变异脑源性神经营养因子（BDNF）（Met66）改变神经分泌细胞和皮层神经元中野生型BDNF的细胞内转运和活性依赖性分泌

摘要

介绍

脑源性神经营养因子（BDNF）在脊椎动物神经系统和心血管发育和功能中起着关键作用(Tessarollo，1998年;Huang和Reichardt，2001年;赵，2003). 最近bdnf公司导致前结构域66位缬氨酸（Val）到蛋氨酸（Met）取代的基因（BDNF_遇见)杂合子多态性与人类对神经精神疾病（包括阿尔茨海默病）的易感性增加有关(Ventriglia等人，2002年)、帕金森氏病(Momose等人，2002年)，双相情感障碍(Neves-Perira等人，2002年;Sklar等人，2002年)，抑郁症(Sen等人，2003年)，进食障碍(Ribases等人，2003年)和强迫症(霍尔等人，2003年). 此外，人类BDNF杂合子_遇见有记忆障碍(Egan等人，2003年;哈里里等人，2003年). 这种多态性代表了BDNF改变与临床功能障碍的首次关联。关于BDNF功能改变的分子机制知之甚少。在一项研究中，当BDNF自身在海马神经元中表达时，BDNF减少_遇见以依赖活动的方式分泌(Egan等人，2003年).

从生物合成途径贩运BDNF是一个复杂、高度调控的过程，其机制尚不清楚。在这种情况下，关于Met替代物对BDNF贩运的这种影响的特异性，还有几个问题有待解决。首先，BDNF中的这种取代突变是否会在这种神经营养素（NT）的运输中产生一般性或细胞类型特异性缺陷？目前，只有BDNF的贩运_遇见在海马神经元中进行了检测(Egan等人，2003年). BDNF在某些外周细胞群中的表达减少，如内皮细胞和血管平滑肌细胞，对发育有重要影响，包括血管不稳定和心内出血(Donovan等人，2000年). 第二，BDNF的共表达_遇见改变野生型BDNF（BDNF）的贩运或加工_瓦尔)? 以前的研究表明，在同一细胞中共存不同的神经营养素可以改变其中一种神经营养素的贩运命运(Farhadi等人，2000年). 当BDNF和BDNF都存在时，贩运缺陷的性质仍不清楚_遇见和BDNF_瓦尔在同一个单元格中表达。这是相关的，因为据估计，20–30%的人口是Met多态性的杂合子(Neves-Perira等人，2002年;Egan等人，2003年;哈里里等人，2003年;Sen等人，2003年)其中野生型和变异型BDNF平等共存。在人类中观察到的主要表型，记忆障碍，已经证明在这些受试者中存在Met多态性的杂合子(Egan等人，2003年;哈里里等人，2003年).

为了解决Met多态性在BDNF转运中的作用的这些问题，我们对BDNF的细胞内和细胞外命运进行了分析_遇见和BDNF_瓦尔在内源性产生和分泌BDNF的非神经元和神经元细胞中。我们得出结论，BDNF多态性只影响神经细胞的贩运，并确定当BDNF在同一细胞中共同表达时_遇见改变BDNF的贩运_瓦尔通过形成异源二聚体，而异源二聚体在调节分泌途径中的分类效率较低。

材料和方法

试剂和抗体。小鼠NGF来自Harlan Bioproducts（印第安纳波利斯），人类重组BDNF来自PeproTech（新泽西州洛基山）。抗-FLAG抗体从Sigma（密苏里州圣路易斯）（单克隆、M2和多克隆）获得，抗HA（血凝素）抗体从Covance（新泽西州普林斯顿）（单抗、HA.11）和Sigma。抗分泌角蛋白II（SecII）抗体来自Biodesign（Saco，ME）。抗-MAP2（微管相关蛋白2）抗体来自Sigma，抗Tau1抗体来自Chemicon（Temecula，CA）。如前所述，产生了多克隆抗前BDNF和抗前NGF抗体(Beattie等人，2002年). ϵ-氨基酸（EACA）购自美国诊断公司（康涅狄格州斯坦福德）。荧光二级抗体来自分子探针（尤金，OR）和杰克逊免疫研究（西格罗夫，PA）。限制性内切酶购自Fermentas（Hanover，MD），Pfu Turbo DNA购自Stratagene（La Jolla，CA）。所有其他化合物均来自Sigma。

质粒构建物。将人BDNF和NGF cDNA亚克隆到pCDNA3.1湿表达载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，使用Hin公司dIII和Xho公司I站点。用PCR方法将HA或FLAG表位标签添加到BDNF或NGF cDNA的3′端。此外，NGF C末端附近的残基RR突变为AA，以消除潜在的蛋白水解切割位点。通过两步PCR产生66位Val-to-Met突变。使用基于PCR的突变不是在人BDNF或人NGF的信号肽后立即生成I位点，以便于生成双肽标记的HA-BDNF-FLAG和HA-NGF-FLAG结构。HA标签插入BDNF或NGF信号肽后，FLAG标签附着在BDNF和NGF的C端。所有构建物均通过DNA序列确认，以排除潜在的PCR-引入突变。

PC12和COS-7细胞培养、免疫沉淀和免疫印迹。PC12（克隆615）细胞，稳定过度表达TrkA受体(Hempstead等人，1992年)在DMEM（Invitrogen）中保存，DMEM含有10%胎牛血清（Invit罗gen）、5%马血清（Invitrogen米谷氨酰胺加200μg/ml G418（Invitrogen）。COS-7细胞保存在含有10%胎牛血清的DMEM中，补充100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和2 m米谷氨酰胺。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染细胞中的DNA。转染48小时后，收集裂解物或条件培养基，并按前述方法进行Western blot分析(Lee和Chao，2001年). 简单地说，为了进行顺序免疫沉淀实验，收集裂解物，并用多克隆HA抗体（Sigma）孵育，然后用蛋白A Sepharose珠（Sigma]孵育。收集剩余的裂解产物并与多克隆FLAG抗体（Sigma）孵育。通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad，Hercules，CA），并使用HA.11（Covance）或FLAG M2抗体（Sigma）进行免疫印迹，从而进行蛋白质印迹。通过增强化学发光检测免疫反应蛋白带（Pierce，Rockford，IL）。对于密度分析，使用NIH图像扫描免疫反应带并量化强度（Scion，Frederick，MD）。

平滑肌细胞培养。最初从表达温度敏感性猴病毒40（SV40）T抗原的转基因小鼠系的主动脉外植体生长的温度敏感性小鼠平滑肌细胞(Kraemer等人，1999年)在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，补充100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和2 m米谷氨酰胺在33°C，T抗原表达的温度。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染BDNF质粒一天后，将温度升高至39.5°C，在该温度下T抗原降解，细胞表现出更分化的表型。所有实验均在转染后48小时进行。

内皮细胞培养。含有SV40 T抗原的永生内皮细胞(Schweitzer等人，1997年)在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，补充100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和2 m米谷氨酰胺。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染细胞中的DNA。所有实验均在转染48小时后进行。

皮层细胞培养。胚胎第18天大鼠皮质神经元的分离原代培养物是从怀孕的Sprague-Dawley大鼠中制备的。胎儿在无菌条件下取出，保存在PBS中的冰上，用于大脑皮层的显微解剖。取出脑膜，将组织置于神经基底培养基（Invitrogen）中。用细镊子将组织切碎，然后用火焰抛光的巴斯德吸管研磨。计数细胞并将其放置在涂有0.01 mg/ml聚乙烯的培养孔上-d日-赖氨酸在含有B27补充剂（Invitrogen）和我-谷氨酰胺（0.5米米)（Invitrogen）。实验在电镀后4天进行。

免疫细胞化学染色和荧光显微镜。PC12（615）细胞或皮层神经元生长在玻璃盖玻片（科宁，科宁，纽约）上，覆盖有聚乙烯-我-赖氨酸（Sigma），并转染表位标记的神经营养素构建物。转染48小时后，用4%多聚甲醛溶液将细胞固定在PBS中，用冷甲醇短暂处理（5分钟）使其渗透，然后用PBS冲洗三次。用5%的山羊血清在PBS中封闭细胞30分钟。用一级抗体培养标本，然后用亚型特异性荧光二级抗体培养。使用安装在尼康（日本东京）TE2000显微镜上的CoolSNAP CCD相机（PhotoMetrics，Huntington Beach，CA）对染色PC12标本进行外荧光显微镜检查，该显微镜配备有电动Z驱动器和100×，1.4数值孔径物镜或60×1.4数字孔径物镜和标准FITC–Texas Red二向色滤光片组。使用Zeiss（德国Oberkochen）LSM510显微镜对皮层神经元标本进行共焦荧光显微镜观察，该显微镜配备Zeiss 63×1.4数字孔径物镜，带有标准滤光片组和标准（一个Airy圆盘）针孔。

荧光图像的定量分析。为了定量PC12细胞或皮层神经元不同区域的BDNF染色量，随机检查了约20个表达表位标记BDNF的细胞。对于PC12细胞，使用安装在尼康TE2000显微镜上的Z驱动器获得三维（3D）图像堆栈。对于皮层神经元，通过共焦显微镜对细胞的整个3D堆栈进行成像。对于每个3D图像堆栈，从每个单独的切片中减去背景，并使用MetaMorph软件（Universal Imaging Corporation，West Chester，PA）中的3D重建模块重建图像堆栈。每个细胞内划定了两个区域，以表示细胞体和过程（参见图4D类). 对所有切片中每个区域的积分强度进行了汇总。在两种BDNF在同一细胞中共转染的实验中，BDNF的染色强度_瓦尔物种的定量方法与单一染色条件下的定量方法相同。汇编了四个独立实验的结果，并通过误差条显示了这些实验之间的SEM。

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图4。

变体和野生型BDNF的加工和定位。A类，分化后的PC12细胞转染BDNF_瓦尔（Val）或BDNF_遇见（Met）分别含有C末端HA表位或C末端FLAG表位标签。48小时后将细胞固定并渗透，并使用抗-HA或抗FLAG抗体通过间接免疫荧光显微镜观察神经营养素的亚细胞分布，如材料和方法中所述。显示了典型的外荧光图像。B类，分化后的PC12细胞转染了两种BDNF_瓦尔包含C末端HA表位和BDNF_遇见包含C末端FLAG表位。48小时后固定细胞并使其透化，使用表位抗体通过间接免疫荧光显微镜观察神经营养因子的亚细胞分布。显示了典型的外荧光图像。C类，皮层神经元转染BDNF_瓦尔（Val）含有C末端HA表位BDNF_遇见（Met）含有一个C末端FLAG表位或两个BDNF_瓦尔包含C末端HA表位和BDNF_遇见包含C末端FLAG表位（Val/Met）。48小时后将细胞固定并渗透，如材料和方法中所述，使用表位抗体通过共焦显微镜观察神经营养素的亚细胞分布。对于共压制BDNF_瓦尔和BDNF_遇见，对HA表位进行染色。此外，所有神经元均与MAP2或Tau1共染，以分别确定BDNF在树突和轴突中的定位（白色箭头）。显示了具有代表性的重建图像。D类，PC12细胞结果的定量分析如所示B类，如材料和方法中所述。定位于细胞体或过程的总荧光比例表示为四个独立实验分析得出的平均值±SEM。(*第页< 0.01; **第页< 0.001; 学生的t吨测试）。E类，皮层神经元结果的定量分析，如所示C类，如材料和方法中所述。定位于细胞体或过程的总荧光比例表示为四个独立实验分析得出的平均值±SEM。(*第页< 0.01; **第页< 0.001; 学生的t吨测试）。

为了量化BDNF和分泌颗粒标记物SecII之间的共定位比例，使用适当的过滤装置通过外荧光显微镜检查PC12细胞，以选择性检测Alexa488（FLAG）和Cy3（SecII）。使用安装在尼康TE2000显微镜上的Z驱动器获得光学切片，并选择荧光强度最大的切片。对于皮层神经元，在z（z）-轴，选择荧光强度最大的切片。使用MetaMorph软件（Universal Imaging Corporation）中的共定域模块量化每个荧光的染色强度和共定域比例。随机检查了大约20个细胞。汇编了四个独立实验的结果，并通过误差条显示了这些实验之间的SEM。

ELISA法。PC12（615）细胞（4.5×10⁵)被播种到六孔板上。转染前一天，将细胞置于分化培养基中（1.5%马血清、1%胎牛血清和50 ng/ml NGF）。然后，4μgof BDNF_瓦尔，4μg BDNF_遇见或2μg BDNF_瓦尔加上2μg BDNF_遇见每个井都添加了构造。转染48小时后，用含有以下成分（单位：m米)：125氯化钠、4.8氯化钾、2.6氯化钙₂，25 HEPES，1.2 MgSO₄、5.6葡萄糖、1抗坏血酸钠和1.2 KH₂人事军官₄，用NaOH调节至pH 7.4。在37°C下孵育2小时后收集条件培养基，并用作组成性分泌的测量。为了确定调节分泌，用KRH缓冲液清洗细胞三次，然后在37°C的刺激培养基中培养10分钟【KCl浓度增加的KRH缓冲器（56 m）】米)NaCl浓度降低（75 m米)]. 以重组BDNF为标准，使用BDNF-Emax免疫分析系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）测定各培养基样品中的BDNF蛋白浓度。标准品和样品一式两份，每组包含12份独立样品。收集条件培养基后，固定细胞并进行免疫染色，以确定转染效率。每个样本的一致转染效率为～30%。

BDNF分泌型的分析。用4μg BDNF转染分化的PC12（615）细胞_瓦尔，4μg BDNF_遇见或2μg BDNF_瓦尔加上2μg BDNF_遇见结构。转染48小时后，用KRH缓冲液洗涤细胞三次，并在不存在或存在EACA（10 m米)，抑肽酶（10μg/ml）和α₂-纤溶酶抑制剂（100n米). 然后将细胞在37°C的刺激KRH培养基中培养10分钟，该培养基含有增加的KCl浓度（56 m米)NaCl浓度降低（75 m米). 用增强化学发光法（Pierce）检测免疫反应蛋白带。

结果

BDNF原形的鉴定和成像

为了可视化BDNF的细胞内定位和转运，我们生成了一系列表位标记的神经营养素表达结构，其中包含C-和/或N-末端表位标记序列的组合。对同一BDNF分子上的C末端和N末端表位进行免疫检测，可以通过免疫荧光显微镜对BDNF前体和成熟体进行成像。该系统允许我们评估同一牢房内Met替代物产生的加工和贩运变化。

因为已经观察到BDNF和NGF具有不同的细胞内处理模式（Mowla等人。，1999,2001)，我们还制作了双靶标记NGF结构，以与BDNF进行比较。通过对转染的COS-7细胞裂解物的蛋白质印迹分析，我们最初证实了C末端表位（FLAG）的免疫印迹识别BDNF和NGF的两种神经营养因子（前和成熟），而N末端表位（HA）仅识别前形式(图1A类). 值得注意的是，N端定向抗体未检测到较小的条带（<32kDa），这表明N端抗体仅识别神经营养素的前体，而未检测到裂解的前体。转染PC12细胞裂解物的Western blot分析证实，BDNF和NGF上C末端表位（HA）的免疫印迹可识别前体和成熟体(图1B类). 抗BDNF和NGF成熟结构域的抗体(图1B类)在认识亲形式和成熟形式方面取得了类似的结果(图1B类).

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图1。

表位标记神经营养素的加工和定位。A类将双N端HA标记和C端FLAG标记的BDNF或NGF转染到COS-7细胞中，48小时后，按照材料和方法中的描述制备裂解物，并用抗HA和抗FLAG抗体进行免疫印迹分析。B类将单个C末端HA标记的BDNF或NGF转染到分化的PC12细胞中。48小时后，按照材料和方法中的描述制备裂解物，并用BDNF或NGF的C末端抗体或抗HA抗体进行免疫印迹分析。双表位标记的BDNF(C类)和NGF(D类)转染分化的PC12细胞。48小时后，将细胞固定并渗透，并使用表位抗体通过间接免疫荧光显微镜观察神经营养素的亚细胞分布。显示了典型的外荧光图像。

为了成像前和成熟神经营养素的细胞内位置，我们用双靶点标记的神经营养素构建物转染PC12细胞，并对C端FLAG和N端HA表位进行染色。我们观察到野生型BDNF的N端和C端表位标签染色模式几乎完全重叠(图1C类). 通过COS-7和PC-12细胞裂解物的Western blot分析(图1A、 B)，针对C末端表位的抗体检测到前和成熟形式，而N末端表位抗体仅检测到前形式。C-和N-末端表位主要重叠的免疫染色表明，BDNF的前形式是主要的细胞内形式。为了证实这种染色模式是针对前BDNF的，用BDNF前特异性抗体对PC12细胞进行染色。与双孔染色模式类似，前体蛋白染色的大多数免疫反应性发现于PC12细胞远端突起的点状结构中，并与C末端抗体染色重叠（数据未显示）。相比之下，PC12细胞中NGF的N端和C端表位免疫染色显示出最小的重叠，但核周隔室除外(图1D类). 这些结果与过去的生化研究一致，表明大多数NGF似乎在高尔基体中被裂解，而BDNF在神经元细胞中主要以原形式存在(Mowla等人，1999年). 因此，我们的双标记神经营养素染色系统允许对BDNF和NGF的前体和成熟体进行亚细胞可视化。

BDNF的加工和贩运_遇见在非神经元细胞中

BDNF中的单核苷酸多态性导致第66位缬氨酸被蛋氨酸取代，这已被证明会导致培养的初级海马神经元BDNF分泌受损(Egan等人，2003年). 我们想使用我们的荧光成像系统来检测缺陷BDNF的特异性_遇见贩卖人口。我们的第一个问题集中在这种分泌缺陷是否是神经元细胞特有的。我们选择研究内源性产生和分泌BDNF的非神经元细胞。心血管系统中的内皮细胞和血管平滑肌细胞分泌BDNF，并将其用作心血管发育、维持心内血管稳定性以及对血管损伤的反应的自分泌或局部旁分泌介质（Donovan等人。，1995,2000;Wang等人，2000年). 血管系统和心脏中BDNF的含量与中枢神经系统相当(Scarisbrick等人，1993年;Donovan等人，1995年;Hiltunen等人，1996年). 这些外周细胞在两个重要方面与神经元不同。它们缺乏专门的去极化依赖性分泌途径，也没有高度极化的神经元细胞形态。

在内皮细胞系中(Schweitzer等人，1997年)，我们观察到野生型和变异型BDNF染色的均匀分布(图2A类). 此外，对于野生型和变异型BDNF，N末端和C末端表位标记的染色模式几乎完全重叠，这表明优势种是原型(图2A类). 同样，通过对永生血管平滑肌细胞系进行免疫染色(Kraemer等人，1999年;Donovan等人，2000年)与野生型BDNF相比，转染的BDNF变体的N末端和C末端表位标记的分布或几乎完全重叠没有差异(图2B类). 我们还证实了N末端表位抗体的染色与前BDNF特异性抗体的染色重叠（数据未显示）。此外，我们通过ELISA检测这些细胞中变异型和野生型BDNF分泌之间没有功能差异（数据未显示）。这与BDNF形成了鲜明对比_遇见海马神经元的贩运(Egan等人，2003年)其中细胞内定位和调节分泌存在缺陷。总之，这些结果表明，在内源性产生和分泌BDNF但缺乏去极化依赖性调节分泌机制的细胞中，BDNF的加工、定位或分泌没有明显缺陷_遇见因此，BDNF_遇见不是一般的分泌缺陷，而是特定细胞群，即神经元细胞的缺陷。

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图2。

变异BDNF在内皮细胞和血管平滑肌细胞中的定位和分泌没有缺陷。A类，双靶点标记的BDNF物种在内皮细胞中的定位。转染、固定和渗透后，使用抗HA和抗FLAG抗体通过间接免疫荧光显微镜观察野生型（Val）和变异型（Met）BDNF的亚细胞分布。B类，双诱饵标记BDNF的定位_瓦尔在血管平滑肌细胞中。转染、固定和渗透后，BDNF的亚细胞分布_瓦尔使用抗HA和抗FLAG抗体通过间接免疫荧光显微镜观察（Val）和变异（Met）BDNF。

共表达BDNF的二聚和贩运_瓦尔和BDNF_遇见在神经元细胞中

由于神经细胞中的生物合成贩运途径似乎是受这种多态性影响的主要途径，我们关注的第二个问题是BDNF表达的影响_遇见BDNF上_瓦尔贩运和加工。野生型和变异型BDNF的共表达将密切反映这种多态性杂合子人群的状况，并已观察到记忆中的临床表型以及对神经精神疾病的易感性(Egan等人，2003年;哈里里等人，2003年;卢，2003b). 首先，我们假设，当在同一细胞中共存时，BDNF的形成_遇见和BDNF_瓦尔可能会异二聚体化，因为已经证明BDNF与其他神经营养素可以形成异二聚物(Heymach and Shooter，1995年;Farhadi等人，2000年). 为了定量测定BDNF的相对比例_遇见和BDNF_瓦尔异源二聚体当两种形式在同一细胞中表达时，我们进行了一系列连续的共免疫沉淀实验。我们最初确定是否可以定量检测两种表位标记形式的野生型BDNF的不同程度的异二聚体。我们在COS-7细胞中共表达野生型C末端FLAG-BDNF_瓦尔和HA-BDNF_瓦尔随着FLAG-BDNF比例的增加_瓦尔与HA-BDNF相比_瓦尔并使裂解产物经受最初的HA抗体免疫沉淀（IP#1），然后经受FLAG抗体免疫沉淀。作为对照，我们通过用HA抗体进行第二次免疫沉淀并通过Western blot分析定量合成的免疫复合物，确定第一次用HA抗体免疫沉淀（IP#1）将细胞裂解液中所有可检测到的HA标记的BDNF降低>95%（数据未显示）。FLAG-BDNF的相对程度_瓦尔·HA-BDNF公司_瓦尔通过定量FLAG-BDNF的比例来确定复合物的形成_瓦尔HA抗体共免疫沉淀(图3A类，IP#1，Blot:FLAG）与FLAG-BDNF总量的比较_瓦尔两种免疫沉淀步骤的免疫沉淀(图3A类、IP#1、IP#2、污点：FLAG）。我们证实，通过这种顺序共免疫沉淀程序，我们可以检测到不同比例的表位标记的BDNF异二聚体(图3A、 C类). 与HA标记的BDNF（FLAG/HA）相比，将FLAG-标记的BDNF的比例从1:3增加到3:1，导致形成的FLAG-BDNF·HA-BDNF异二聚体的比例分别从96.5%降低到36.1%，同时FLAG-BDNF同二聚体也随之增加(图3A、 C类).

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图3。

BDNF的免疫共沉淀_瓦尔和BDNF_遇见异二聚体。A类为了检测两种表位标记形式的野生型BDNF的不同异源二聚体化程度，将两种具有不同C末端表位（HA或FLAG）的野生型BCNF构建物转染COS-7细胞。共转染的FLAG-BDNF和HA-BDNF的数量不同，但转染的总DNA（12μg）数量不变。按照材料和方法中的描述制备细胞裂解物，并用HA抗体进行第一次免疫沉淀（IP#1表示HA）。随后用FLAG抗体对剩余的裂解物进行第二次免疫沉淀（IP#2表示FLAG），并用Western blot分析免疫沉淀样品。此外，通过Western blot分析初始裂解物（20μg总蛋白）转染的FLAG-BDNF和HA-BDNF水平。B类，为了检测表位标记形式的野生型和变异BDNF的不同程度的异二聚体，将BDNF组合转染COS-7细胞_瓦尔和BDNF_遇见具有不同C末端表位（HA-BDNF）的构建物_瓦尔加上FLAG-BDNF_瓦尔、HA-BDNF_遇见加上FLAG-BDNF_遇见、HA-BDNF_瓦尔加上FLAG-BDNF_遇见，或FLAG-BDNF_瓦尔加HA-BDNF_遇见). 转染恒定量（6μg）的每个表位标记的BDNF物种，以保持恒定量的总DNA（12μg）转染。如材料和方法中所述制备细胞裂解物，并进行顺序免疫沉淀（IP#1表示HA；IP#2表示FLAG），如A类，并通过蛋白质印迹进行分析。此外，通过Western blot分析初始裂解物（20μg总蛋白）转染BDNF的水平_瓦尔和BDNF_遇见.C类，定量蛋白质印迹A类在IP#1中发现的FLAG-BDNF免疫反应性占从两个免疫沉淀步骤获得的总FLAG免疫反应性的比例（IP#1和IP#2，Blot:FLAG）。通过三个独立实验的分析确定平均值±SEM比例。D类，定量蛋白质印迹B类在IP#1中发现的FLAG-BDNF免疫反应性占从两个免疫沉淀步骤获得的总FLAG免疫反应性的比例（IP#1和IP#2，Blot:FLAG）。通过三个独立实验的分析确定平均值±SEM比例。

然后我们共表达等量的C末端FLAG-BDNF_遇见和HA-BDNF_瓦尔在COS-7细胞中，证实了与野生型BDNF一样，细胞裂解物中的主要形式是32kDa前体。用HA抗体（IP#1）和FLAG抗体（IP#2）进行顺序共免疫沉淀(图3B类，车道3）。我们证实了HA抗体的初始免疫沉淀能够抑制所有可检测到的FLAG-BDNF_遇见·HA-BDNF公司_瓦尔复合体(图3B类). FLAG-BDNF的相对程度_遇见·HA-BDNF公司_瓦尔通过定量FLAG-BDNF的比例来确定复合物的形成_遇见HA抗体共免疫沉淀与FLAG-BDNF总量的比较_遇见通过两个免疫沉淀步骤进行免疫沉淀。我们确定71.5%的BDNF_遇见与BDNF复合_瓦尔该比例相当于具有不同表位标签的共表达野生型BDNF形式的异二聚体比例(图3B类或具有不同表位标签的共表达变异BDNF形式(图3B类，车道2）。此外，在BDNF上切换表位标签_遇见和BDNF_瓦尔并没有改变这种复杂结构的水平(图3B类，泳道4）。这些实验提供了定量证据，表明当两种BDNF_遇见和BDNF_瓦尔在同一细胞中共表达，大多数BDNF_遇见（>70%）与BDNF异二聚_瓦尔(图3D类).

其次，我们通过C-末端表位标记染色，确定了共表达变异型和野生型BDNF在PC12细胞、一个已建立的具有极化形态的神经元细胞系和皮层神经元中的细胞内分布是否存在数量差异。我们最初观察到，当BDNF单独表达时_遇见与BDNF相比，更局限于细胞体内_瓦尔PC12细胞和皮层神经元(图4A、 C). 然后我们在PC12细胞中观察到(图4B类)和皮层神经元（数据未显示），当共同表达时，大多数FLAG-BDNF_遇见HA-BDNF重叠染色_瓦尔染色，很少观察到FLAG或HA单克隆染色。BDNF共定位的定量分析_遇见和BDNF_瓦尔显示>70%的野生型和变异型BDNF在同一细胞中共定位（数据未显示）。这种高度共定位与我们共同转染两种具有不同表位标签（HA和FLAG）的野生型BDNF构建物时观察到的结果相同（数据未显示）。这种高度共定位也与BDNF前体的高度异二聚化相一致_遇见和BDNF_瓦尔(图3D类).

确定BDNF是否共表达_遇见带BDNF_瓦尔改变的BDNF_瓦尔通过Western blot分析（数据未显示），我们转染了等量的相应DNA结构，产生了等量BDNF蛋白表达。在两种神经营养素（FLAG-BDNF）上使用两种不同的C末端表位标签_遇见和HA-BDNF_瓦尔)，我们能够追踪野生型和变异型BDNF的细胞内分布。在PC12细胞中，我们确定与野生型BDNF单独转染相比，变异型和野生型BDNF的共同转染导致野生型BDNP在细胞体内的分布显著增加(第页< 0.01) (图4B、 D类). 此外，在这些同时存在野生型和变异型BDNF的细胞中，BDNF_遇见也明显局限于细胞体(第页<0.01）（数据未显示）。在皮层神经元中，我们观察到BDNF的分布发生了类似的变化_瓦尔与BDNF共存时_遇见(图4C类). 在这些神经元中，我们量化了BDNF的相对分布_瓦尔通过对整个神经元的三维重建x、 年、和z（z）并确定与单独表达的BDNF相比，野生型BDNF在细胞体内的分布显著增加_瓦尔(第页< 0.01) (图4E类). 此外，在这些同时存在野生型和变异型BDNF的细胞中，BDNF_遇见也显著分布于细胞体内(第页<0.01）（数据未显示）。对于皮层神经元培养，我们还对树突（MAP2）或轴突（Tau1）的神经元标记进行了协同分析，以确认它们作为神经元的身份(图4C类)并且还注意到在任何表达条件下，变异BDNF在树突或轴突中的选择性分布没有定量差异（数据未显示）。这些实验表明BDNF_遇见可以改变BDNF的贩运_瓦尔从生物合成途径导致极化神经分泌细胞更集中地分布在细胞体内。

共表达BDNF中异常BDNF转运步骤的鉴定_瓦尔和BDNF_遇见

之前已经表明，当BDNF单独表达时_遇见减少了向远端神经元突起的分布，以及减少了与分泌颗粒标记物的共定位(Egan等人，2003年). 在这种情况下，BDNF的细胞内分布改变_瓦尔与BDNF共存时_遇见可能归因于两种潜在的贩运异常：（1）在向远端突起运输过程中对适当分泌细胞器的分类缺陷和/或（2）在向远处突起运输中的缺陷。确定生物合成转运途径中的哪一步导致共表达BDNF的细胞内分布改变_瓦尔，我们首先用SecII评估共定位，SecII是调节分泌途径中分泌颗粒的既定标记(Huttner等人，1991年;Halban和Irminger，1994年;小泽和高田，1995年). 当BDNF_遇见和BDNF_瓦尔共转染到分化的PC12细胞或皮层神经元中，BDNF较少_瓦尔与BDNF相比，与分泌颗粒标记物（SecII）共定位_瓦尔控制条件(图5A、 B). 由于大多数内源性SecII染色位于远端突起，因此，定量缺乏共定位可能是由于BDNF向远端突起的转运减少。

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图5。

变异型和野生型BDNF与细胞器标记的亚细胞共定位。分化的PC12细胞(A类)，皮层神经元(B类)和未分化PC12细胞(C类)转染C末端HA标记变体（Met）、C末端HA标签野生型BDNF（Val）或C末端FLAG标记变体和HA标记野生型BDNF（V/M）。48小时后固定细胞并渗透。BDNF和分泌颗粒标记物SecII的共定位通过与抗HA和抗SecII抗体共定位来观察。序列共焦三维重建z（z）获得了平面图，并显示了每个代表单元的交替旋转角度。定量分析中所示的结果A–C通过对每种BDNF状态的～25个细胞进行评分进行。BDNF和SecII之间的共定位比例表示为通过四个独立实验的分析确定的平均值±SEM(*第页< 0.01; **第页< 0.001; 学生的t吨测试）。

为了控制从细胞体到远端突起的转运存在缺陷的可能性，我们评估了BDNF在非极化未分化PC12细胞中的定位，这些细胞包含与分化的PC12细胞相似的调节分泌机制(舒伯特和克莱尔，1977年)在有无BDNF的情况下_遇见在未分化的PC12细胞中，BDNF_瓦尔和BDNF_遇见呈点状结构，均匀分布于整个细胞(图5C类). 我们首先观察到，当单独表达时，BDNF的共定位显著减少_遇见SecII染色(第页< 0.001) (图5C类). 共压制时，BDNF_遇见（未显示数据）和BDNF_瓦尔SecII染色也观察到共定位显著降低(第页< 0.01) (图5C类). 这些结果表明BDNF减少_瓦尔与SecII共定位并不是由于从细胞体到远端突起的转运减少。总之，这些结果表明，当共表达时，产生的BDNF_遇见和BDNF_瓦尔复合体从高尔基体到分泌颗粒的分选效率较低，而分泌颗粒是用于调节分泌途径的。

BDNF异常细胞内转运的功能后果_遇见分泌物

确定BDNF的改变共定位_瓦尔，当与BDNF共存时_遇见利用分泌颗粒标记物具有功能性后果，我们评估了在PC12细胞中BDNF组成性或调节性分泌是否受到影响。使用BDNF ELISA检测，我们首先观察到BDNF_遇见（Met）单独转染分化或未分化PC12细胞，与BDNF相比，调节分泌减少_瓦尔(第页< 0.001) (图6A、 B). 未分化PC12细胞的这一发现证实了我们的免疫荧光结果(图5C类)这表明与Met多态性相关的转运缺陷是由于分泌颗粒分选效率低下，而非转运缺陷。此外，当BDNF_瓦尔和BDNF_遇见与野生型BDNF相比，在调节途径中分泌的BDNF总量减少(第页<0.01）但高于BDNF_遇见独自一人(图6A、 B). 分化和未分化PC12细胞的组成性分泌没有显著差异(图6A、 B). 总之，这些结果表明BDNF的单一表现_遇见足以损害野生型BDNF调节或活性依赖性分泌。

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图6。

BDNF的调节性和结构性分泌_瓦尔和BDNF_遇见.差异化(A类)没有区别(B类)用BDNF转染PC12细胞_瓦尔（Val）、BDNF_遇见（Met）或两种BDNF物种（Val/Met）。48小时后，在材料和方法中描述的去极化和组成性分泌条件下收集培养基，并用ELISA进行分析。结果以平均值±SEM表示，该平均值±SEM是通过对三个独立实验的分析确定的(*第页< 0.01; **第页< 0.001; 学生的t吨测试）。

BDNF分泌型的鉴定_瓦尔和BDNF_遇见

我们的研究表明BDNF_瓦尔·BDNF公司_遇见异二聚体在调节分泌途径中分类效率低下，可能与观察到的临床表型有关。因为前型和成熟型神经营养素可分别诱导相反的生物功能、凋亡和存活(Lee等人，2001年;Beattie等人，2002年)分泌的BDNF异二聚体的异常形式也可能有助于观察到的生物效应。因此，重要的是确定以活动依赖性方式分泌的BDNF的实际形式。虽然以前已经观察到从神经元和神经分泌细胞组成性释放BDNF的形式(Mowla等人，1999年)目前尚不清楚调节分泌途径释放出何种形式的BDNF。我们最初确定了KCl诱导去极化后PC12细胞分泌的野生型或变异BDNF的特定形式。用KCl去极化10分钟后，从转染有C端或N端HA标记BDNF构建物的PC12细胞培养基中获取BDNF，并用HA抗体进行免疫沉淀。首先，我们观察到BDNF中释放的BDNF总量减少_遇见和BDNF_遇见加BDNF_瓦尔条件(图7A类)与ELSA分泌结果一致(图6). 然后，我们观察到，通过免疫沉淀C末端HA标记的BDNF，可以观察到两种形式的分泌型BDNF。这些分解为主要的19kDa和次要的14kDa形式(图7A类). 免疫沉淀N-末端HA标记的BDNF后未观察到BDNF(图7B类)表明BDNF的19和14 kDa形式_瓦尔和BDNF_遇见由于前体蛋白的裂解，缺乏N-末端表位。HA表位标记的BDNF共转染期间_瓦尔和BDNF_遇见在PC12细胞中，BDNF的分泌形式与单独表达的BDNF的分泌形式相同_瓦尔或BDNF_遇见具体而言，在C末端HA-BDNF免疫沉淀过程中，Western blot分析仅检测到主要的19kDa和次要的14kDa形式，而在N末端HA-BDNF免疫沉淀期间未检测到BDNF形式(图7A、 B).

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图7。

BDNF分泌型的鉴定_遇见分化后的PC12细胞转染BDNF_瓦尔（Val）、BDNF_遇见（Met）或两个BDNF_瓦尔和BDNF_遇见（Val/Met）。BDNF结构包含单个C末端HA表位标签(A类)或双N端子HA和FLAG C端子标签(B类). 48小时后，在材料和方法中描述的去极化条件下，在没有或存在蛋白酶抑制剂的情况下收集培养基。用多克隆抗HA抗体免疫沉淀培养基中的BDNF，并用单克隆抗HA免疫印迹法进行分析。显示了三个独立实验的代表性斑点。

这些结果出乎意料，因为通过对PC12裂解物的西方bot分析(图1B类)和免疫荧光显微镜(图1C类)BDNF的主要细胞内形式是含有完整N末端和C末端表位标签的未分离前体。为了确定快速细胞外裂解事件是否与低分子量形式的产生有关，在蛋白酶抑制剂存在的情况下进行了类似的分泌研究。BDNF公司_瓦尔、BDNF_遇见或BDNF_瓦尔和BDNF_遇见在纤溶酶和金属蛋白酶抑制剂存在下，用KCl去极化10分钟后，从转染C末端或N末端HA标记的BDNF构建物的PC12细胞培养基中获得。用HA抗体对免疫沉淀物进行Western blot分析表明，BDNF的分泌形式主要是32kDa形式，其次是19kDa和14kDa(图7A类). 使用BDNF的平行研究_瓦尔或BDNF_遇见结构，带有N端HA标签和C端FLAG标签，仅显示了较高的32kDa形式(图7B类)确认BDNF的全长形式_瓦尔或BDNF_遇见在去极化过程中分泌。双表位BDNF物种的最低限度的更高迁移模式可能归因于存在两个表位标签而不是一个。在蛋白酶抑制剂存在下，共表达BDNF的分泌形式_瓦尔和BDNF_遇见也与BDNF相同_瓦尔，主要形态迁移至32kDa(图7A、 B). 总之，这些结果表明BDNF是以完整的原BDNF形式从调节分泌途径分泌的，然后在释放过程中迅速裂解。这一结果与先前的研究一致，这些研究表明组成性分泌的proBDNF能够被纤溶酶和金属蛋白酶在细胞外切割(Lee等人，2001年). 重要的是，BDNF前体蛋白第66位的多态性不会改变以活性依赖方式分泌的BDNF原型和成熟型的相对比例。

讨论

我们目前对BDNF的细胞内和细胞外命运以及BDNF多态性的研究_遇见，为与BDNF多态性相关的贩运缺陷提供了一些新的见解。首先，通过免疫荧光显微镜和分泌物研究，我们观察到这种前体蛋白改变损害了初级皮层神经元和神经分泌细胞中BDNF的细胞内转运和调节分泌，但不影响内皮细胞和血管平滑肌细胞。这一发现意义重大，因为它表明中枢神经系统中产生BDNF的神经元细胞群，而不是心血管系统中的神经元细胞，特别受到BDNF前体中Met替代的影响。这一发现与人类受试者BDNF多态性相关的功能缺陷一致。BDNF_遇见多态性在人群中相对常见，杂合子的患病率在20%到30%之间，纯合子的发病率在～4%之间(Neves-Perira等人，2002年;Egan等人，2003年;哈里里等人，2003年;Sen等人，2003年). 迄今为止，一些遗传联系和行为研究表明，这种多态性只与神经精神障碍和记忆障碍有关(Momose等人，2002年;Neves-Perira等人，2002年;Sklar等人，2002年;Ventriglia等人，2002年;Egan等人，2003年;霍尔等人，2003年;哈里里等人，2003年;Ribases等人，2003年;Sen等人，2003年). 值得注意的是，没有心血管系统损伤的报告。BDNF在心脏发育和出生后心血管系统功能中发挥着重要作用。心血管系统中BDNF水平不足会导致血管不稳定和心内出血（Donovan等人。，1995,2000;Kraemer等人，1999年;Wang等人，2000年). 我们的研究为BDNF突变导致中枢神经系统表型，但在心血管系统中没有明显的表型缺陷提供了合理的解释。前体蛋白中的Met替代导致调节性BDNF分泌的选择性损伤，这是BDNF从神经细胞而非血管细胞释放的主要途径。

这些研究的第二个发现是，野生型BDNF的细胞内转运命运以及调节分泌通过与变异BDNF共表达而改变。从连续的共免疫沉淀研究中，我们证明当共表达时，>70%的BDNF_遇见在BDNF中_瓦尔·BDNF公司_遇见异二聚体(图3D类). 这一发现与之前的研究一致，这些研究表明，共存不同的神经营养素可以导致异二聚体的形成，并且它们的贩运命运可以改变(Heymach and Shooter，1995年;Farhadi等人，2000年;Hibbert等人，2003年). 虽然已经假设BDNF不形成异二聚体体内与其他神经营养素（NGF、NT-3和NT-4）一起，已知人类BDNF杂合_遇见多态性确实同时存在于BDNF_瓦尔和BDNF_遇见我们的共表达研究与杂合子人类受试者的功能研究一致，在杂合子中有一个bdnf公司_遇见基因导致认知任务缺陷(Egan等人，2003年;哈里里等人，2003年). 因此，我们的研究揭示了BDNF的一个拷贝是如何存在的_遇见基因可以导致细胞释放的BDNF总量以活性依赖的方式减少。通过BDNF的主要形成_瓦尔·BDNF公司_遇见异二聚体，BDNF在神经元的调节分泌途径中的转运效率较低。BDNF调节分泌的减少可能解释了在杂合子人群中观察到的相对常见的Met多态性的行为缺陷。

第三，我们确定以活性依赖的方式分泌的BDNF形式为32kDa前体，分泌后迅速裂解为成熟形式(图7). 以前已经证明，proBDNF可以由培养的神经元组成性分泌(Heymach等人，1996年; Mowla等人。，1999,2001;Farhadi等人，2000年)和内皮细胞(Lee等人，2001年). 然而，也已经证实，神经元释放的大多数BDNF可归因于调节分泌途径的活性依赖性分泌，而不是组成性分泌途径(卢，2003b). 我们的研究结果首次提供了证据，证明32 kDa原代BDNF是调节分泌途径释放的主要形式。这一点非常重要，因为BDNF在神经系统中介导的许多生物功能都来自以这种活动依赖性方式释放的BDNF。尤其是，越来越多的证据表明，在各种不同的实验范式中，BDNF的活性依赖性释放迅速调节突触传递和神经可塑性(Poo，2001年;卢，2003a). BDNF导致海马神经元EPSCs增加(Kang和Schuman，1995年; Levine等人。，1995,1996). 缺乏BDNF的小鼠切片中，海马CA1区长期增强（学习和记忆的标志性细胞基础）的维持也受到损害(Korte等人，1995年). 此外，前神经营养素如proNGF已被证明通过选择性激活p75神经营养素受体而具有生物活性(Lee等人，2001年;Beattie等人，2002年)而成熟型则选择性地与Trk神经营养素受体相互作用。我们的研究表明，proBDNF向成熟BDNF的加工过程中有很大一部分可能发生在细胞外。因此，细胞表面或细胞外空间的蛋白酶在决定产生的BDNF形式（前体或成熟）的比例以及去极化后释放的BDNF-的生物活性方面起着关键作用。

在这种情况下，我们观察到BDNF的形式_遇见去极化后释放，无论是单独表达还是与BDNF联合表达_瓦尔，与野生型BDNF没有区别。我们确定BDNF前体和成熟体的比例没有差异_遇见与BDNF相比释放_瓦尔(图7). 我们假设在32 kDa形式的裂解后产生的19 kDa的BDNF是由N末端出现的～80个氨基酸的裂解引起的，这将删除含有Met多态性的部分。因此，缺陷BDNF的分子机制_遇见功能似乎不是由于BDNF分泌的形式，而是更简单地说，BDNF以活性依赖的方式释放的量。

这些发现表明野生型BDNF的细胞内转运发生了改变，变异BDNF同时表达，并且分泌的BDNF缺乏蛋白水解处理缺陷_瓦尔·BDNF公司_遇见异二聚体，为理解Met取代引起的分泌缺陷提供了更具体的机制框架。我们的研究结果表明，BDNF前体区存在一种特定的贩运信号，该信号含有Met替代物，是BDNF有效分选到调节分泌途径所必需的。重要的是，通过与野生型BDNF、BDNF形成异二聚体_遇见当野生型和变体BDNF都存在于同一细胞中时，能够改变运输命运。这些发现强调了BDNF前体的细胞内分选进入细胞特异性分泌途径作为调节适当生物活性的一般机制的重要性。因此，这些分类事件的保真度缺陷可能导致易受多种中枢神经系统功能障碍的影响。未来研究的一个重要方向是将BDNF中的细胞生物缺陷联系起来_遇见贩运至体内这种多态性在人类杂合子中发现功能缺陷。

脚注

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