年;Helmchen等人，1996年;Svoboda等人，1997年;Maravall等人，2000年)和突触(穆勒和康纳，1991年;Yuste和Denk，1995年;Oertner等人，2002年;Nimchinsky等人，2004年)并报告脑切片中神经元数量的动态(Yuste等人，1992年)和体内(O'Malley等人，1996年;Stosiek等人，2003年).

合成钙²⁺传统上，指示剂是通过大量装载膜透性AM-ester引入神经元的(Tsien等人，1982年;Yuste等人，1992年)或右旋糖酐(O'Donovan等人，1993年;O'Malley等人，1996年)衍生物，或通过移液管将单个细胞与细胞阻抗指示剂盐混合(Tank等人，1988年;穆勒和康纳，1991年;Yuste和Denk，1995年;Oertner等人，2002年;Nimchinsky等人，2004年).

尽管取得了成功，但综合指标仍有很大的局限性。首先，它们很难加载到完整大脑中的神经元群中（但请参见Stosiek等人，2003年). 其次，它们不能专门针对特定的细胞类型或亚细胞隔室。第三，一旦装载，合成指示剂就会从细胞质中清除，这使得长期成像实验变得困难。

一个重大突破是基因编码钙的开发²⁺基于荧光蛋白（XFP）的指示剂（GECI）（Miyawaki等人。，1997,1999;Baird等人，1999年;Griesbeck等人，2001年;Nagai等人，2001年). 使用转染、病毒感染、转基因和敲除技术，GECI可以有效地传递到特定的神经元亚群和神经元隔室(J.W.Wang等人，2003年;Yu等人，2003年;Hasan等人，2004年;Y.Wang等人，2004年).

GECI已用于测量[Ca²⁺]蠕虫的瞬态(Kerr等人，2000年;铃木等人，2003年)，只苍蝇(Fiala等人，2002年;Reiff等人，2002年;J.W.Wang等人，2003年;Yu等人，2003年;Y.Wang等人，2004年)，斑马鱼(Higashijima等人，2003年)、和小鼠(Hasan等人，2004年;Ji等人，2004年). 然而，GECI动力学比合成钙的动力学更复杂²⁺指标。使用GECI解释功能成像实验需要定量理解[Ca²⁺]神经活性和GECI荧光。

在这里，我们基于循环置换XFP[Inverse Pericam分析了三个GECI的特性(Nagai等人，2001年)，GCaMP(Nakai等人，2001年)和Camgaroo2(Griesbeck等人，2001年)]大脑切片神经元（参见图1A类). 首先，我们将GECI荧光与神经活动[即动作电位（AP）数和频率]联系起来，并将荧光响应与合成钙测量的荧光响应进行比较²⁺指标。我们的数据表明，GECI是神经活动的非线性指标，在低激发率下敏感性较差。其次，我们将GECI荧光与[Ca²⁺]. 我们的数据表明，GECI荧光与[Ca有复杂的关系²⁺]具有超线性和次线性状态。第三，我们比较就地利用溶液生物化学数据进行生化表征。我们发现一些GECI（GCaMP和Camgaroo2）报告Ca²⁺-依赖性钙调素（CaM）结构转换。

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图1。

用GECI转染的CA1锥体细胞中AP诱发荧光反应的双色成像。A类，本研究中使用的GECI的分子拓扑。结合钙²⁺导致GECI荧光发生变化。Camgaroo2（左）基于cpYFP（黄色荧光蛋白）分子cpCitrine，并将CaM插入cpCitriine桶的两半之间。GCaMP和Inverse Pericam（右）以cpGFP为基础，在cpGFP桶中含有CaM插入的C末端和CaM结合肽M13插入的N末端。B类，表达GCaMP的CA1锥体神经元（绿色；转染后9天），并用500μ米X-Rhod-5F（红色）。黄色区域表示绿色和红色荧光重叠。C、 D类，原发性根尖树突的放大图像（中的方框区域B类; 线扫描位置，白色虚线），显示红色X-Rhod-5F(C类)和绿色GECI(D类)荧光。E、 F类，由一列20个AP以30 Hz的频率诱发的红色和绿色荧光瞬变。在树枝晶的空间范围内平均荧光（白色虚线；顶部），以产生用于后续分析的荧光响应（红色和绿色痕迹；底部）。

材料和方法

DNA构建、转染和切片培养。Camgaroo2来自R.Tsien（加利福尼亚大学圣地亚哥分校，加利福尼亚州圣地亚哥）(Griesbeck等人，2001年)，GCaMP来自J.Nakai（日本冈崎市妙代寺国立生理科学研究所信息生理学系）(Nakai等人，2001年)，Inverse Pericam来自A.Miyawaki（RIKEN）(Nagai等人，2001年)增强型绿色荧光蛋白（EGFP）来自Clontech（Cambridge，UK）（pEGFP-N1）。GCaMP和Camgaroo2中的CaM序列来自大鼠和爪蟾但具有100%的蛋白质序列相似性。逆Pericam含有CaM，其第三钙结合环（E104Q）发生突变(Evenas等人，1998年). 用于GCaMP和逆Pericam的M13结构域来自平滑肌肌球蛋白轻链激酶CaM结合肽(Peersen等人，1997年). 所有实验方案均按照美国国立卫生研究院动物研究指南进行，并得到冷泉港实验室动物护理和使用委员会的批准。从出生后第6天（P6）或P7大鼠制备培养海马切片(Stoppini等人，1991年)并使用颗粒介导的生物抑制性基因转移进行转染(麦卡利斯特和史蒂文斯，2000)5-9天在体外表达时间为7-14天。

电生理学。选择转染或相邻的未转染细胞（切片中20-50μm深）进行全细胞记录（参见图1B类). 在人工脑脊液（ACSF）中进行记录，包括（单位：m米)127氯化钠，25氯化钠_三, 25d日-葡萄糖，2.5 KCl，4 MgCl₂，4氯化钙₂和1.25 NaH₂人事军官₄，用95%O连续充气₂/5%一氧化碳₂.细胞内溶液由130 m组成米KMeSO公司_三，10米米HEPES，4米米氯化镁₂，4米米纳₂ATP，0.4米米NaGTP，10米米磷酸钠，3 m米抗坏血酸和500μ米X-Rhod-5F和/或Fluo4-FF；用KOH将pH值调节至7.3。记录是在ACSF的室温下进行的。为了诱发APs，细胞被保持在电流灯配置下，通过记录电极注入3-5nA电流2毫秒。转染细胞（GECIs和GFP）和未转染细胞的静息膜电位和输入电阻没有差异（数据未显示）。

成像。我们使用了一台定制的双光子激光扫描显微镜（2PLSM），带有奥林巴斯物镜（60×0.9数值孔径）和一台钛宝石激光器（Mira；Coherent，Santa Clara，CA），调谐至λ=910 nm。在外荧光和反荧光模式下检测到荧光(Mainen等人，1999年)带光电倍增管（R3896；日本滨松市滨松）。使用双色镜（565nm）分离绿色和红色荧光。BG22彩色玻璃滤光片和607/45屏障滤光片分别放置在“绿色”和“红色”通道中，以消除透射或反射的激发光（所有滤光片及二向色性材料均来自Chroma、Brattleboro、VT）。使用电光调制器（EOM；型号350-80 LA；康普顿丹伯里Conoptics）以微秒时间分辨率对激光功率进行调制。图像采集由ScanImage控制(Pologruto等人，2003年).

在大多数实验中，神经元被“红色”合成钙负载²⁺指示器（X-Rhod-5F；500μ米;K（K）_D类= 1.9 μ米室温下）。在某些情况下，我们还使用了“绿色”合成指示剂（Fluo4-FF；500μ米;K（K）_D类= 10.4 μ米室温下；合成指示剂购自俄勒冈州尤金的Molecular Probes）(Yasuda等人，2004年). 加载期间，[Ca的振幅²⁺]监测单个AP产生的瞬态。只有在达到平衡后（断裂后约20分钟）才开始收集数据(补充材料，网址为网址：www.jneurosci.org) (Maravall等人，2000年). 在开始全细胞记录后，报告细胞质绿色蛋白（GFP和GECIs）浓度的基线绿色荧光随时间缓慢下降（50分钟内约40%），与冲刷一致。

在大多数实验中，当以500 Hz的频率扫描与树突顶端相交的线时，收集荧光（绿色和红色）（参见图1C、 D类). 对树枝晶上的荧光信号进行平均，以获得荧光时间过程，F类（请参见图1E、 F类). 在每张图像的开头收集50毫秒的光电倍增管暗噪声（快门关闭）（参见图1E、 F类)，并从中减去平均暗噪声F类.基线荧光(F类₀)是刺激前200毫秒窗口内的平均荧光。ΔF类/F类计算为Δ前/后= (F类-F类₀)/F类₀.

游离钙浓度变化，Δ[Ca²⁺]，并且荧光饱和度变化Δξ由ΔF类/F类使用一种依赖于估算饱和Δ[Ca引起的荧光增加的方法²⁺][(ΔF类/F类)_最大值]，分别使用方程式1a和1b(Maravall等人，2000年):

1a个

1亿

F类是指示器的荧光。是指示剂荧光饱和的程度，表示为分数（范围，0-1）。K（K）_D类是钙指示剂的有效离解常数²⁺，定义为[Ca²⁺]其中荧光半饱和（即，当[Ca²⁺] =K（K）_D类).R（右）_如果是指示器的动态范围，以及R（右）_如果=F类_最大值/F类_最小值.K（K）_D类和R（右）_如果之前测定了合成钙²⁺指示器(Yasuda等人，2004年).

由于Δ[Ca的弱相关性²⁺]上的R（右）_如果，该方法可用于量化Δ[Ca²⁺]对于大尺寸指示器具有良好的精度R（右）_如果，如X-Rhod-5F和Fluo4-FFR（右）_如果X-Rhod-5F的值与荧光的最大变化[（ΔF类/F类)_最大值]与Fluo4 FF相比在细胞中获得(表1)因为细胞中不同的染料相互作用(Maravall等人，2000年). 静息钙的估计值²⁺]₀和静止荧光饱和度Φ₀也可以使用此方法获得(Maravall等人，2000年).

两种钙的使用²⁺指示器允许测量[Ca²⁺]其中一个指示剂和另一个的荧光饱和度，。当一种指示剂的生化特性已知而另一种指示符的特性未知时，这是有用的（参见补充材料，网址为网址：www.jneurosci.org). 我们测量[Ca²⁺]使用具有已知性质的合成指示剂和结合化学计量学（使用方程式1a），而对于未知指示剂，则测量。我们使用两个具有已知属性的合成指标验证了该方法，并将其中一个指标视为未知指标（参见图5和补充材料，网址为网址：www.jneurosci.org) (Yasuda等人，2004年).

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图5。

基因编码钙与合成钙的比较²⁺指示荧光饱和度。荧光饱和曲线（Φvs[Ca²⁺]; 平均值±SEM）拟合（实线）到一般希尔模型（等式1）。A类，X-Rhod-5F荧光饱和度与[Ca同时测量²⁺]（使用Fluo4-FF）。数据显示与合成钙的预期值非常一致²⁺指示器(表1).B-D公司，与[Ca同时测量的GECI荧光饱和度²⁺]使用X-Rhod-5F(表1).

荧光饱和曲线（vs[Ca²⁺])（请参见图5)使用这种双诱导方法获得，并适用于广义Hill模型：

2

K（K）_D类始终定义为[Ca²⁺]当=0.5时，无论n个.何时n个=1时，Hill模型简化为熟悉的双曲约束曲线。什么时候？n个>1，绑定为非双曲线（sigmoidal）。α和β分别是标度因子和非特异性结合因子。它们可用于归一化荧光饱和度曲线，以确定生化参数(K（K）_D类和n个)正确。

用方程2拟合荧光饱和度曲线以确定α，β，K（K）_D类、和n个，归一化⌀（′）计算为：

三

一旦确定了¼′，则进行另一次拟合（¼′vs[Ca²⁺])确定报告的生化参数，K（K）_D类和n个(α, β = 0) (表1).

对周期性AP刺激的荧光瞬态响应进行分析，以确定在AP序列中检测单个AP荧光响应的灵敏度。荧光曲线用五次多项式拟合。从原始数据中减去此最佳拟合多项式，以消除低频趋势。根据去渲染荧光时间序列计算功率谱（参见图4).

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图4。

基因编码和合成钙的频率响应²⁺指示剂荧光。荧光时间序列的功率谱（来自图3A-E公司)计算了X-Rhod-5F的光谱(A类)和GCaMP(B类)所示为20 Hz AP序列。A类，X-Rhod-5F荧光功率谱显示AP序列频率（基波；20 Hz）及其谐波的显著峰值。B类GCaMP荧光功率谱没有显示出明确的峰值，即使在AP序列频率（20 Hz）下也是如此。

光漂白后的荧光恢复。进行光漂白后荧光恢复（FRAP）实验以测量GECI在细胞质中的迁移率。使用2PLSM在高倍镜下对树突棘进行成像（视野1.5×1.5μm²)在平行于母枝晶的脊柱上进行直线扫描（参见图6A、 B类). 获得了338毫秒的基线，然后是持续50毫秒的漂白期和持续4秒的恢复期。在漂白期间，使用EOM将激光功率增加了5到10倍（漂白程度对恢复时间常数没有显著影响；数据未显示）。荧光恢复曲线与时间常数τ的单指数拟合（参见图6D、 E类). 所有分析都是在MATLAB中完成的（马萨诸塞州纳蒂克市MathWorks）。

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图6。

FRAP显示GECI具有类似于GFP的活动性。A类，来自转染GFP细胞的顶端树突区域，用于FRAP测量。B类，FRAPed脊柱的放大图像（中的方框区域A类)，用于行扫描FRAP的区域用黑线表示。C类，标记区域的荧光B类显示漂白（50毫秒漂白时间）和原始荧光痕迹的恢复。D类，标记区域的归一化荧光B类光漂白前后。恢复时间常数是通过将荧光恢复拟合为单指数来测量的。E类，表达GFP、GCaMP、Camgaroo2和Inverse Pericam的细胞中单个棘的恢复寿命（圈）的累积概率分布。Kolmogorov-Smirnov成对比较显示分布是相同的(第页> 0.3).F类，平均恢复时间相同（ANOVA；第页>0.3），与GFP相似。方框图（黑线）显示平均值（中心线）以及95%置信区间（平均线上方和下方的黑色梯形）。

结果

GECI对AP的回应

为了表征GECI对各种神经刺激的反应，我们对培养海马脑片中锥体细胞的近端顶端树突（直径5-9μm；距胞体13-38μm）进行了成像(图1). AP在胞体中生成，并可靠地增殖到近端顶端树突(Callaway和Ross，1995年)，触发Ca²⁺通过电压敏感钙的流入²⁺通道(Jaffe等人，1992年;Helmchen等人，1996年;Johnston等人，1996年;Sabatini和Svoboda，2000年;Sabatini等人，2002年;Yasuda等人，2003年).

我们比较了GECI和X-Rhod-5F产生的AP-诱发荧光变化(图2A类). X-Rhod-5F对钙的亲和力较低²⁺比GCaMP(Nakai等人，2001年)和反转Pericam(Nagai等人，2001年)与Camgaroo2相似(Griesbeck等人，2001年) (表1). 在我们的实验条件下，钙的缓冲²⁺X-Rhod-5F未显著干扰GECI荧光(补充材料，网址为网址：www.jneurosci.org). 作为对单个AP的反应，合成指示剂（X-Rhod-5F）产生强烈、快速的荧光变化(图2A、 B类) (ΔF类/F类振幅，0.2±0.04；平均值±SD）随特征时间常数（500±85毫秒）衰减。相反，GCaMP和Inverse Pericam只产生非常小的荧光反应（ΔF类/F类振幅分别为0.05±0.03和0.15±0.08）；只有在多次（8-16次）试验中取平均值时，才能检测到这些噪声(图2A-C、E). 未检测到Camgaroo2对单个AP产生的荧光变化(图2D类). 因此，尽管其对Ca的亲和力相对较低²⁺与GECI相比，X-Rhod-5F对单个AP的检测更为敏感。

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图2。

对AP的荧光反应。A类，13次试验中平均的单次AP-激发荧光瞬变。比例尺适用于所有记录道。右，X-Rhod-5F和GCaMP对一个AP的反应的展开图（左起方框区域）（轨迹上方的线表示刺激持续时间）。B-E公司，对X-Rhod-5F系列AP的响应(B类)，GCaMP(C类)，卡姆加罗2(D类)、和反向Pericam(E类). X-Rhod-5F单AP荧光响应的缩放副本已覆盖在C-E公司（灰色痕迹）。每个轨迹是来自同一细胞的四到八次试验的平均值。

接下来，我们测量了一系列AP的荧光反应。GCaMP开始在20 Hz下对>5个AP的列车显示出清晰的荧光响应(图2C类)荧光变化随刺激强度（即AP数量和列车频率）增加而增加。Camgaroo2需要高强度列车（20 Hz时>10个AP）(图2D类)以产生稳健的信号。虽然Camgaroo2的动态范围最大[（ΔF类/F类)_最大值]GECI之间(表1和补充材料，网址为网址：www.jneurosci.org)，即使是最密集的AP列车也只能访问该范围的一小部分（<50%）(图2D类). 逆Pericam对低频列车有一定反应，但反应幅度随刺激强度变化不大(图2E类)，表明该指示器的动态范围有限(表1和补充材料，网址为网址：www.jneurosci.org).

不同类型的指标对生理活动模式的敏感性如何？人们想知道使用特定指示器可以在噪声上方检测到哪些最小的神经信号。一般来说，这需要在任何实验情况下单独确定，因为信噪比（SNR）取决于指示剂Ca的浓度²⁺在感兴趣的细胞或隔室中的处理、激发水平、取样细胞质的体积、光毒性对光照强度的限制、噪声源等(Yasuda等人，2004年). 然而，在培养脑切片相对理想的成像条件下，我们可以同时比较不同指标的表现。

为了表征不同指标的灵敏度，我们确定了在特定SNR下可以检测到哪些AP突发(图3). 对应于SNR=1、2和3的荧光变化(图3A-E公司，水平虚线）转换为AP编号和频率(图3F-J公司). 这些测量结果证实Fluo4-FF和X-Rhod-5F可以检测到SNR～2的单个AP(图3F、 G公司). 需要提供更强烈的刺激以实现与GECI相同的信噪比，例如，GCaMP和Camgaroo2分别有5个20 Hz的AP和33个50 Hz的AP(图3H、 我). Inverse Pericam即使在高强度训练中也有很小的信噪比(图3J型). 一般来说，GECI倾向于低估低频活动，包括单个AP。

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图3。

AP荧光反应的SNRs。附加AP序列（频率：20、30、50和70 Hz）的数据补充材料（网址：网址：www.jneurosci.org).A-E公司，以20和70 Hz频率传递的AP序列的荧光响应[黑色轨迹是平均响应，彩色轨迹表示SEM，虚线水平线表示不同的SNR；1，蓝色；2，绿色；3，红色]。信噪比是Δ的比值F类/F类Δ的SDσF类/F类背景荧光。红色(A类; X-Rhod-5F；N个=8个单元格）和绿色(B类; Fluo4-FF；N个=8个细胞）合成钙²⁺指标对所有刺激作出反应，包括单个AP。GCaMP公司(C类;N个=13个单元格），Camgaroo2(D类;N个=6个单元格）和反向Pericam(E类;N个=9个细胞）对低频AP序列的反应较差（亚线性），而对较强的刺激则为超线性。F-J公司，左，引出给定SNR所需的活动（AP编号和频率）（闭合圈；SNR的颜色与中的相同A-E公司). 如果指示符从未达到特定的SNR，则将该值设置为已交付的AP的最大数量（空心圆圈）。提供的最大AP数量如下：20个AP用于20和30 Hz，33个AP用于50 Hz，47个AP用于70 Hz。单个AP可以为合成Ca生成SNR～2²⁺指示器(F、 G公司). GCaMP公司(H（H）)，卡姆加罗2(我)、和反向Pericam(J型)需要更强的刺激才能获得与合成指标相同的信噪比。F-J公司右，单个细胞对SNR～2刺激的单独试验（彩色线；黑色平均反应；用50毫秒平均滤波器平滑）。

合成指标对[Ca升高快速反应（<1 msec）²⁺] (Sabatini和Regehr，1998年;Sabatini和Svoboda，2000年)，使每个AP的指示荧光发生逐步变化(图3A、 B类). 因此，荧光变化可用于检测AP。在某些条件下，该策略可能允许光学检测神经网络中尖峰活动的时间模式(Smetters等人，1999年). 为了确定GECI是否能够检测到快速荧光变化，我们对周期性AP序列的荧光响应进行了频域分析（即计算功率谱）(图4)（参见材料和方法）。功率谱测量特定频率下信号的功率。如果指示器可以跟随周期性刺激，则频谱应在刺激频率处显示一个较大的峰值。适用于X-Rhod-5F(图4A类)和Fluo4-FF（未显示数据），功率谱的主峰对应于刺激或基频(图4A类，箭头），即使是使用的最大刺激频率（70 Hz；未显示数据）。因此，X-Rhod-5F和Fluo4-FF都对钙有反应²⁺提升速度足够快，能够可靠地遵循刺激模式。相反，即使在最有利的条件下（20 Hz），GECI功率谱也没有在刺激频率下的噪声上方显示出清晰的峰值(图4B类，GCaMP）。因此，与合成指标不同，GECI响应太慢，无法在突发事件中跟踪单个AP。

讨论

基于XFP的GECI在细胞和神经科学系统中前景广阔（Miyawaki等人。，1997,1999;Baird等人，1999年;Griesbeck等人，2001年;Nagai等人，2001年). 我们分析了GCaMP、Camgaroo2和逆Pericam荧光与神经活性和胞浆游离钙的关系²⁺浓度，[Ca²⁺]. 我们发现，所有GECI都能向高频AP序列发出稳健的信号，但在低发射率下灵敏度较差。GECI荧光与[Ca的关系²⁺]是复杂的，有超线性和次线性两种状态，并且取决于特定的指标。GECI也与脊椎细胞质中的不动CaM-结合蛋白没有显著关联。

GECI作为CaM激活传感器

我们的扩散测量表明，GECI具有类似于GFP的活动性，并且在脊椎中没有显著的固定部分(图6). 因为CaM-结合位点可能是固定的[例如，固定在一个大的蛋白质复合物上，如离子通道(Saimi和Kung，2002年)]这意味着GECI上的CaM结构域与不动CaM结合蛋白没有实质性的相互作用。我们的结果与Hasan等人的结果不同(2004). 他们可能测量了与生物合成室重叠的神经元区域中的FRAP，这可能解释了他们数据中的不动部分(Hasan等人，2004年).

我们的数据表明，GECI荧光变化反映了传感器的分子内动力学。GECI荧光变化报告什么？我们将我们的测量值与钙之间相互作用的生化测量值进行了比较²⁺和CaM。我们想知道Ca²⁺M13存在和不存在时CaM的饱和度(Falke等人，1994年;Peersen等人，1997年;Mirzoeva等人，1999年)分别对应于GCaMP和Camgaroo2的荧光饱和曲线(表1)（自由CaM：K（K）_D类= 15 μ米,n个= 1.2; CaM-M13：K（K）_D类= 1.25 μ米,n个= 1.7). 虽然曲线在性质上相似，但GCaMP荧光饱和曲线的陡度超过了基于钙协同结合的预期值²⁺在M13存在的情况下转化为CaM(表1).

因为荧光与钙的耦合²⁺在GECI必须有结构基础的情况下，我们探讨了GECI的荧光饱和度是否反映了Ca²⁺-在M13结合肽存在（GCaMP）和不存在（Camgaroo2）的情况下诱导CaM的结构转变。X射线散射可以测量高分子复合物的最大尺寸和回转半径(Trewella，1997年)溶液中。不同钙含量CaM的X射线散射研究²⁺（0、1、2、3和4钙²⁺当分子超过50%（2 Ca²⁺)饱和度(图7A类) (Krueger等人，1998年). 这与GCaMP观察到的陡峭过渡相似。相反，游离CaM随着Ca的增加而逐渐增大²⁺离子结合(图7B类) (Trewella，1992年;Krueger等人，1998年;Komeiji等人，2002年)类似于Camgaroo2的行为。

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图7。

GECI荧光变化与CaM结构转变耦合。A类，与来自x射线散射研究的M13肽相关的CaM结构转变。荧光饱和度的突变与M13-CaM复合体在Ca后的结构坍塌[即，最大尺寸（实线）和回转半径（虚线）均减小；详见讨论]有关²⁺加载。绘制GCaMP荧光图以进行比较。结构数据（填充圆和正方形）来自Krueger等人的研究(1998).B类，游离CaM的结构转变。钙的占用²⁺-结合位点增加了CaM结构的稳定性，导致N端和C端结构域的重新定向，并增加了中心螺旋的α螺旋含量(Sun等人，1999年). 这将导致游离CaM分子在Ca之后伸长²⁺载荷（增加最大尺寸和回转半径；详见讨论）。绘制Camgaroo2荧光图以进行比较。结构数据（填充圆和正方形）来自Krueger等人的研究(1998). 实线（最大尺寸）和虚线（回转半径）是点之间的线性插值，反映了Ca之后自由CaM的逐步延伸²⁺加载。

这些相似性表明，GCaMP和Camgaroo2分别在存在和不存在M13肽的情况下报告CaM激活。许多CaM依赖性酶，包括钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII），通过CaM结合来缓解自身抑制（ROA），从而变得活跃。CaMKII ROA是一种结构现象，涉及Ca之后伪基底区域从基底结合位置的位错²⁺与CaM结合(Lisman等人，2002年). 因此，一个理想的CaM-依赖酶激活报告者将读出ROA在酶所在的同一隔间中的结构转换。GCaMP的行为类似于ROA中CaM的监视器。它将CaM与靶肽（M13）的结合与Ca偶联²⁺结合，在络合物凝聚时改变其荧光(图7A类). 相比之下，Camgaroo2可以作为自由CaM加载Ca的监视器²⁺(图7B类). 这表明GCaMP和Camgaroo2或这些指标的变体可以用于探索针对CaM激活进行优化的生理信号就地.

脚注

工具书类