材料和方法
动物和立体定向手术。雌性C57BL/6小鼠取自哈兰（英国比斯特），在标准光照和温度条件下分五组或六组饲养，喂食颗粒食物和水随意用阿维汀（2,2,2-三溴乙醇）腹腔内麻醉小鼠，并将其放置在立体定向框架内。在中线两侧的颅骨上钻两个小孔，以允许双侧注射1μl PBS制备的10%w/v ME7感染的C57BL/6脑匀浆。这些注射直接进入背海马（前角坐标：前后，-2.0 mm；外侧，-1.6 mm；深度，-1.5 mm）使用10μl Hamilton注射器和26号针头。对照动物在PBS中注射10%w/v的正常脑匀浆（NBH），该匀浆来源于一只C57BL/6小鼠。所有程序均按照英国内政部许可证执行。
外围和中央LPS挑战。ME7朊病毒感染的动物（通篇称为ME7动物）和NBH注射的动物（全篇称为NBH）受到急性脑内或腹腔内炎症挑战（视情况称为ME7+LPS、ME7+生理盐水、NBH+LPS，脑内或腹膜内）。ME7或NBH注射后19周，就在出现明显临床症状之前(Betmouni等人，1999年)如前所述，在阿维汀麻醉下，将2μg LPS（NBH和ME7）或无菌生理盐水（ME7）注入一组动物的海马内，并在它们恢复了翻正反射后返回其家中笼子。另一组小鼠腹腔注射500μg/kg LPS(流产马沙门氏菌; Sigma，Poole，UK）在无菌盐水中或单独使用盐水，然后返回笼子。在ME7接种19周后，根据我们之前对疾病动物此时小胶质细胞激活的程度和区域分布的了解，以及我们之前的研究表明，在发病时，动物的疾病行为反应过度，海马IL-1β表达增加，我们选择接种所有LPS或盐水朊病毒病的这个阶段(Combrinck等人，2002年). 这些研究中使用的脑内LPS剂量是基于其在正常动物中诱导强大小胶质细胞IL-1β表达的能力，对于系统性挑战，是基于产生强大发热反应所需的剂量(Combrinck等人，2002年).
组织准备。在LPS后18小时，用LPS对大脑内激发的动物进行终末麻醉，并检查细胞浸润/炎症激活的证据。用于RNA提取的LPS和生理盐水注射动物在腹膜内注射后6小时被最终麻醉，用肝素化生理盐水经心灌注，并取出大脑(n个=每组5只）。在距前角约-1.0至-3.0 mm处取厚冠状切片（～2 mm），迅速取出海马和丘脑，立即冷冻在液氮中，并保存在-80°C下。在注射LPS或生理盐水后18 h，对另外几组腹腔内激发的动物进行终末麻醉，并经心灌注并固定在10%福尔马林溶液中，以研究中性粒细胞浸润、凋亡细胞死亡和病理学的其他方面(n个ME7+LPS腹腔注射=9；n个ME7+盐水腹腔注射=5；n个ME7为3；n个=NBH为3；n个=5（NBH+LPS腹腔注射）。另外的ME7和NBH动物在全身激发后6、9和13小时用LPS或生理盐水腹腔内激发，并灌注肝素化生理盐水和10%福尔马林，以检查caspase阳性细胞死亡的时间进程。每个时间点至少使用三只动物进行这些研究。
免疫细胞化学。10%福尔马林固定组织在同一固定剂中固定2 d以上，然后石蜡包埋。切片（10μm）在切片机上切割，并漂浮在带静电的载玻片上。对中性粒细胞（兔多克隆抗中性粒细胞血清，MBS1，内部生成）、凋亡细胞[TUNEL（“死胡同”染色试剂盒；英国南安普敦Promega）和裂解caspase-3（英国南安普敦Chemicon）]、IL-1β（英国伦敦Peprotech）、iNOS（英国牛津BD Biosciences）、，胶质纤维酸性蛋白（GFAP；Dako，High Wycombe，英国）、COX-2（Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁斯）、神经元[神经元特异性核蛋白（NeuN）（Chemicon）和神经丝重链（NFH；Abcam，英国剑桥）]和小胶质细胞（番茄凝集素；Sigma）。所有生物素化二级抗体均由Vector Laboratories（英国彼得伯勒）提供，所有染色均采用ABC法进行可视化，使用过氧化物酶作为酶，0.015%v/v过氧化氢作为底物，二氨基联苯胺作为色氨酸。
通过二甲苯和酒精对组织进行脱蜡和再水化。通过在1%H中培养切片来消除内源性过氧化物酶2哦2/甲醇10分钟。
中性粒细胞。MBS-1染色切片用0.04%胃蛋白酶处理0.1米PBS洗涤前在室温下用HCl浸泡20分钟，将其封闭在10%的正常山羊血清中，在室温下与一抗（Ab）在1:200孵育2小时。在额外清洗后，用生物素化山羊抗兔IgG孵育切片，并继续如上所述。
隧道。TUNEL染色切片在0.85%NaCl和PBS中洗涤，用蛋白酶K（20μg/ml）预处理，并在室温下用0.1%Triton X-100透化10分钟。切片用平衡缓冲液预孵育10分钟，然后用孵育介质在37°C孵育2小时，用荧光素标记凋亡细胞。使用柠檬酸钠溶液停止反应。用10%的正常山羊血清封闭切片，并用生物素化山羊抗荧光素抗体孵育，然后继续上述操作。在完整的冠状切片中计数TUNEL阳性细胞，并且只有在显示收缩的形态和浓缩的染色质以及被TUNEL标记的情况下才包括在内。
白介素-1β. IL-1β切片在柠檬酸缓冲液中培养，pH值为6，微波两次，每次3分钟，两次培养之间冷却5分钟。它们在TBS中清洗，并用50%的正常山羊血清封闭，然后在4°C下用1:50的一级抗体隔夜孵育，一级抗体用50%的血清制备，以阻断与活化的星形胶质细胞的非特异性相互作用。清洗切片，然后用生物素化山羊抗兔抗体孵育，并继续如上所述。
小胶质细胞。番茄凝集素染色切片在含有1m的TBS 1%Triton X-100中清洗三次米镁、锰和氯化钙。在相同的缓冲液中以50μg/ml的速度制备生物素化番茄凝集素，并在4°C下培养切片过夜。在彻底清洗之后，按照上述方式继续进行该方案。
环氧化酶-2。环氧合酶-2染色切片用1%H淬火2哦2在无水甲醇中放置20分钟，并在PBS中短暂清洗，然后在柠檬酸盐缓冲液中微波两次，每次3分钟，两次培养之间冷却5分钟。在用10%的马血清在PBS中洗涤和封闭2小时后，将初级抗体（山羊多克隆抗Cox-2抗体；Santa Cruz Biotechnology）在PBS中将其稀释为1:1000，并在室温下培养过夜。然后在PBS中清洗切片，用生物素化亲和纯化的马抗羊IgG孵育，并进行上述ABC过氧化物酶反应。
iNOS。将切片淬火，用柠檬酸缓冲液和微波预处理，用上述0.04%胃蛋白酶消化，然后在PBS中洗涤，然后在10%正常山羊血清中封闭，并在4°C下用1:100稀释的兔抗iNOS多克隆抗体孵育过夜。在用PBS进一步洗涤后，用山羊抗兔二级抗体孵育切片，如上所述完成ABC和DAB反应。
纽恩。使用与上述相同的柠檬酸缓冲液预处理实现NeuN染色，然后在正常马血清（10%）中培养30分钟，在1:5000与一级抗体培养过夜，在1:100与马抗鼠次级培养40分钟，并完成上述ABC和DAB反应。
裂解半胱天冬酶-3。检测活化的caspase-3以确定细胞死亡的机制，并通过在细胞死亡级联早期检测细胞来促进死亡细胞的双重标记。在柠檬酸缓冲液和微波预处理后，用0.04%胃蛋白酶在0.1米在室温下用HCl浸泡20分钟，然后用10%的正常山羊血清清洗30分钟，然后在室温下与1:50稀释度的一级抗体孵育过夜。在室温下应用山羊抗兔二级抗体40分钟，反应如上所述完成。
NFH与caspase-3的双重染色。为了便于NFH和裂解caspase-3的双重染色，有必要预先标记兔抗NFH抗体，以避免山羊抗兔二级抗体之间的交叉反应。因此，首先进行抗裂解半胱天冬酶-3染色，如上所述，用Alexa Fluor 488连接的山羊抗兔二级抗体替代上述生物素化抗体。然后用预先标记有Zenon Alexa Fluor 546试剂盒（英国佩斯利Invitrogen）的NFH抗体孵育切片。这种标记只需将荧光色素直接附着在一级抗体上，就不需要二级抗体。根据制造商的说明，使用4:1的标签抗体比和1:250的最终抗体稀释度进行标记。之前在单标记实验中观察到了该比率和抗体浓度，以获得高质量的NFH染色。为了进行核反染色，我们使用TOPRO-3在633nm处发出荧光。
共焦成像。使用488、546和633nm的同时激发，在Leica（Nussloch，Germany）SP2共焦激光扫描显微镜上对三染色载玻片进行成像。通过组织厚度（10μm）获得Z系列，从中提取代表性的1μm光学切片。荧光色素也被顺序激发，而不是同时激发，以排除光谱重叠的荧光色素“渗出”的可能性。
RNA提取。根据制造商的说明，使用Qiagen（Crawley，UK）RNeasy迷你柱从大脑样本中提取总RNA。Qiagen提取过程中污染基因组DNA被降解DNA酶1酶。脑组织的典型产量为每次提取约5μg。RNA在-80°C下储存，直到cDNA合成和PCR检测。
Taqman逆转录-PCR分析。除非另有说明，否则所有设备和试剂均由Applied Biosystems（英国沃灵顿）提供。血清淀粉样蛋白A（SAA）、α的测定2抗凝血酶（α2-AP）和补体3（C3）如前所述进行(Wilcockson等人，2002年). 使用这些基因的已发布序列设计了戊四氮3（PTX3）、IL-1β、IL-6和TNFα的检测，并应用于Primer Express软件。在可能的情况下，探针设计为穿过内含子，使其具有cDNA特异性。列出了每个分析的引物和探针的序列。使用Promega PCR试剂和凝胶电泳，通过标准逆转录（RT）-PCR检查所有引物对的特异性。每对引物产生一个预期扩增子大小的离散带（数据未显示）。
表1。
小鼠细胞因子和急性期蛋白Taqman引物和探针序列
目标
|
加入号码
|
寡核苷酸
|
顺序
|
放大器尺寸（bp）
|
|---|
| 南非航空公司 |
M13522型
| 正向底漆 | 5′-GCCATGGAGGGTTTTTTCATT-3′ | 80 |
| | 反向底漆 | 5′-CCTTTGGGCAGCATAGTTC-3′ | |
| | 探查 | 5′-CACATGTCTCCAGCCCTTGGAAAGC-3′ | |
| α2-AP |
Y12312型
| 正向底漆 | 5′GCGGTTCACAGTGTCGGT-3′ | 66 |
| | 反向底漆 | 5′-TCCAGAGAACATCGAA-3′ | |
| | 探查 | 5′-ACATGATGGCACGCGGTCATCATCCT-3′ | |
| C3类 |
J00367号
| 正向底漆 | 5′-ccatgttattcattachtcca-3′ | 72 |
| | 反向底漆 | 5′-CGTGGCCTCCAGTCAGA-3′ | |
| | 探查 | 5′-CCTACGGCTGAGAGAGAGACC-3′ | |
| PTX3型 |
X83601型
| 正向底漆 | 5′-ACAACGAAATAGACAATGGACTTCAT-3′ | 62 |
| | 反向底漆 | 5′-CTGGCGCAGTCGCA-3′ | |
| | 探查 | 5′-CCACCGAGGACCACCCACGCC-3′ | |
| IL-1β |
M15131型
| 正向底漆 | 5′-GCCACCCACCCTGCA-3′ | 69 |
| | 反向底漆 | 5′-ACCGCTTTTCCATCTTCTT-3′ | |
| | 探查 | 5′-TGGAGAGTCTGGATCCAAGCAATACC-3′ | |
| 肿瘤坏死因子α |
M11731型
| 正向底漆 | 5′-CTCCAGGCGTGCCTATG-3′ | 149 |
| | 反向底漆 | 5′-GGGCCATAGAACTGAGAGG-3′ | |
| | 探查 | 5′-TCAGCTCTCTCTCATTCCTTGTGG-3′ | |
| 白介素-6 |
NM_031168号
| 正向底漆 | 5′-TCCAGAACCGCTATGAAGTTC-3′ | 72 |
| | 反向底漆 | 5′-CACACAGACATCAGTCCAAGA-3′ | |
| | 探查 | 5′-CTCTGGCAAGAGACTTCCATCCAGTTGC-3′ | |
| 转化生长因子β1 |
AJ009862型
| 正向底漆 | 5′-CGTGGAAATCAACGGGATA-3′ | 84 |
| | 反向底漆 | 5′-GGCACATGAGGAGCAGGAA-3′ | |
| | 探查 | 5′-ACCTGGGCACACATCCATGACATGA-3′ | |
| iN0S系统 |
纳米_010927
| 正向底漆 | 5′-CAGCTGGGCTGTACAACCTT-3′ | 95 |
| | 反向底漆 | 5′-cattggaagtggaaggtttcg-3′ | |
|
| 探查
| 5′-CGGGCAGCCTGTGAGACCTTA-3′
|
|
对于Taqman PCR，使用Taqman Gold RT试剂从总RNA生成cDNA。在10μl反应体积内反向转录200纳克总RNA。随后使用一微升RT反应（相当于20 ng RNA）进行PCR，如前所述(Wilcockson等人，2002年). 使用Applied Biosystems Rodent GAPDH-Taqman试剂盒在每个样本中测量家政基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。
对于急性相反应物SAA，α2-AP、C3和PTX3分析，标准曲线由在体外如前所述的每个基因的转录物(Wilcockson等人，2002年). 因此，急性期蛋白mRNA水平表示为每纳克总RNA的拷贝数（通过GAPDH归一化确定）。如前所述，通过相对定量评估朊病毒感染动物和正常动物的细胞因子mRNA表达(坎宁安等人，2005年). 用2.5μg脂多糖（LPS）进行脑内激发后，从小鼠脑组织中分离出的总RNA构建标准曲线，已知LPS可上调本研究中感兴趣的所有靶转录物。该标准曲线是使用反转录酶反应中的RNA浓度高于用于分析的样品的RNA浓度来构建的，以确保所有动物组的细胞因子转录都在所构建的标准曲线范围内。对LPS注射小鼠大脑合成的cDNA进行了五分之一的连续稀释，并绘制了一条曲线C类t吨值（转录基因穿过检测阈值的周期数）与浓度的对数（指定任意值，因为细胞因子转录物的绝对浓度未知）。因此，标准曲线生成任意浓度值。然后将这些数据归一化为每个样品中的GAPDH浓度。
统计。外周LPS激发组的动物组通过方差分析进行比较，数据在95%置信区间内显著。TUNEL和caspase-3染色后的细胞数通过ANOVA与Bonferroni's进行比较事后（post-hoc）测试。
结果
脑内LPS后小胶质细胞激活
我们之前使用CD68和主要组织相容性复合体I类和II类来证明小胶质细胞在朊病毒病中表现出激活，这是由形态改变和细胞表面标记物上调所定义的(Betmouni等人，1996年). 在这里，我们使用番茄凝集素免疫组化，并发现该标记还显示了疾病中形态改变的小胶质细胞(). 此外，接种后19周，与朊病毒病病理学相适应的所有特征在组织中都很明显[空泡化和CA1神经元丢失()和PrPSc公司沉积（未显示数据）]。番茄凝集素也标记血管系统。NBH+LPS脑内动物的血管组织染色清晰，少数小胶质细胞有较薄的分支突起(). ME7动物大脑内注射生理盐水后的染色显示，许多小胶质细胞染色更浓，分支较少且特征性活化形态(). 根据这些标准，脑内注射LPS的ME7动物也显示出明显的激活，但其形态学外观与未注射LPS动物没有显著差异(). 因此，在形态学水平上，我们观察到ME7动物中的小胶质细胞在有或无LPS攻击的情况下没有明显差异。
脑内LPS后的神经病理和炎症变化。a-c公司NBH+LPS脑内小胶质细胞的番茄凝集素染色(一)，ME7+生理盐水(b条)和ME7+LPS(c（c）)动物。d-f型NBH+LPS中IL-1β免疫染色(d日)，ME7+生理盐水(e（电子）)和ME7+LPS(（f）)大脑。NBH+LPS中浸润中性粒细胞的MBS-1免疫染色(克,j个)，ME7+生理盐水(小时,k个)和ME7+LPS(我,我)大脑显示为10倍(克,小时,我)和40×(j个,k个,我)分别是。移动电话，NBH+LPS中iNOS的免疫染色(米)，ME7+生理盐水(n个)和ME7+LPS(o个)大脑。比例尺：（in一)a至f,j-o公司，100微米；（英寸克)克,小时,我500微米。
LPS激发后IL-1β的表达
NBH动物脑内LPS激发后的免疫组织化学染色显示IL-1β有部分染色。这种染色清楚地定位于激活的小胶质细胞，既位于脑内注射LPS的附近，也位于同侧皮层和背侧丘脑的下方(). 浸润的中性粒细胞（见下文）也显示出一些IL-1β表达。注射生理盐水的ME7动物未显示任何IL-1β染色()正如我们之前描述的ME7感染小鼠(Walsh等人，2001年). 注射LPS的ME7动物的IL-1β染色密度显著增加，无论是阳性染色细胞的数量还是每个激活细胞的染色强度(). IL-1β染色在注射的海马体中观察到，但在邻近皮层、丘脑和对侧海马体中分布较广。因此，在功能水平上，注射生理盐水或LPS的ME7动物的小胶质细胞明显不同，尽管其形态相同。
LPS脑内激发，中性粒细胞浸润
2μg LPS的脑内激发激发了一些中性粒细胞渗入NBH动物的脑实质(). 这种浸润相对分散，浸润程度有限，尽管有证据表明中性粒细胞粘附在血管系统中。ME7动物受盐水攻击后未出现浸润(). ME7感染动物的LPS攻击产生大量中性粒细胞浸润，并且这种涌入集中在脑内攻击部位(). 除了薄壁组织中数量可观的中性粒细胞外，血管和软脑膜结合空间也充满了中性粒细胞。也有一些出血的证据，这在用这种剂量的LPS脑内激发的NBH动物中并不明显。
脑内激发后iNOS染色
我们之前已经证明，iNOS在ME7感染动物的大脑中不表达(Walsh等人，2001年). 脑内注射生理盐水的ME7动物的大脑中未检测到iNOS的表达()或NBH+LPS脑内动物(). 相反，脑内LPS对ME7动物的攻击诱导小胶质细胞和一些浸润性中性粒细胞iNOS的明确表达().
中枢神经系统细胞因子与外周炎症的急性期反应
为了研究ME7动物在外周炎症后是否表现出夸大的脑细胞因子和急性期反应物mRNA水平，我们用LPS或生理盐水腹膜内注射ME7和NBH注射小鼠，并在6小时后测量细胞因子转录物。
LPS注射NBH和ME7小鼠的细胞因子表达
与给予相同LPS激发的NBH动物相比，腹腔注射LPS的ME7动物IL-1β的增加更大() (第页< 0.001). ME7小鼠的IL-1β转录水平略高于NBH小鼠，但这不能解释LPS挑战之间的差异；ME7+LPS组IL-1βmRNA的表达水平高于NBH+LPS和ME7单独组的总和。在ME7动物中，LPS诱导的IL-1β增加大约是NBH动物中LPS诱导IL-1β升高的三倍。
LPS全身激发对ME7和NBH小鼠细胞因子和炎症基因转录的影响。LPS产生更多IL-1β(一)，肿瘤坏死因子α(b条)，IL-6(c（c）)和iNOS(e（电子）)与NBH动物相比，ME7动物的mRNA增加。NBH+LPS和ME7+LPS中IL-1β、TNFα、IL-6和iNOS的表达差异具有统计学意义(第页< 0.001,第页<0.01，以及第页分别<0.05）。所有ME7组与两个NBH组在TGFβ1转录方面存在显著差异，具有统计学意义(d日)但LPS（腹腔注射）不会增加NBH或ME7动物的TGFβ1。黑色条表示平均值±SEM。*第页< 0.05;**第页< 0.01;***第页< 0.001; 方差分析。NBH+LPS，n个= 4; ME7+生理盐水，ME7+LPS，n个= 5. Sal和Saline。
在同一实验中，TNFα的表达模式与IL-1β的表达模式相似(). 与NBH小鼠相比，ME7小鼠的TNFα转录物水平增加。ME7+LPS组TNFα的表达高于NBH+LPS组(第页< 0.01). 同样，在ME7感染小鼠中观察到的基线表达没有考虑到这种差异（即，效果大于加性）。ME7动物LPS诱导的TNFα增加是NBH动物LPS的1.7倍。
在NBH组和ME7组中，IL-6转录物均低于检测限。LPS外周攻击诱导NBH和ME7感染小鼠大脑中可量化水平的IL-6(). 在ME7动物中，LPS诱导的IL-6增加大约是NBH动物中LPS诱导IL-6增加的三倍(第页< 0.01). TGFβ1未观察到这种模式，在ME7、ME7+生理盐水和ME7+LPS中明显升高，但这些组之间无显著差异。腹膜内LPS不会在ME7或NBH动物的海马中诱导TGFβ1(). iNOS基因的转录在NBH、ME7、NBH+LPS和ME7+盐水组中一致且低，并且仅在ME7+LPS腹腔注射组中显示升高(第页< 0.01) ().
腹腔注射LPS的NBH和ME7小鼠急性期反应物的表达
LPS的外周攻击使NBH和ME7感染小鼠大脑中的急性脑反应物mRNA表达增加。在ME7+生理盐水和NBH+LPS腹腔注射组，PTX3 mRNA水平没有差异(). 然而，当ME7组受到LPS攻击时，PTX3基因表达显著增加，超过了ME7和LPS单独治疗所能解释的结果。ME7感染与腹腔注射ME7+LPS之间的差异具有统计学意义(第页<0.001），以及ME7+LPS腹腔注射和NBH+LPS腹膜注射之间的差异(第页< 0.01). α无统计学差异2-ME7+盐水腹腔注射组、ME7+LPS腹腔注射组和NBH+LPS腹膜注射组之间的AP mRNA()，尽管α有增加的趋势2-两个LPS注射组的AP表达。在所有处理中，C3 mRNA表达也没有统计学差异()尽管ME7+LPS腹腔注射动物与ME7+生理盐水腹腔注射组和NBH+LPS腹膜注射组相比表现出增加表达的趋势。与ME7+盐水腹腔注射动物相比，ME7+LPS腹腔注射和NBH+LPS脑内SAA mRNA表达显著升高() (第页<0.01），但两个LPS注射组SAA表达无差异。
LPS全身激发对ME7和NBH动物CNS急性期反应物转录表达的影响。PTX3系列(一), α2-AP公司(b条)，C3(c（c）)和SAA(d日)注射外周LPS后，mRNA均增加，但ME7+LPS组中只有PTX3相对于NBH+LPS有统计学意义的增加。所有数据均以平均值±SEM表示。*第页< 0.05;**第页< 0.01;***第页< 0.001; 方差分析。NBH+LPS，n个= 4; ME7+生理盐水，ME7+LPS，n个= 5. Sal和Saline。
小胶质细胞表型与外周炎症信号转导
与用LPS腹膜内攻击的NBH动物相比，ME7和ME7+LPS腹膜内组中小胶质细胞的形态学表现是活化细胞的特征(). 然而，正如在脑内LPS激发后明显可见的那样，根据番茄凝集素染色判断，腹腔内LPS并没有在这些小胶质细胞中诱导任何额外的形态学变化(). 腹腔注射LPS后，血管周围巨噬细胞和海马血管内皮细胞表达IL-1β(). NBH组和ME7组注射生理盐水后均未观察到阳性染色的小胶质细胞(). 然而，ME7动物腹腔注射LPS后，海马血管系统附近的内皮细胞、血管周巨噬细胞和小胶质细胞显示出明显的IL-1β染色(，插图）。因此，朊病毒病患者大脑中激活的小胶质细胞被激活，对周围LPS诱导的炎症信号产生更大的IL-1β反应。
腹腔注射LPS后的神经病理和炎症变化。a-c公司NBH+LPS脑内小胶质细胞的番茄凝集素染色(一)，ME7+生理盐水(b条)和ME7+LPS(c（c）)动物。d-f型NBH+LPS中IL-1β免疫染色(d日)，ME7+生理盐水(e（电子）)和ME7+LPS(（f）)大脑（插图显示了放大63倍后具有小胶质细胞形态的细胞中清晰的IL-1β阳性染色）。NBH+LPS中环氧合酶-2的免疫染色(克)，ME7+生理盐水(小时)和ME7+LPS(我)大脑显示为40倍(克,小时,我)和63×（插图）。j个ME7+LPS大脑丘脑单个区域内三个细胞（箭头所示）的TUNEL阳性染色。插图中，Hoescht 33352染色的细胞核与正常细胞核（右侧）相比，染色质（左侧）萎缩和浓缩。CA3神经元中显示TUNEL阳性DAB染色(k个)根据形态和位置确定，NeuN（VIP色色素）未能清晰双重染色。我,米，激活的caspase-3阳性细胞显示神经元形态。激活的caspase-3阳性神经元(o个)神经丝重链免疫标记双重染色(第页)带覆盖层(q个)共聚焦显微镜在1μm切片上显示。n个显示TOPRO-3核染色。比例尺：（英寸一)a-i公司，100微米；（英寸米)我,米，80微米；n-平方，50微米。
环氧合酶的内皮表达和随后前列腺素E2的分泌被认为是外周炎症信号通过血脑屏障的一种常见机制(Ek等人，2001年). 我们观察到内皮细胞和血管周围巨噬细胞上COX-2的显著上调(). 朊病毒病本身确实诱导小胶质细胞COX-2表达()，如前所述(沃尔什等人，2000年).
外周LPS后中枢神经系统炎症增加的后果
为了研究外周LPS激发引起的脑部炎症增加的后果，我们检测了细胞死亡。我们使用TUNEL染色来标记DNA断裂的细胞。这种方法可以揭示阳性染色但随后不会发生细胞死亡的细胞。因此，我们在计数中只包括染色阳性、形态萎缩、细胞核染色质明显浓缩的细胞，这与不可逆细胞损伤一致(，插图）。注射后19周，ME7动物出现大量凋亡细胞死亡，而正常动物的凋亡细胞死亡水平确实很低。如所示与NBH动物相比，ME7动物中TUNEL阳性细胞数量增加，呈现凋亡形态学。接种后19周，全身注射生理盐水对ME7动物的凋亡细胞数量没有显著影响。同样，腹腔注射LPS对NBH动物的凋亡细胞数量没有显著影响。然而，LPS攻击使ME7动物的凋亡细胞数量在统计学上显著增加(;). 当校正基线TUNEL阳性数（即NBH动物中的阳性数）时，患朊病毒的动物在LPS激发后的细胞死亡是未激发或含盐ME7动物的两倍以上(). 我们试图用双重免疫细胞化学方法将这些濒临死亡的细胞鉴定为神经元，但由于18小时时处于退行性变的晚期，这些细胞在形态学上无法识别，并且不表达GFAP或NeuN等可检测的细胞抗原(). 因此，我们还用抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抗体在LPS后3、6、9和13小时对这些动物和其他动物的切片进行染色。这种染色显示，与TUNEL技术相比，死亡细胞更少，这与激活的caspase-3表达的时间窗更短一致(布莱希特等人，2001年). 然而，在这些研究中，腹腔注射LPS的ME7动物所含活化caspase-3阳性细胞的数量大约是盐水注射的ME7小鼠的两倍(). 许多活化的caspase-3阳性细胞具有形态学或定位，表明它们是神经元()但由于退化细胞的抗原表达发生改变（即这些死亡细胞的GFAP、NeuN和番茄凝集素也为阴性），这些细胞的双重染色也出现了一些技术困难。然而，这些细胞中绝大多数被激活的caspase-3和神经元标记物神经丝重链染色阳性(). 这种蛋白质是根据其生化稳定性来选择的，我们判断这种稳定性有可能确保其在细胞退化的后期得到保存。
表2。
动物组
|
TUNEL阳性细胞
|
活化的caspase-3阳性细胞
|
|---|
| NBH公司 | 5.3 ± 0.2 (n个= 3) | ND（无损检测） |
| ME7公司 | 26.8 ± 1.6 (n个= 3) | ND（无损检测） |
| NBH+LPS | 6.8 ± 0.5 (n个= 5) | 1.4 ± 0.7 (n个= 5) |
| ME7+LPS | 50.2 ± 2.3 (n个=9)b条
| 12.2 ± 2.0 (n个=5)b条
|
ME7+生理盐水
| 27.8 ± 3.0 (n个= 5)
| 6.6 ± 1.3 (n个= 6)
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讨论
在当前的研究中，我们证明，在朊病毒疾病诱导的慢性神经变性中，小胶质细胞表现出典型的活化小胶质细胞形态和抗原表达的特征性改变，但不产生炎症介质IL-1β或iNOS。然而，无论是脑内注射还是腹腔注射，这些细胞都会对随后的炎症挑战产生更大的反应。先前有小胶质细胞活化的ME7动物对脑内LPS的炎症反应严重，小胶质细胞IL-1β和iNOS表达显著，大量中性粒细胞浸润。同样，腹腔内LPS攻击在朊病毒感染动物中产生了显著的小胶质细胞IL-1β表达和其他炎症基因的转录，如IL-6、TNF-α、PTX3和iNOS。值得注意的是，在神经退化和小胶质细胞激活的动物中，这种单一的全身LPS攻击会导致神经元死亡。
脑内LPS挑战的后果
用番茄凝集素标记清楚地表明，朊病毒病通过增加细胞数量、增加凝集素靶向抗原的表达以及激活的形态学特征诱导小胶质细胞激活。然而，这些细胞不能合成可检测到的IL-1β蛋白。在用脂多糖进行脑内刺激后，这些小胶质细胞在形态或数量没有任何额外变化的情况下容易产生可检测到的IL-1β。因此，小胶质细胞的形态不足以分析这些细胞的表型：活化的小胶质细胞可以在功能上表现出明显的差异体内.
正常脑实质内注射脂多糖会引起中性粒细胞向脑实质内募集有限(Andersson等人，1992年). LPS对ME7动物脑实质的攻击引起了非常显著的中性粒细胞浸润，在LPS攻击的NBH动物中不明显。因此，小胶质细胞IL-1β的合成具有明确的生物学后果。这种中性粒细胞浸润可能是通过CXC趋化因子-巨噬细胞炎症蛋白-2的表达诱导的。这种趋化因子由IL-1β诱导(Xu等人，1995年)中和IL-1β或大鼠等效CXC趋化因子，即细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1，可以阻止中性粒细胞向中枢神经系统的浸润(安东尼等人，1998年). 已知IL-1β表达也可诱导iNOS(Serou等人，1999年)因此可能是iNOS小胶质细胞表达的基础。氧化剂NO的产生与神经元的死亡和损伤有关(Takeuchi等人，1998年;Smith等人，2001年).
在目前的研究中，LPS的脑内攻击表明，在慢性神经退行性变过程中，大脑微环境及其细胞成分在多大程度上被启动，从而对随后的炎症攻击产生过度反应。我们的数据表明，在那些已经经历神经变性相关小胶质细胞活化的患者中，对CNS感染、中风和头部损伤等侮辱的炎症反应会加剧。鉴于IL-1β加剧缺血性神经元损伤的证据(Stroemer和Rothwell，1998年)，我们预测中风和中枢神经系统感染对正在进行神经退行性变的患者会产生更严重的后果。关于中枢神经系统感染对痴呆的影响的研究很少，但有许多研究表明，脑缺血对持续性痴呆患者的影响更为严重(Appelros等人，2002年;Koistinaho和Koistinaho，2005年). 本文的结果为这些临床发现提供了可能的解释。
全身炎症对中枢神经系统的影响
众所周知，外周炎症可刺激中枢炎症细胞因子mRNA和蛋白质合成(Laye等人，1994年;Pitossi等人，1997年)这些细胞因子协调一组适应性行为改变，统称为疾病行为(Konsman等人，2002年). 在先前有小胶质细胞活化的朊病毒感染小鼠中，脂多糖诱导过度的疾病行为和增加IL-1β的中枢合成(Combrinck等人，2002年). 使用相同的ME7模型，我们现在发现脂多糖还可以诱导退化大脑中大量细胞因子和急性期反应物的过度变化。LPS诱导ME7动物IL-1β、IL-6和TNFα的促炎性细胞因子mRNAs的水平高于NBH动物，这不能通过个体治疗的加性效应来解释。LPS刺激并没有导致TGFβ1的急性升高，该基因在该模型中已经高度表达(坎宁安等人，2002年). 这导致促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的平衡发生“转换”，并可能允许在全身炎症后的急性期激活不同的下游级联。这些结果与两种淀粉样前体蛋白过度表达小鼠腹腔注射LPS后CNS细胞因子mRNA表达增加一致(Sly等人，2001年)和早老素-1突变小鼠(Lee等人，2002年)表明这种“小胶质细胞启动”对小鼠朊病毒病并不特异。
LPS攻击后的急性期反应物基因表达在ME7和NBH动物中通常相似，但与对照动物相比，朊病毒病小鼠中的PTX3被LPS高度诱导。PTX3是五聚体的成员，五聚体被认为调节凋亡细胞、病原体和碎片，以便Fcγ受体表达细胞吞噬(Bharadwaj等人，2001年; Mold等人。，2002年a,b条). 与C反应蛋白一样，PTX3被证明可以控制巨噬细胞的激活程度：PTX3过度表达的巨噬细胞对LPS挑战的反应比对照组更强(Dias等人，2001年). 当前研究中观察到的PTX3水平升高可能在LPS过度反应中起作用。
如果脂多糖确实对调理作用或吞噬作用有影响，那么这种全身刺激也可能对淀粉样蛋白的清除起到一些有益的作用，正如AD动物模型所显示的那样(DiCarlo等人，2001年;Herber等人，2004年). 然而，对这一领域的深入讨论超出了本研究的范围。
因此，患有慢性神经退行性变的动物的全身炎症会导致炎症表型，这种炎症表型不同于仅由上述任一条件产生的炎症表型，但也不同于个体特征的加性效应。朊病毒患病动物和正常动物的外周细胞因子反应没有差异(坎宁安等人，2005年)因此，中枢神经系统水平的脑炎症反应加剧。小胶质细胞数量和敏感性的增加是最有可能的解释，但朊病毒感染动物的血管系统中也存在比正常动物更多的血管周围巨噬细胞(Galea等人，2005年)以及病理区域星形胶质细胞的激活，这些也可能有助于增强中枢神经系统对外周挑战的反应。
结论
最后，我们必须重申，目前几乎没有证据表明炎症在朊病毒疾病进展中起直接作用：朊病毒病和其他神经变性动物模型中的小胶质细胞反应似乎受到严格控制，以防止退化过程的恶化。但这种炎症反应改变了小胶质细胞的数量、形态和敏感性，使大脑变得活跃，更容易受到随后的炎症损伤(Sly等人，2001年;Lee等人，2002年;Nguyen等人，2004年). 这些侮辱可能会影响神经退化的速度。抑制外周炎症可能是慢性神经退行性变的相关治疗靶点，也可能是非甾体抗炎药预防AD发展的一个组成部分。
