p75神经营养素受体负性调节海马神经元树突状复杂度和脊髓密度

摘要

介绍

哺乳动物神经元的一个显著特征是其树突树的复杂性，它们在树突树上接收、处理和整合突触前伙伴的输入。许多神经元的树突状体上装饰着棘，棘是小而特殊的隔室，代表兴奋性突触的突触后位点。神经元树突状突起的形状和范围在发育过程中发生显著变化，并且它们深受神经元活动的影响(布利斯和柯林里奇，1993年;Dunaevsky等人，1999年;Malenka和Nicoll，1999年). 此外，突触强度的变化与脊椎的重塑有关(Engert和Bonhoeffer，1999年;Maletic-Savatic等人，1999年;Toni等人，1999年)（有关审查，请参阅Yuste和Bonhoeffer，2004年).

神经营养素及其受体是神经形态调节剂的候选分子之一。神经营养素构成一个分子家族，包括神经生长因子、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素-3和神经营养素-4。它们是以活动依赖的方式从神经元释放的分泌蛋白质。两种受体介导神经营养素作用：酪氨酸激酶A（TrkA）、TrkB和TrkC(Patapoutin和Reichardt，2001年)和泛神经营养素受体p75（p75^NTR公司)属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族(德尚和巴德，2002年). 这种双重受体系统解释了神经营养素所产生的多种效应，通常是拮抗性的。众所周知，神经营养素的营养功能，包括例如防止发育过程中的程序性细胞死亡(利维·蒙塔尔奇尼和布克，1960年;斯奈德，1988;Ernfors等人，1995年)，由Trk受体介导。相反，神经营养素与p75的结合^NTR公司可导致神经系统中的细胞死亡（例如隔核、脊髓和视网膜）(Frade等人，1996年)（有关审查，请参阅弗里德曼，2000). 神经营养素在活动依赖性突触可塑性过程中也发挥拮抗作用。例如，BDNF及其受体TrkB在海马长时程增强（LTP）的诱导和维持中起着至关重要的作用（综述见Poo，2001年). 相反，删除p75^NTR公司导致长期抑郁症的严重损害(Rösch等人，2005年;Woo等人，2005年)，不影响LTP。

就结构可塑性而言，神经营养素通过促进树突状结构来控制神经元形态（有关综述，请参阅McAllister等人，1999年)轴突伸长和树状化(科恩·科里和弗雷泽，1995年). 这些效应被认为是通过激活Trk受体介导的。相反，p75^NTR公司被认为通过激活Rho GTPase的能力阻止过程延伸(Yamashita等人，1999年). 它还被证明通过髓磷脂衍生的神经突生长抑制剂介导轴突生长抑制(Wang等人，2002年). 在发育中的大脑皮层中，有明显证据表明，神经营养素在以层特异性和活动依赖性的方式调节皮层神经元的树突生长和分支方面发挥着重要作用(McAllister等人，1999年). 此外，BDNF外源性应用调节成熟海马锥体神经元树突状棘的数量和形状(Tyler和Pozzo-Miller，2001年).

为了进一步探索控制神经元形态的机制，我们分析了p75^NTR公司参与调节成熟神经元的树突状结构。

材料和方法

海马片培养物的制备。从出生后第5天（P5）到P6 C57BL/6野生型（WT），p75制备海马器官型培养物^{NTR公司外显子IV}(第75页^NTRIV公司)，或p75^{NTR公司外显子III}(第75页^NTRIII公司)采用Stoppini等人(1991). 简单地说，在含有0.5 ml氰尿酸（100 m）的冷冻无菌Gey平衡盐溶液中解剖海马体米储备溶液）和0.5 ml葡萄糖（50%储备溶液），并调节至pH 7.2。然后在组织切碎器上横向切取海马，厚度为400μm（伊利诺伊州伍德戴尔市麦克伊尔文）。将切片镀在Millicell CM膜插入物上（Millipore，Bedford，MA），并在37°C，7%CO中培养₂，99%湿度培养箱。切片保存在含有50%DMEM和不含谷氨酰胺的HBSS、25%HBSS、1 ml葡萄糖（50%）、25%供体马血清（HyClone、Logan、UT）和0.5 ml我-谷氨酰胺（200 m米储备溶液），每三天更换一次介质。为了减少非神经元细胞的数量，用抗有丝分裂药物（阿糖胞苷、尿苷和氟脱氧尿苷，10^-6至10^-7个 米每个；Sigma，德国慕尼黑）。

质粒和试剂。为了在器官型培养物中观察锥体细胞，我们在巨细胞病毒（CMV）启动子下用绿色荧光蛋白（GFP；GFP-N1；Clontech，Mountain View，CA）转染单个神经元。为了分析脊椎形态，我们表达了一种法尼基化形式的GFP，在CMV启动子（Clontech）的驱动下，特异性靶向细胞膜。鼠标全长第75页^NTR公司cDNA质粒（GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC038365”，“term_id”：“23468246”，“term_text”：“BC 038365“}}BC038365号)亚克隆到pSP70载体中。

颗粒介导的基因转移。15天后，使用粒子介导的基因转移设备Helios基因枪系统（Bio-Rad，Hercules，CA）转染海马切片培养物在体外（DIV）。根据Helios基因枪（Bio-Rad）说明书，在Qiagen（加利福尼亚州巴伦西亚）柱上纯化质粒，并沉淀到0.6μm金微载体颗粒上。对于共转染，DNA负载比为3:1(第75页^NTR公司到GFP公司)共2μg/mg金。对于GFP对照实验，质粒总量也为2μg/mg金。然后，将涂有表达质粒的金珠从塑料管子弹中发射到切片上，并以50磅/平方英寸的氦气快速爆炸。金珠子在切片上方约1 cm处退出基因枪，并通过孔径为3μm的过滤器，以防止大串珠子到达切片。转染后2至4天，将切片固定并用于免疫组化。

免疫组织化学。使用p75抗体的免疫组织化学^NTR公司对所有切片进行常规检查，以区分p75^NTR公司仅表达GFP的对照神经元过度表达。用4%多聚甲醛短暂固定切片，并在含有0.2%Triton X-100和10%PBS中正常山羊血清的封闭溶液中孵育1小时。然后在4°C下用一级抗体（抗人p75）孵育切片过夜^NTR公司; Promega，Madison，WI）在封闭溶液中以1:500稀释，最后用在PBS中以1:400稀释的第二抗体[花青3（Cy3）-或Cy5缀合的抗兔IgG；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA]在室温下4小时。清洗后，使用含有防褪色剂的水性固定介质（加利福尼亚州福斯特市Biomeda）固定切片。对于突触蛋白I染色，我们使用了一个冗长的方案，将弹片固定在4%PFA中过夜，并在含有0.4%Triton X-100、1.5%正常马血清和0.1%BSA的PBS封闭溶液中培养1d。然后将弹片在4°C的初级抗体（抗人突触蛋白Ⅰ；加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）中培养7-10d在没有BSA的相同封闭溶液中稀释1:500。二级抗体在PBS中稀释1:400，切片在黑暗中4°C培养1-2天。清洗后，使用含有抗褪色剂（Biomeda）的水性安装介质安装切片。对每种抗体进行适当的对照，但缺乏一级抗体。

神经元选择。在CMV启动子的控制下，单个携带GFP的金粒子的传递导致整个树突状树干的强烈标记（参见图2A、 B类)以及所有树突棘（参见图3A类)单个锥体神经元。我们只选择非重叠标记神经元进行分析，以明确重建整个树突树。通过将编码p75的DNA以3:1的混合物包裹在金颗粒上，实现了可靠的共转染^NTR公司建筑和GFP。后hoc用免疫组织化学方法证实p75^NTR公司过度表达。所有分析的神经元均来源于P5-P6小鼠培养物，培养用于14-18 DIV。在每种培养物中转染少量单个锥体神经元，以便轻松跟踪每个标记神经元的完整树突过程。采用解剖学标准分别将神经元识别为齿状回颗粒细胞、CA1锥体细胞、CA3锥体细胞或中间神经元。选择用于分析的神经元均为CA1和CA3锥体细胞，完全充满GFP，未显示退化迹象。

在单独的窗口中打开

图2。

WT和p75中表达GFP的锥体神经元的树突形态^NTRIV公司淘汰动物。A类共聚焦图像，由多层光学切片组成，显示GFP标记的海马锥体神经元的正常形态。注意树突的完全填充以及没有任何退化迹象。比例尺，100μm。B类，共聚焦图像显示了p75的两个典型示例^NTRIV公司KO衍生的锥体神经元。注意树突的复杂性和长度基本正常。比例尺，100μm。C类，Sholl分析比较WT和p75的顶部和底部树突^NTRIV公司KO锥体神经元。^*第页< 0.05.

在单独的窗口中打开

图3。

WT和p75表达GFP的锥体神经元的脊髓密度计数^NTRIV公司淘汰动物。A类，WT和p75的代表性顶端树突堆叠的两张高功率共焦图像^NTRIV公司KO神经元。请注意，KO神经元的脊椎密度高于WT。比例尺，3μm。B类，直方图显示脊柱密度计数，证实KO（红色）神经元与WT（绿色）神经元脊柱密度较高的定性印象。显示了总脊柱密度和不同树突隔室中的密度。请注意，与顶端树突室相比，顶端树突中段和基底部树突室的脊柱密度差异更大。^*第页< 0.05;^**第页< 0.005.C类，左侧，GFP标记的脊髓和一些突触蛋白I阳性突触前终末的高倍放大视图（红色；箭头）。比例尺，1μm。对，WT和p75中与突触蛋白I阳性点共定位的树突棘比例的量化^NTRIV公司KO枝晶。误差条代表SEM。

神经成像和分析。选择用于分析的神经元用徕卡（德国努斯洛赫）TCS-NT或徕卡SP2共焦显微镜成像。每个神经元首先使用40×物镜[数值孔径（NA），1.25]和z（z）-以0.5μm的增量进行分段。然后将单个图像堆栈折叠，导入Photoshop（Adobe Systems，San Jose，CA）并安装，以获得随后用于Sholl分析的整个神经元的二维重建(肖尔，1953年)树枝长度和复杂性。Sholl分析是使用Neurolucida软件（MicroBrightField，Colchester，VT）进行的，该软件计算从细胞体开始的每个神经元在10μm间隔距离点的树突状交叉的累积数量。分别对基底树突和顶端树突进行树突交叉次数分析。我们还计算了每个细胞的交叉总数，作为总树突复杂性的指标。分别测量基底树突、中根尖树突和最顶端树突的脊柱密度。使用63倍物镜（NA，1.32）对选定的树枝晶片段进行成像，变焦2z（z）-以0.3μm的增量进行分段。使用Imaris软件的测量工具（Bitplane，Zürich，Switzerland）在三维（3D）堆叠上计数棘的数量和树突的长度。注意确保每根脊椎沿着相邻脊椎的路线计数一次z（z）-部分。将每微米树枝状长度的棘数标准化。在分析过程中，在不知道样本身份的情况下，盲目进行脊椎计数。无论是树突复杂性还是脊椎密度值，我们都没有发现CA1和CA3锥体树突之间有任何显著差异。因此，我们将这两个区域的神经元结合在一起进行量化。

脊椎的分类。树突棘根据两个主要标准分类(Harris等人，1992年;Koh等人，2002年). 首先，测量它们从树突基部到头顶的长度（见图4A类，L). 此外，脊椎形状是由脊椎、颈部和头部的最小（最小）和最大（最大）直径之比定义的，这使我们可以按照标准类别对其进行分类(彼得斯和凯斯曼·阿布拉莫夫，1969年)短梗型（I型）、蘑菇型（II型）和薄型（III型）（参见图4A类). 特别是，对脊椎进行了逐一分析，并根据其长度、最小直径和最大直径之间的关系将其分为特定类别。因此，我们能够区分三种主要的脊椎亚型：短梗，其中长度<1μm，最大_头/最小值_脖子比值<1.5；薄，其中最大_头/最小值_脖子比值<1.5，长度≥1μm；蘑菇，其中最大的_头/最小值_脖子比率≥1.5（与长度无关）。这种方法的优点是，棘的类别是由客观标准决定的。为了测量棘的长度、最大直径和最小直径，使用徕卡SP2共聚焦显微镜和63倍物镜（NA，1.32）从最顶端、中顶端和基底区获得树突拉伸的图像变焦为8z（z）-以0.3μm的增量进行分段。在测量过程中，我们没有考虑任何3D信息。使用Imaris软件（Bitplane）中的测量工具进行脊柱测量。

在单独的窗口中打开

图4。

WT和p75脊柱类型的分类^NTRIV公司KO神经元。A类，WT神经元树突的代表性图像，显示不同类型的树突棘。比例尺，2μm。根据脊柱长度（L）及其最大头部（Max）之间的比率，将脊柱类型分为三类，如右图所示_头)和最小颈部（最小_脖子)直径：短梗（I型）、蘑菇（II型）和薄（III型）。B类，上图显示了WT（绿色）和p75的三种脊椎类型的比例^NTRIV公司KO（红色）神经元。底部图表显示了分别绘制的根尖、中根尖和基底室的差异。在p75的基底树突室^NTRIV公司KO神经元中短粗棘的比例显著降低，但蘑菇棘的比例明显高于WT神经元。^*第页< 0.05. 误差条代表SEM。

突触蛋白I阳性树突棘的定量。评估附加脊椎是否第75页^NTR公司KO小鼠含有功能性突触，我们在海马切片中对突触蛋白酶I进行了免疫标记，并分析了WT和第75页^NTRIV公司KO小鼠。当GFP标记的树突状棘与同一z截面或其上或其下的一个截面中的突触蛋白I阳性点紧密并列时，被认为是共定位的。使用Leica SP2共聚焦显微镜和63×（NA 1.32）物镜，使用8倍变焦和0.3μm增量的z切片，获得最顶端、中顶端和基底树突树的延伸图像。使用Imaris软件（Bitplane）中的测量工具盲目进行脊柱测量。

统计分析。使用Microsoft（Redmond，WA）Excel或Statistica进行统计分析。使用双尾Student’st吨测试或，用于n个≤5，Mann-Whitney非参数检验。的值第页<0.05被认为是显著的。使用双尾学生的t吨逐点测试。所有显示的数据均以平均值±SEM表示。

实时PCR分析。进行实时定量PCR以确定第75页^NTR公司在发育中的海马、小脑和海马脑片中。提取总RNA(Chomczynski和Sacchi，1987年)并使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）转化为cDNA。Primer Express软件（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）用于设计两个独立的第75页^NTR公司底漆和探针组合：探针组p75^NTR公司-A、 “p75引物sense 1，”5′-CCC CAC CAG AGG GAG AGA A；“p75引物反义（AS）2，”5′-GGC TAC TGT AGA GGT TGC CAT CA和“p75探针#3”5′-（FAM）-5′-ACT GCC TCA GCC CAA GCC CTC AA-3′-（TAMRA）；探针组p75^NTR公司-A、 “p75引物sense 13，”5′-TGT-GGG-CCT-TGT-GGC-TTAT；“p75引物AS 14，”5′-AGT TTC TCT CCC TCT GGT GGG；和“p75探针15，”5′-（FAM）-5′-TTG CTT GCA GCT GTT CCA TCT CTT GAA AG-3′-（TAMRA）。规范化第75页^NTR公司用所述的引物/探针集测定GAPDH mRNA的表达水平(Giulietti等人，2001年). 所有实时PCR均使用2×Thermo-start QPCR系统（ABgene，Epsom，UK）和0.5μl合成cDNA进行三次。在GenAmp 5700系统（Applied Biosystems）上进行热循环，并使用GenAmp 5800 SDS和Excel软件（Microsoft）分析实时PCR数据。

利波罗布合成和就地杂交。a的核苷酸位置835-1270第75页^NTR公司cDNA质粒（GenBank登录号｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“BC038365”，“term_id”：“23468246”，“term_text”：“BC038365”｝BC038365号)亚克隆到pSP70载体中。这允许生成特定于绞线的第75页^NTR公司地高辛标记的核糖探针(Holz等人，1996年). 探针对应于细胞外、跨膜和死亡区域的部分第75页^NTR公司分子没有与保守TNFR结构域重叠。

现场如前所述，对切片培养物和组织切片进行杂交(Holz等人，1996年). 组织用4%多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲液中，乙酰化并渗透。在杂交缓冲液中孵育【50%甲酰胺，5×SSC和2%封闭试剂（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）】后，组织与正义或反义杂交第75页^NTR公司核糖探针在68°C下放置16 h。在0.2×SSC中在70°C下严格洗涤后，通过碱性磷酸酶结合抗地高辛抗体（Roche Diagnostics）和硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯吲哚磷酸显色反应检测到特异性结合的核糖探针。在显微镜分析之前，用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐对组织进行复染。

结果

的表达式级别第75页^NTR公司在海马器官型培养中

我们首先确定了第75页^NTR公司在培养的小鼠海马脑片中，并与发现的脑片进行比较体内在同一年龄。我们使用定量实时PCR检测，发现第75页^NTR公司P10和P28小鼠海马的转录物(图1A类). 如预期(Buck等人，1988年;Lu等人，1989年)第75页^NTR公司海马的表达受到发育调控(图1A类). 同样第75页^NTR公司在P5分离并成熟的海马片培养物中也检测到在体外额外5或23天。与我们的类似体内观察，第75页^NTR公司在额外2周后发现表达减少在体外成熟(图1A类).

在单独的窗口中打开

图1。

p75的表达模式^NTR公司在小鼠海马体中。A类，定量实时PCR分析记录p75的表达^NTR公司在发育中的海马体（HIP）和小脑（CER）以及海马片培养物（HIP片）中。CNS组织取自10或28天龄的动物。切片具有相应的年龄，并从允许成熟的P5小鼠大脑中分离出来在体外分别延长5天或23天。注意，在每种情况下，p75^NTR公司表达在发育过程中被下调。基因表达数据以相对p75的百分比表示^NTR公司转录水平归一化为GAPDH mRNA。误差条表示三次测量的平均值SD。共进行了四次独立的实时PCR实验（3次使用p75探针组^NTR公司-A和1，带探针组p75^NTR公司-B） 都给出了类似的结果。B类，缩微照片显示就地p75的杂交^NTR公司P21小鼠海马mRNA表达。注释p75^NTR公司齿状回和CA1和CA3区域的基因表达[4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）染色在底部面板中]。用p75孵育的切片^NTR公司sense探针未显示特定染色（右侧面板）。比例尺，1 mm。C类，缩微照片显示就地p75的杂交^NTR公司来自P5小鼠的海马片培养物中的mRNA，培养15天体内条件，p75^NTR公司在齿状回以及CA1和CA3中检测到mRNA。用感测探针孵育的切片没有显示特定染色（右面板）。比例尺，1 mm。D类左，用p75染色的培养物CA1区的高倍放大^NTR公司反义探针在上述所有区域均显示大量阳性细胞。对，放大后显示CA1区有几个阳性细胞。比例尺分别为500和100μm。现场杂交如所示B-D公司进行了五次以上的试验，每个试验的结果都相同。

要确定哪些单元格类型表示第75页^NTR公司基因，我们进行了就地使用a的杂交实验第75页^NTR公司-特异性反义核糖探针及其比较第75页^NTR公司从P5小鼠大脑中获得海马培养物并培养2周后，P21小鼠大脑中的表达在体外.第21页，第75页^NTR公司表达仅限于海马体、小脑和中隔（数据未显示）。在P21海马体中第75页^NTR公司反义检测到高水平的第75页^NTR公司齿状回神经元及CA1和CA3区的mRNA(图1B类; 与右侧的sensetreated部分进行比较）。同样，年龄匹配的海马器官型培养物显示出显著水平的第75页^NTR公司表达式(图1C类). 海马培养物CA1和CA3区的神经元均显示第75页^NTR公司表达式(图1D类). 在这两个地区，观察到两种不同的细胞群，其特征是(图1D类，箭头）或低（箭头）第75页^NTR公司表达式级别。

枝晶形态和脊椎密度第75页^NTRIII公司KO神经元

为了证实我们的观察结果，p75^NTR公司在树突和脊椎形态的负调控中起着重要作用，我们利用了第二个突变体的存在第75页^NTR公司外显子III被靶向的基因(第75页^NTRIII公司) (Lee等人，1992年). 在Paul等人最近的一份报告之后，对第二个突变小鼠系的分析变得尤为重要(2004)建议，在第75页^NTRIV公司突变后，小鼠仍可能表达受体的促凋亡片段。在第75页^NTRIII公司KO小鼠，全长受体（FL-p75）完全缺失，而截短型的第75页^NTR公司（S-p75），缺失神经营养素结合域，仍然表达(von Schack等人，2001年) (图5A类).

在单独的窗口中打开

图5。

表达GFP的p75的形态学^NTRIII公司KO衍生的锥体神经元。A类，总结p75的图表^NTR公司亚型分别以WT（绿色）、p75表达^NTRIII公司（紫色）和p75^NTRIV公司（红色）KO小鼠，其中FL-p75表示全长受体，而S-p75表示短p75^NTR公司缺乏神经营养素结合域的亚型。改编自von Schack等人(2001).B类，共聚焦图像显示p75的典型示例^NTRIII公司KO衍生锥体神经元。注意，树枝状结构基本正常。比例尺，100μm。C类，Sholl分析比较WT（绿色）中的顶部和底部树突，第75页^NTRIII公司（紫色），p75^NTRIV公司（红色）和KO锥体神经元。D类，以WT为单位显示脊柱密度计数的直方图（绿色）和第75页^NTRIII公司（紫色），对比p75^NTRIV公司KO（红色）KO神经元。每微米树枝状晶显示的是脊椎数。显示了总脊柱密度和不同树突室中的密度。注意p75的中间表型^NTRIII公司WT和p75之间的（紫色）KO神经元^NTRIV公司KO脊椎密度值。^*第页< 0.05. 误差条代表SEM。

正如在第75页^NTRIV公司突变小鼠第75页^NTRIII公司KO锥体神经元也显示出基本正常的树突形态(图5B类). 类似于第75页^NTRIV公司突变体，树突交叉总数显示树突复杂性增加，仅对基底树突室（顶端室，第页= 0.35; 基底隔室，第页=0.02）与WT枝晶相比(图5C类). 枝晶总复杂度第75页^NTRIII公司然而，KO衍生的锥体神经元与第75页^NTRIV公司KO神经元(图5C类)（基础，第页=0.48；顶端，第页= 0.99). 有趣的是，树突顶端的Sholl分析第75页^NTRIII公司神经元表现出树突复杂性的轻微增加，特别是在树突顶端的中远部，再现了我们在第75页^NTRIV公司KO神经元(图5C类)（重量，n个= 10;第75页^NTRIII公司，个= 9;第75页^NTRIV公司，个=10）。此外，尽管在Sholl分析中第75页^NTRIII公司顶端树突似乎更长，因此比第75页^NTRIV公司最顶端的神经元，这个观察结果再次没有达到显著水平（没有分数第页Sholl分析<0.05，长度第页= 0.71). 在基底树突水平上也观察到类似的效果。在这里，第75页^NTRIII公司神经元更长(第页=0.04）以及明显比野生型神经元更复杂(图5C类) (第页距体120至230μm之间<0.05）。然而，我们再次观察到，在树突复杂性和长度方面第75页^NTRIV公司和第75页^NTRIII公司神经元(图5C类)（没有意义第页Sholl分析<0.05，长度第页=0.12）。一起，第75页^NTRIII公司KO锥体神经元大体上与WT动物表现出相同的差异第75页^NTRIV公司KO神经元。

脊柱密度测量第75页^NTRIII公司KO神经元在WT和第75页^NTRIV公司KO神经元。总脊柱密度在第75页^NTRIII公司KO锥体神经元与WT神经元的比较(第75页^NTRIII公司，0.63±0.05棘/μm，n个=5；重量，0.51±0.03棘/μm，n个= 9;第页= 0.02) (图5D类). 相反，总脊柱密度第75页^NTRIII公司突变神经元明显低于第75页^NTRIV公司KO神经元（0.82±0.09棘/μm；第页= 0.37;n个= 11). 中间表型的趋势在所有不同的树突分区中都保持不变，尽管在脊椎密度值为第75页^NTRIII公司与WT显著不同，但与第75页^NTRIV公司（顶端：第75页^NTRIII公司，0.29±0.05棘/微米树枝晶，与WT相比，第页=0.32，对第75页^NTRIV公司，第页= 0.02; 中尖：第75页^NTRIII公司每微米树枝晶的0.79±0.4棘，与WT相比，第页=0.06，反对第75页^NTRIV公司，第页= 0.07; 基础：第75页^NTRIII公司0.85±0.03棘/微米树枝晶，相对于WT，第页=0.04，对第75页^NTRIV公司，第页= 0.99) (图5D类).

全长过度表达第75页^NTR公司显著降低树突复杂性和树突棘密度

我们在以下两方面的观察结果第75页^NTR公司KO小鼠支持p75的假设^NTR公司对成熟海马锥体神经元的形态起着重要的负调控作用。为了证实这一观点，我们采取了一种获得功能的方法，即过度表达全长小鼠第75页^NTR公司我们切片中的cDNA。p75的免疫组织化学^NTR公司仅用于区分GFP（绿色）和GFP公司-和第75页^NTR公司-过度表达神经元(图6A类，黄色）。树突树的整个范围对p75呈阳性^NTR公司，在近端隔室中有更强烈的标记。定性而言，神经元过度表达全长第75页^NTR公司(图6A、 B类)与WT锥体神经元相比，树突状结构似乎没有明显改变。然而，对每个神经元的树突分支总数进行量化，结果表明，神经元顶端树突的树突复杂度显著降低第75页^NTR公司-过度表达细胞(图6C类，插图）(第页= 0.02). 基底枝晶第75页^NTR公司-表达神经元与对照细胞无明显差异(图6C类，插图）(第页= 0.86). 然后，我们使用Sholl分析详细比较了对照组和对照组心尖树突的形态第75页^NTR公司-表达神经元。降低了第75页^NTR公司-过度表达的神经元局限于顶端树突的最近端和最远端(图6C类)（重量，n个= 9;第75页^NTR公司-表达细胞，n个= 11;第页60至120μm之间和640至680μm之间的距离小于0.05）。心尖树突的长度第75页^NTR公司-表达神经元与WT神经元无显著差异(第页= 0.5).

在单独的窗口中打开

图6。

全长p75的形态^NTR公司-神经元过度表达。A类共聚焦图像显示两个表达GFP的CA1锥体神经元。右侧神经元（黄色）p75阳性^NTR公司免疫组织化学。比例尺，100μm。B类，共聚焦图像显示鼠标p75的典型示例^NTR公司-锥体神经元过度表达。比例尺，100μm。C类，Sholl分析显示小鼠p75顶端室（顶面板）的树突复杂性显著降低^NTR公司-过度表达的神经元（橙色）。p75顶端树突（顶面板）中树突复杂性降低^NTR公司-过度表达的神经元局限于顶端树突的最近端和最远端。插图显示了WT（绿色）和p75之间总树突复杂性的差异^NTR公司-过度表达的神经元（橙色）。D类，共聚焦图像的两个例子显示p75的不均匀表达^NTR公司（GFP左侧，第75页^NTR公司免疫组化和GFP覆盖，右）。树突状分支的数量似乎与p75的表达水平呈负相关^NTR公司（即，高表达区域比低表达区域复杂）（箭头之间）。比例尺，50μm。E类，直方图显示了p75中脊柱密度计数的差异^NTR公司-过度表达（橙色）与WT（绿色）神经元。显示了总脊柱密度（左）和不同树突隔室中的密度（右）。^*第页< 0.05. 误差条代表SEM。

在少数情况下，免疫组化显示p75的不均匀表达模式^NTR公司为我们提供了控制和p75^NTR公司-在同一神经元内表达树突树的部分(图6D类，箭头）(n个= 2). 在定性水平上，对p75的观察^NTR公司表达模式表明高水平p75之间有很强的相关性^NTR公司表达和降低树突复杂性(图6D类，箭头）。总之，我们对海马锥体细胞树突复杂性的分析表明p75^NTR公司过度表达降低了树突顶端分支的复杂性。

我们还分析了第75页^NTR公司-过度表达的细胞。总脊柱密度值在第75页^NTR公司-海马锥体细胞与对照细胞的过度表达(图6E类) (第75页^NTR公司-表达细胞，每微米树突0.46±0.03个棘，n个= 7; WT，0.515±0.32棘/微米树枝晶，n个= 9;第页=0.39）。然而，脊柱总密度的降低在基底树突状室最为明显第75页^NTR公司-表达细胞，与WT细胞相比达到统计学意义(第75页^NTR公司-表达细胞，0.38±0.05棘/微米树突；WT，每微米树枝晶0.63±0.03个棘，第页= 0.02). 在其他地方，脊柱密度的变化与WT对照组没有显著差异。

p75最成熟的功能之一^NTR公司是诱导各种细胞凋亡，包括发育中的神经元(Troy等人，2002年). 为了排除这一点，在我们的实验条件下，全长p75的过度表达^NTR公司将导致海马锥体细胞死亡，我们在培养基中加入碘化丙啶2-3小时，然后将其固定，以标记所有死亡或垂死的细胞。GFP标记的WT神经元以及表达全长的神经元第75页^NTR公司，清楚显示非凋亡细胞核，表明我们分析的神经元既没有死亡也没有死亡（数据未显示）。

讨论

了解分子线索如何控制树突形态与神经元活动如何转化为发育中和成年大脑中神经元的结构变化的问题具有高度相关性。在本研究中，我们证明p75^NTR公司控制器官型薄片培养的海马锥体神经元的树突形态、棘密度和棘形态。

先前的研究表明，神经营养素受体可以在发育过程中和成熟的中枢神经系统中影响神经元形态（有关综述，请参阅Bibel and Barde，2000年). 有趣的是，通过中和皮层器官型培养物中的内源性神经营养素，McAllister等人(1997)研究表明，不同的神经营养素以分层特异的方式相互对抗，以调节锥体神经元的树突状生长。因此，神经营养素似乎作为生长促进分子和生长抑制分子来调节神经元的形态发生。

发育中的皮层神经元中全长和截短TrkB亚型的过度表达分别增加了其树突的数量和长度(Yacoubian和Lo，2000年). 因此，与野生型小鼠相比，TrkB突变小鼠的皮层锥体神经元的树突更薄、更不复杂(Xu等人，2000年). 此外，Purkinje细胞和海马神经元中脊柱数量的增加被抑制TrkB信号传导所阻断(Shimada等人，1998年;Tyler和Pozzo-Miller，2001年). 总的来说，这些结果表明，正的结构变化是通过Trk受体的激活而诱导的。第75页^NTR公司也被证明可以控制神经元过程的生长。在未成熟神经元中，未被占用的p75^NTR公司通过激活RhoA负调节轴突和丝状突长度(Gehler等人，2004年)而神经营养素与p75结合^NTR公司通过减少RhoA活化刺激神经突起生长(Yamashita等人，1999年). 在成人背根神经节神经元和出生后小脑神经元中，髓鞘衍生蛋白与p75的结合^NTR公司激活RhoA，从而抑制生长(Yamashita等人，2002年). 最近的研究也表明p75具有多潜能作用^NTR公司通过减少初级树突的数量和控制Notch的细胞靶点，在海马神经元培养的发育过程中调节树突形态(Salama-Cohen等人，2005年)或通过调节TrkB-T1的丝状体促生长活性(Hartmann等人，2004年). 这些和相关的观察结果表明，p75的影响^NTR公司强烈依赖于其表达的细胞环境，并且在某些细胞条件下，它可以对抗Trk受体。

我们的结果指向p75^NTR公司作为成熟海马神经元树突复杂性的整体负调控因子。在第75页^NTR公司KO小鼠的树突复杂性在树突顶室的基底部和中远部显著增加。相反，锥体神经元全长过度表达第75页^NTR公司树突复杂性显著降低，特别是在树突顶端和基底的最近端部分。因此，尽管脊椎密度和突触接触都显示出显著增加第75页^NTR公司KO小鼠的脊椎密度在第75页^NTR公司-锥体神经元过度表达。我们的功能丧失和获得实验之间的差异证实了我们在第75页^NTR公司KO神经元，使我们描述的表型不太可能是突变小鼠中激活的代偿机制的结果。

我们的观察结果对于之前描述的活动依赖性突触可塑性与脊椎密度正负变化之间的相关性具有重要意义(Engert和Bonhoeffer，1999年;Maletic-Savatic等人，1999年;Toni等人，1999年;Nägerl等人，2004年;Zhou等人，2004年). 在这种情况下，有趣的是，长期抑郁症（LTD）在第75页^NTR公司KO小鼠，而LTP未受影响(Xu等人，2000年;Rösch等人，2005年;Woo等人，2005年). 除了脊椎数量增加外第75页^NTR公司KO神经元，脊柱形态也有显著差异，决定了脊柱类型的明显改变：第75页^NTR公司KO神经元我们发现蘑菇（II型）和薄（III型）棘的比例增加。据描述，脊柱颈部的长度和直径在分离Ca中起着重要作用²⁺母枝晶和相邻棘的瞬变（Majewska等人。，2000年，b条;Kasai等人，2003年). 此外，有证据表明脊柱上AMPA受体的数量与突触后密度的面积和脊柱头部的体积成正比(哈里斯和史蒂文斯，1989年)表明脊椎形态直接影响突触传递。有趣的是，最近有研究表明，LTD的诱导会导致树突棘的收缩(Zhou等人，2004年)与LTP后观察到的脊柱头部增大相反(松崎等人，2004年).

为了更好地证实我们在第75页^NTRIV公司KO小鼠，我们利用了第二个突变小鼠的存在，该突变小鼠的外显子III已被靶向(Lee等人，1992年)导致缺失神经营养素结合域的受体截短亚型的表达，尽管水平较低(von Schack等人，2001年). 第二个突变小鼠的分析第75页^NTR公司最近的一项研究表明p75的促凋亡片段可能^NTR公司仍然可以用第75页^NTRIV公司KO小鼠(Paul等人，2004年). 作者建议第75页^NTRIV公司KO表型可能反映p75的增加，而不是损失^NTR公司功能。对于锥体神经元的形态学分析，可以排除这种可能性，因为两者的形态学效应第75页^NTR公司突变株系相似。我们还注意到第75页^NTR公司导致相反的表型，即大量细胞丢失(Majdan等人，1997年)而且，在培养自第75页^NTRIV公司KO动物，无p75^NTR公司检测到碎片(von Schack等人，2001年). 类似于外周神经系统和内侧隔核的结果(von Schack等人，2001年;Naumann等人，2002年)，海马锥体细胞的形态在第75页^NTRIV公司突变比第75页^NTRIII公司突变。如前所述，这可能表明S-p75第75页^NTRIII公司KO小鼠部分补偿了FL-p75在第75页^NTRIV公司KO小鼠通过与p75的细胞质相互作用物相互作用^NTR公司以及Trk受体(Bibel等人，1999年;von Schack等人，2001年).

第75页^NTR公司已知在出生后早期海马锥体细胞中强烈表达，并在前2周内下调(Buck等人，1988年;Lu等人，1989年)，尽管它在P9-P14仍以可检测的水平表达(Buck等人，1988年). 这些结果与我们的观察结果一致。此外，我们还展示了第75页^NTR公司在2周龄海马器官型培养物中锥体细胞的表达表明第75页^NTR公司确实在我们的实验准备中的相关时间点和适当的细胞类型中表达。最重要的是，我们清楚地看到第75页^NTR公司CA1和CA3锥体细胞以及齿状回颗粒细胞中的表达体内直至第21页。

这就打开了p75的可能性^NTR公司受体在成人神经系统中具有急性作用。p75如何^NTR公司与细胞骨架相互作用以急性方式改变脊椎和树突形态？先前的观察结果表明p75^NTR公司控制RhoA的活性（Yamashita等人。，1999，2002)Rho GTPases参与维持锥体神经元的树突状分支和脊椎发育(Nakayama等人，2000年;Tashiro等人，2000年;Li等人，2002年). 具体来说，未占用p75^NTR公司已经证明构成性激活RhoA，从而负向调节轴突和丝状体的长度，而神经营养素的结合调节p75^NTR公司通过减少RhoA激活来实现功能(Yamashita等人，1999年;Gehler等人，2004年). 此外，p75^NTR公司也被证明可以抑制轴突生长，介导髓磷脂相关糖蛋白的负作用(Yamashita等人，2002年)和Nogo(Wang等人，2002年). 此外，Woo等人(2005)最近描述了前BDNF通过激活p75促进海马LTD的特殊功能^NTR公司然而，我们的结果不一定意味着p75的影响^NTR公司在调节海马锥体细胞形态方面是配体介导的。它们可能由细胞内机制解释，例如小GTP-结合蛋白的调节（见上文）。

总之，我们的结果为神经营养素信号双向模式在控制中枢神经系统神经元形态方面提供了新的见解。具体来说，它们表明p75的作用^NTR公司作为神经元结构变化的负调节剂，进一步强化了由两种不同的神经营养素受体类型介导的功能拮抗观点。

脚注

工具书类