β-淀粉样肽在神经干细胞发育中的神经原性作用

摘要

介绍

在过去的十年里，人们已经清楚地看到，新生哺乳动物大脑的许多区域都产生了新的神经元。在海马的齿状回中，尽管神经发生率在正常衰老过程中下降，但在老年时仍可检测到神经发生(Kuhn等人，1996年). 神经发生的减少可能与年龄相关的海马依赖性学习能力下降有关(Kempermann等人，1998年). 有人认为，某些类型的记忆和学习需要神经发生(Gould等人，1999年;Shors等人，2001年). 研究还表明，几种病理状态（缺血、癫痫和创伤）似乎上调脑室下区（SVZ）和齿状回的神经干细胞（NSC）活性（有关综述，请参阅Kuhn等人，2001年). 这些发现表明，阿尔茨海默病（AD）可能影响神经干细胞群体。

为了探讨这个问题，我们研究了β-淀粉样肽（Aβ）对培养的神经干细胞增殖、存活和分化的影响。Aβ生成增加或清除率降低似乎在AD的发展中起主要作用(扬克纳，2000). Aβ是一种自聚集蛋白，可促进AD中成熟神经元的突触功能障碍和死亡（有关综述，请参阅马特森，2000). 侧脑室慢性输注Aβ对小鼠空间学习的影响(Nitta等人，1997年)淀粉样蛋白沉积的淀粉样前体蛋白（APP）突变小鼠表现出学习和记忆障碍(肖等人，1996年). 神经干细胞能够在表皮生长因子（EGF）或碱性FGF（bFGF）等生长因子的存在下生长，并有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜力。这些细胞已经被隔离在体外来自胚胎和成人CNS的几个区域，包括SVZ(Reynolds and Weiss，1992年;Gritti等人，1999年)，皮层(戴维斯和坦普尔，1994年)，脊髓(Ray和Gage，1994年;Weiss等人，1996年)，或中脑(Bazan等人，1998年). 然而，只有两个地区体内成人大脑中的神经发生已被广泛接受：SVZ，细胞通过嘴侧迁移途径迁移并成为嗅球中的神经元(阿尔特曼和达斯，1965年;拉斯金，1993年;Lois和Alvarez-Buylla，1994年;Lois等人，1996年)以及海马中齿状回的颗粒下层，在那里细胞短距离迁移到颗粒细胞层并分化为海马颗粒细胞(阿尔特曼和达斯，1965年;拜耳等人，1982年;卡普兰和贝尔，1984年;斯坦菲尔德和特里斯，1988年;Kuhn等人，1996年).

在本研究中，我们发现用Aβ肽治疗海马NSC子代可诱导新生神经元数量增加，而细胞死亡或增殖速度无变化，表明Aβ肽可作用于神经元祖细胞并促进其向神经元分化。

材料和方法

神经干细胞培养。对胚胎期（E）15天Sprague-Dawley大鼠胚胎的纹状体或出生后（P）0天Bl6小鼠的海马进行解剖和机械分离。细胞悬浮液生长在由DMEM/F12（1:1）组成的规定培养基（DF12）中，2 m百万升-谷氨酰胺，1米米丙酮酸钠、抗生素-抗真菌药（Invitrogen，Grand Island，NY）、0.6%葡萄糖、25μg/ml胰岛素、20 n米孕酮，60μ米腐烂，30 n米亚硒酸钠（均来自密苏里州圣路易斯Sigma）、100μg/ml人转铁蛋白（印第安纳波利斯罗氏）、20 ng/ml人重组EGF（伊利诺伊州芝加哥罗氏或因维特罗根）和bFGF（纽约州普莱西德湖上游生物技术公司）。细胞以自由漂浮聚集体（神经球）的形式生长，每3-4天通过机械分离传代一次。至少传代四次后，细胞以18000个细胞/cm的密度被培养²15μg/ml聚乙烯-我-赖氨酸（Sigma）注入涂有涂层的12 mm玻璃盖玻片（VWR Scientific，Rochester，NY）或八面玻璃玻片室（Nalge Nunc International，Naperville，IL）。培养物在DF12和EGF或EGF加bFGF中保持3 d，然后切换到不含生长因子的DF12培养更长时间。在电镀后3至10天的不同时间点进行免疫细胞化学研究。为了分析Aβ治疗的效果，用1、5或10μ米Aβ（美国肽，加州森尼维尔）。在DF12中保持平行孔，不添加肽（未治疗组）。治疗后1、4或7天进行免疫细胞化学分析。

抑制剂治疗。Genistein来自Sigma。LY294002来自Biomol（普利茅斯会议，PA），U0126来自Upstate Biotechnology，小鼠单克隆抗人淀粉样β蛋白(第6页第10页)从Signet（马萨诸塞州Dedham）处获得。冷冻、HPLC纯化的Aβ1-42或1-40肽购自American peptide，Aβ25-35购自Bachem（Torrance，CA）。肽在浓度为400μ米并在37°C下培养3天或24小时，以形成聚集的Aβ，或以可溶性或非聚集形式保持在4°C下。使用Dahlgren等人的方法制备低聚物和纤维Aβ(2002).

NSC条件培养基。用开始于3 dpp的Aβ肽处理细胞4 d。在7 dpp时，去除培养基并固定细胞进行免疫染色。将这种预处理的NSC条件培养基（CM）以7 dpp的速度添加到未处理的细胞中，在存在或不存在6E10抗体的情况下持续24小时，以测试神经原效应是否通过释放到培养细胞培养基中的可溶性因子介导。

间接免疫细胞化学。用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，用乙醇-乙酸溶液（19:1）在-20°C下渗透20分钟，再用10%胎牛血清封闭，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。姐妹培养物作为阴性对照，并进行类似处理，除了在每个病例中没有一级抗体的培养。免疫荧光法检测所有抗原。

初级抗体。单克隆抗巢蛋白（克隆鼠401；1:200）来自发育研究杂交瘤银行（爱荷华大学，爱荷华州爱荷华市）。多克隆抗胶质纤维酸蛋白（1:500）购自Dakopatts（Glostrup，丹麦）。单克隆抗β-微管蛋白Ⅲ型（1:2000）和多克隆抗β-tubulinⅢ型（1:2000）均来自Covance（Richmond，CA）。多克隆抗O1抗体（1:5）是从美国型培养物收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）购买的杂交瘤中获得的。单克隆抗溴脱氧尿苷（BrdU；1:50）从Dako（High Wycombe，UK）获得，单克隆抗神经元核（NeuN）从Chemicon（Temecula，CA）获得。

次级抗体。对于神经抗原的单一标记，用Alex-aFluor 568或488标记的山羊抗鼠IgG（H+L）或山羊抗兔IgG。

扩散研究。为了能够检测增殖细胞，100μ米在细胞培养固定前24小时加入胸腺嘧啶核苷类似物BrdU。在用乙醇-乙酸溶液（19:1）渗透后，用2N HCl在4°C下处理细胞30分钟以使DNA变性。在室温下添加抗BrdU的一级单克隆抗体（1:20；Dakopatts）1小时，并通过AlexaFluor 488标记的荧光次级山羊抗鼠IgG（H+L）识别。这种方法可以识别过去24小时内复制了DNA的细胞。

数据分析。结果表示为三份或四份独立实验中每个抗体阳性细胞直接计数的平均值±SEM。如有指示，数据相对于他们自己的对照组进行了标准化。在每次培养中，在荧光显微镜下计算25个预定视野。对同一区域内的总细胞进行阳性细胞数校正，并用Hoechst进行核染色计数。使用ANOVA和Bonferroni后验或Student’st吨测试。当第页≤ 0.05. 使用Graph-Pad Software（加利福尼亚州圣地亚哥）的Prism3程序进行统计分析。

结果

β淀粉样肽增加海马干细胞子代神经元数量

为了测试β-淀粉样肽对神经干细胞命运的影响，将纹状体和海马的NSC子代接种在多聚物上-我-赖氨酸和不同浓度的聚集Aβ_1-42在2小时和3、7和10 dpp时添加肽，持续24小时。在所有这些条件下，aβ肽增加了神经元的数量，如β-微管蛋白III抗体免疫染色所示(图1A类)凋亡细胞核数量无变化(图1B类)或培养物中的总细胞(图1C类). 不同实验的增加程度不同，与对照组相比，神经元平均增加了三倍。结果在海马和纹状体神经干细胞的后代中是相似的。在0dpp处理的细胞需要更高浓度的聚集Aβ_1-42最佳反应，而“老”细胞在1μ米(图1A类). 基于这些结果，我们重点研究了7个dpp海马神经干细胞，用1μ米Aβ。在7 dpp时，NSC培养物包含祖细胞和成熟细胞的混合物，包括25-30%的神经元、40-50%的星形胶质细胞、1-2%的少突胶质细胞和各种祖细胞，部分模仿成熟海马。剂量反应研究表明，1μ米Aβ在促进神经发生方面是最佳的(图1D类). 在15个实验中，每个实验都是一式四次，神经元数量平均增加了三倍（290±65%）(图2A类).

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图1。

Aβ肽的神经生成作用。用不同浓度的聚集Aβ1-42肽处理海马神经干细胞（P0），在0、3、7和10 dpp处理24小时。神经元(A、 D类)，凋亡细胞核(B类)、和单元格总数(D类)被计算在内。单元格总数无变化(C类)或凋亡细胞核(B类)在所研究的任何时间或浓度下都有发现，但与对照组相比，神经元的百分比在统计学上显著增加(A类). 不同浓度Aβ肽在7 dpp下24小时的剂量反应实验(D类)表明诱导NSC子代神经发生的最有效浓度为1μ米数据表示四份共四个实验中一个代表性实验的标准化数据与对照的平均值±SEM。Bonferroni后验后方差分析的统计学意义；^**第页< 0.01;^***第页< 0.001.

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图2。

β-淀粉样肽（1μ米)诱导神经发生而不改变增殖，其神经生成作用被6E10 Aβ抗体所消除。在A类，我们显示了总共15个实验的平均值±SEM，一式四份。在B类我们可以看到，神经元数量的增加与通过掺入BrdU测量的增殖细胞的增加无关。C类在处理和未处理的培养物中，BrdU阳性细胞以相似的速度分化为神经元。D类，用1μ米聚集的Aβ1-42肽被6E10抗Aβ抗体（1:400稀释）完全消除。在E类，我们展示了在7dpp条件下暴露于条件培养基24小时的效果。为了获得CM，NSC被处理1μ米Aβ或保持未经处理（对照）为3 dpp。四天后，取下培养基并以7 dpp的速度将其加入未处理的细胞中24小时，其中包括或不包括6E10抗体。该抗体完全消除了Aβ诱导的神经发生和CM的影响。结果显示，一个代表性实验的平均值±SEM为2到4，共四次。方差分析与Bonferroni后验的统计学意义；^**第页< 0.01;^***第页< 0.001).

Aβ形式和聚集状态对Aβ肽的神经原性作用至关重要

离心除去较大的Aβ聚集体后，CM中Aβ诱导的神经源性活性持续存在，这表明Aβ的聚集状态可能在其作用中发挥重要作用。APP的裂解产生两种主要形式的Aβ肽，Aβ_1-40和Aβ_1-42前几节中的实验是使用Aβ进行的_1-42在本节描述的一系列实验中，我们检测了aβ_1-40和Aβ_1-42聚合或新制备（未聚合）的肽可诱导神经发生。仅聚集Aβ_1-42(1 μ米)能够诱导神经发生。都不是新制备的Aβ_1-42也不是Aβ_1-40（聚集与否）增加了神经元的百分比(图3A类). 测试Aβ的影响_25-35并将其与Haughey等人的结果进行比较(2002年a)，我们用聚集的Aβ在7 dpp下处理培养物24小时_25-35β-微管蛋白III阳性细胞数量没有增加(图3A类)细胞总数或凋亡细胞核无变化（数据未显示）。然后我们制备了Aβ_1-42使用允许富集低聚物或纤维的协议(Dahlgren等人，2002年). 用1μ米低聚物Aβ_1-42与aβ引起的神经发生增加相似_1-42聚集了3d，凋亡细胞核没有增加或细胞总数没有改变(图3B、 C类).

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图3。

Aβ肽的神经生成作用取决于其聚集状态。为了测试Aβ聚集在神经发生中的作用，我们对细胞进行处理(A类)1μ米Aβ1-40和1-42聚集（1-40A或1-42A）或非聚集（1-40 NA或1-42NA）和Aβ25-35聚集（25-35A）24小时，7 dpp。只有Aβ1-42聚集肽对NSC子代具有神经原性作用。在B类，通过Dahlgren等人的方法产生的Aβ(2002)已使用。只有寡聚肽（Aβo）和聚集的1-42具有神经生成作用。C类纤维Aβ（Aβf）导致细胞总数无统计学意义的减少。在D类，我们显示神经元数量增加，Aβo计数的NeuN阳性细胞是神经元的另一个标记。这些图表表示四个值的平均值±SEM(A类)或三个(B类-D类)四份不同的实验。方差分析，然后进行Bonferroni后验；^*第页< 0.05;^**第页< 0.01.

为了排除β-微管蛋白III检测非神经元细胞的可能性，我们还用神经元标记物NeuN对平行实验进行染色。与β-微管蛋白III一样，我们发现对aβ反应的神经元总数显著增加。典型实验如所示图3D类.

Aβ的神经原效应通过酪氨酸激酶磷酸化和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径介导

为了评估参与Aβ诱导的神经发生的可能信号转导途径，我们使用了几种已知参与其他系统神经发生的途径的抑制剂。其中包括染料木素、酪氨酸激酶抑制剂（TyrK）和其他蛋白激酶反应中ATP的竞争性抑制剂。在7 dpp时，NSC子代用1、5和10μ米染料木黄酮。在这些浓度下，与对照组相比，抑制剂既没有增加凋亡细胞核的数量，也没有改变观察到的神经元数量。当1μ米在金雀异黄素存在下添加Aβ，Aβ介导的神经元增加被消除(图4A类). 同样，用MEK（MAP激酶激酶）的选择性抑制剂U0126处理，也不会引起培养物中神经元总数的任何变化(图4B类)但能够抑制Aβ诱导的神经元数量增加。相反，PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）的选择性抑制剂LY294002不能抑制aβ诱导的神经发生(图4C类).

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图4。

Aβ的神经原效应可能涉及的途径。在有或无1μ米金雀异黄素(A类), 20 μ米U0126号机组(B类)，或20μ米LY294002型(C类). 我们的研究结果表明，TyrK抑制剂Genistein和MEKK抑制剂U0126可以阻断神经发生，而PI3K抑制剂LY294002没有阻断。图表显示了两到四个不同实验中的一个代表性实验，一式四份。方差分析，然后进行Bonferroni检验；^*第页< 0.05;^**第页< 0.01.

讨论

我们在启动这项研究时的工作假设是Aβ会抑制神经发生并阻止修复过程。这里的结果表明，至少在细胞培养中，情况正好相反。我们的结果与之前的两项研究（Haughey等人。，2002年a,b条)这表明Aβ治疗会损害神经干细胞向神经元的增殖和分化。我们的实验在使用的Aβ形式、使用的NSC培养类型和Aβ浓度方面与他们的不同。所有这些都可以解释结果的差异。例如，在一份报告中，使用的Aβ肽是聚集的Aβ_25-35(Haughey等人，2002a). Aβ_25-35肽不是天然产生的，但已经证明它能模拟Aβ的不良作用_1-42在几项研究中。事实上，我们的结果表明聚集的Aβ_25-35当以7dpp添加24小时时，不会影响我们系统中的神经发生率。在Haughey等人的研究中(2002年b), 5 μ米Aβ减少了神经球细胞的放射状突起面积，因为与基底的粘附减少。在我们的系统中，既没有将细胞镀到Aβ肽上，也没有用1、5或10μ米聚集的Aβ_1-42影响了径向生长（数据未显示）。然而，当我们的海马神经干细胞被镀到肽上时，未观察到神经元数量的变化，但细胞凋亡以浓度依赖性的方式增加，显示出与Haughey等人（2002年）获得的培养物相似的对神经干细胞的毒性作用（数据未显示）。先前的研究也显示凋亡细胞的数量增加了三倍，其中许多是E-NCAM（也称为神经细胞黏附分子的多唾液酸形式）阳性神经元(Haughey等人，2002b)，而在我们的培养物中没有显著的细胞凋亡。Haughey等人(2002年b)他们对人类胎儿8至10周龄皮层组织的神经球进行了研究，我们从P1小鼠海马获得了我们的研究。主动神经发生仅限于成年哺乳动物中枢神经系统的离散区域。事实上，海马或脊髓的神经干细胞移植到齿状回后会产生神经元，但移植到其他中枢神经系统区域后不会产生神经元(Shihabuddin等人，2000年). 区域差异可能是海马星形胶质细胞的功能，可能为成人神经发生提供独特的生态位(海登，2001;Seri等人，2001年;Cheng等人，2002年;Kempermann等人，2002年; Song等人。，2002年a,b条;Monje和Palmer，2003年). 然而，我们使用NSC条件培养基的数据表明，NSC子代释放到培养基中的可溶性因子与Aβ肽的神经生成作用无关。

细胞凋亡是神经发生区域的共同特征(Biebl等人，2000年). 神经发生区的细胞死亡是大脑其他区域的数倍，细胞在神经发生的所有阶段死亡：干细胞增殖、祖细胞迁移和神经元分化。尽管有这些神经元的损失，齿状回中的神经元细胞数量仍在不断增加，这表明动物一生中的产量大于损失(卡普兰和辛兹，1977年;拜耳等人，1982年). 有人提出，细胞死亡或损伤会释放触发神经发生和细胞替换的信号体内(Snyder等人，1997年;Kokaia和Lindvall，2003年). 这些损伤可通过重新表达通常仅在胚胎神经发生期间可用的发育信号，为神经元分化创造一个宽松的微环境。在我们的系统中，我们没有观察到总细胞数量的任何显著损失，并且在Aβ治疗后凋亡细胞核的数量没有增加。然而，我们不能完全排除这样一种可能性，即成熟神经元凋亡或坏死死亡的小幅增加（可能被我们实验中的变化所掩盖）可能会引发一连串事件，从而增加神经发生。事实上，当未分化的神经干细胞被移植到1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶损伤的大脑中时，大多数新的多巴胺能神经元被“拯救”宿主细胞(Ourednik等人，2002年)这就开启了一种可能性，即未分化的祖细胞可能自发表达神经保护信号，而神经干细胞可能具有改变宿主环境、重新激活或保存功能失调的内源性神经元的固有能力。以前的研究(Ciaroni等人，2002年)描述增殖和细胞存活之间的关系。如果增殖受到抑制，存活率就会增加。这表明神经发生和细胞数量调节之间可能存在联系。在我们的培养物中，增殖细胞的数量非常少（约占总细胞的0.3%）(图2B、 C类)对照组和Aβ处理的培养物之间没有显著差异。这些数据以及条件培养液无法诱导神经发生增加表明，Aβ的作用直接作用于有丝分裂后的神经元祖细胞，促使其向神经元分化。

Aβ的神经原性作用对Aβ聚集状态的依赖性表明，新神经元的形成更可能是由Aβ的“可溶性”形式诱导的，而不是由组织成老年斑块的Aβ诱导的。对这些数据的一种可能解释是，在阿尔茨海默病的早期阶段，当Aβ的过量足以形成寡聚物而不是纤维聚集物时，寡聚体(Dahlgren等人，2002年;Kim等人，2003年)可以激活一种补偿机制，通过增加神经元祖细胞向新神经元的分化来取代丢失或受损的神经元。随着时间的推移和老年斑块的形成，平衡可能转移到纤维Aβ，而纤维Aβ可能具有更大的神经毒性。

染料木素对神经发生的抑制表明酪氨酸激酶参与了这一过程。这些激酶包括对神经系统发育至关重要的经典神经营养素受体（综述见Chao等人，2003）。条件培养基的实验表明，aβ肽对靶细胞有直接作用，而不是释放生长因子，然后作用于这些受体。然而，Aβ的相互作用可能_o个含有另一种表面蛋白质(龚等人，2003)可以激活TyrK并驱动神经发生。我们检测了TyrK下游的两条信号通路。抑制PI3K系统并不影响神经发生。PI3K在细胞凋亡保护中起重要作用(卡彭特和坎特利，1996年)但其抑制作用并没有增加细胞凋亡。相反，ERK（细胞外信号调节激酶）通路的抑制阻碍了神经发生。ERK通路与细胞生长和增殖、分化和凋亡的调节有关(Chang和Karin，2001年). 需要进一步检查其在该系统神经发生中的作用，以了解TyrK激活下游的事件。更好地了解Aβ对这些途径的作用，有可能为治疗干预提供靶点，以防止Aβ诱导的神经元丢失并鼓励神经元替换。

脚注

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