哺乳动物神经营养素的不同囊泡靶向和突触分泌的时间进程

摘要

介绍

哺乳动物神经营养素（NTs）NGF、BDNF、NT-3和NT-4最初是根据它们对发育中神经元的存活和分化的影响发现的。最近，越来越多的证据表明，神经营养素在突触可塑性中起着额外的作用(Poo，2001年;卢，2003). 与有关神经营养素作用的生物下游靶点的丰富知识相比，我们对神经营养素分泌部位和机制的知识非常有限(Lessmann等人，2003年). 然而，神经营养素分泌的位置和时间进程是神经营养素在突触可塑性中发挥作用的关键决定因素。

根据ELISA测量结果，内源性BDNF是在对培养神经元进行模式化高频电刺激后分泌的（Balkowiec和Katz，2000，2002;Lever等人，2001年). 同样，过表达的NGF和BDNF已被证明在高K期从转染的神经元中释放⁺-诱导去极化(Blochl和Thoenen，1995年;Goodman等人，1996年). 最近，使用过度表达的绿色荧光蛋白（GFP）标记的BDNF，我们和其他人能够解决谷氨酸能突触处BDNF的活性依赖性突触分泌(Hartmann等人，2001年;Kojima等人，2001年).

然而，缺乏对NGF、NT-3和NT-4释放的空间和时间分辨分析。重要的是，尚不清楚这些神经递质的分泌是否发生在突触上。考虑到NT分泌在人类记忆形成和神经退行性疾病中的基本意义(Egan等人，2003年;Gauthier等人，2004年;Heese等人，2004年)，了解NT的分泌过程似乎极为重要。

BDNF已明确定位于调节分泌途径的分泌颗粒中(Haubensak等人，1998年). 然而，其他神经营养素的细胞内靶向途径仍存在争议。过度表达的NGF和NT-3被描述为靶向分泌颗粒(Blochl和Thoenen，1996年;Wu等人，2004年)或在组成型分泌途径中发现(Mowla等人，1999年;Farhadi等人，2000年). 对于NT-4，先前的一项研究建议只针对组成途径(Hibbert等人，2003年). 这些不同的发现促使我们在相同条件下评估四种哺乳动物神经营养因子的神经元靶向性和突触分泌。我们在海马神经元中过度表达GFP标记的NGF、BDNF、NT-3和NT-4，并探索其囊泡靶向性和突触释放特性。之所以选择海马神经元，是因为所有的神经干细胞都被描述为在这个大脑区域内源性表达（有关综述，请参阅Lessmann等人，2003年).

我们的结果表明，尽管效率不同，但所有神经干细胞都可以被传递到调节分泌途径的突触后颗粒：超过80%的神经元在突触去极化后，颗粒释放BDNF和NT-3，而NGF和NT-4表现出明显较少的突触靶向性（<50%）。对于所有神经干细胞，剩余的细胞显示出针对分泌组成途径的靶向性。与的比较N个-（3-三乙基氨丙基）-4-（6-（4-二乙基氨基）苯基）六三烯基）二溴吡啶鎓（FM4-64）对突触前递质囊泡的去染色显示，NT的分泌比传统的递质释放慢10倍，强烈反对NT在海马神经元中作为快速递质的作用（参见。Kafitz等人，1999年).

材料和方法

神经营养素-GFP表达载体的构建。大鼠前pro-BDNF-GFP（BDNF-GFP）的构建如前所述(Haubensak等人，1998年). 用PCR方法从编码短型NGF前体的小鼠前NFF前体pcDNA3载体构建小鼠前NFF-GFP（NGF-GFP）(Edwards等人，1988年). 设计PCR引物以引入生态RI解理部位位于5′端和a巴姆H1限制位点分别位于3′端。此外，3′引物删除了NGF终止密码子，删除了编码序列的最后两个氨基酸（RG），并将剩余的最终精氨酸突变为丙氨酸，以避免蛋白质转化酶在这些二碱基残基上切割，从而阻碍了GFP通过翻译后修饰从NGF中分离。PCR产物经生态RI和巴姆H1并连接到增强型GFP-N1（EGFP-N1）载体（英国剑桥市克朗泰克）。在这个结构中，在融合蛋白的NGF和EGFP部分之间引入了一个七氨基酸间隔区。人类前-NT-3-GFP和前-NT-4-GFP是由pBluescript中的前-NT-3（由加利福尼亚州圣地亚哥索尔克生物研究所的R.A.Murphy善意提供）和pCMX中的前-pro-NT-4（由德国波鸿鲁尔大学的P.Wahle善意提供）生成的对NGF使用类似的基于PCR的克隆策略，如上文所述，但不改变C末端序列。所有构建物的DNA测序证实没有PCR引入的突变。

细胞培养。COS7和嗜铬细胞瘤12（PC12）细胞在37°C和5%CO中生长₂在DMEM（加利福尼亚州圣地亚哥因维特罗根），补充5米米葡萄糖，1米米谷氨酰胺（Invitrogen），10米米HEPES、37.5μg/ml胰岛素、25 U/ml青霉素和25μg/ml链霉素，含有10%小牛胎血清（COS7细胞）或5%马血清和10%小牛胎儿血清（PC12细胞）。到达汇合处后，细胞按1:5（PC12）或1:10（COS7）传代。为了进行转染，将细胞以40000个细胞/cm的密度放置在未涂层的细胞培养皿（6 cm）中²（COS7）或在密度为70000个细胞/cm的聚鸟氨酸涂层[硼酸盐缓冲液中1 mg/ml，室温下4 h（RT）]盖玻片上²（第12页）。在电镀后1天进行转染。如图所示，在转染后24-48 h收集NT-GFP表达COS7细胞的上清液，用于PC12细胞纤维生长试验和Western blot试验。

海马微培养。如前所述制备分离的出生后大鼠海马微培养物(莱斯曼和休曼，1998年)稍作修改：分离出生后[出生后第0天（P0）至P2]的原代新生皮质星形胶质细胞，并在含有10%FCS的DMEM培养基中培养2-4周，直至其膨胀汇合。星形胶质细胞在DMEM/10%FCS中以每3.5 cm培养皿80000个细胞的密度传代并接种在玻璃盖玻片上，7-14天后产生直径为100-300μm的星形胶质细胞岛在体外（DIV）。将出生后的大鼠（P0-P2）海马神经元以每星状细胞岛1-10个神经元的密度放置在DMEM/10%FCS中，放置在星状细胞盖玻片上。20小时后，将电镀培养基更换为无血清培养基（添加2%B27补充剂的Neurobasic；Invitrogen）。

转染。在8-9 DIV处用Ca²⁺如上所述的磷酸盐沉淀法(Haubensak等人，1998年). 培养期间（3小时），10μ米DNQX和100μ米 d日，我-添加了APV。细胞用于转染后1-3天的实验（9-11DIV）。

如前所述，使用聚乙烯亚胺（PEI）方案用NT-GFP构建物瞬时转染COS7细胞(Boussif等人，1995年;Haubensak等人，1998年). PEI储备溶液中每毫升H含有0.9 mg PEI溶液（50%；800000 kDa；Fluka，Neu-Ulm，Germany）₂O、 使用HCl将pH调节至6.5。转染液每毫升150米含有20μg质粒DNA和60μl PEI储备米氯化钠。使用每毫升无血清DMEM转染液中相当于5μg质粒DNA的转染液进行转染。在37°C（5%CO）下孵育3小时后₂)，用正常培养基（DMEM/10%FCS）洗涤细胞，再培养2天。收集这些细胞的细胞培养上清液，并与表达TrkA和TrkB受体的转染PC12细胞孵育，以确定GFP标记的NT的纤维生长能力。用TrkB表达质粒转染PC12细胞(Klau等人，2001年)使用相同的PEI转染方法。

蛋白质印迹。转染后48 h分析NT-GFP表达COS7细胞的全细胞裂解物和培养基上清液。EGFP转染和野生型（wt）BDNF转染COS7细胞(Haubensak等人，1998年)用作对照。将等分的细胞裂解物和上清液进行SDS-PAGE，并使用标准协议转移至硝化纤维素膜（0.2μm；德国达塞尔Schleicher&Schüll BioScience）(Sambrook等人，1989年). 封闭后，将硝化纤维膜与兔抗GFP抗体（1:200；Abcam，Cambridge，UK）或与兔抗BDNF抗体（1:2000；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）在含10mL的Tris缓冲盐水中孵育（1小时，RT）米Tris/HCl，150米米氯化钠和0.05%（v/v）吐温20。用二级抗体（HRP-结合抗兔IgG；1:2000；西格玛，密苏里州圣路易斯）孵育（1小时，RT）后，根据制造商的说明，使用ECL检测试剂盒（德国布伦瑞克Amersham Biosciences）检测二级抗体的结合。

FM4-64染色。如前所述，对突触前终末进行活性依赖性标记(Klau等人，2001年;Mohrmann等人，2003年). 简言之，将带有海马神经元的盖玻片在RT条件下放入含有50 m的HEPES缓冲盐水（HBS）中培养1 min米K（K）⁺（替换等量的Na⁺)，2米米钙²⁺，1米米镁²⁺，和10μ米FM4-64（分子探针，尤金，俄勒冈州）。细胞在无染料低钾HBS中清洗四次⁺并且不含Ca²⁺并转移到倒置显微镜的记录室中。

与突触标记蛋白共转染。通过PCR方法，从大鼠VAMP cDNA质粒和PSD-95-GFP表达质粒（加州大学旧金山分校D.Bredt善意提供）中产生了Discosoma red-vesicle-associated membrane protein（DsRed-VAMP）和突触后密度-95-DsRed（PSD-95-DsRed），并克隆到EGFP-C1（VAMP）或EGFP-N1载体（PSD-95）中来自Clontech。DsRed-VAMP和PSD-95-DsRed与活性突触FM1-43的绿色荧光活性依赖标记共定位证实了这两种蛋白的完整突触靶向性[N个-（3-三乙基氨丙基）-4-（4-二丁基氨基）苯乙烯基）-二溴吡啶]在细胞中仅表达这些DsRed融合蛋白（我们未发表的观察结果）。为了分别鉴定NT-GFP表达的海马神经元的突触前和突触后结构，将细胞与相应的NT-GFP-构建物以及DsRed-VAMP或PSD-95-DsRed（DNA比率GFP:DsRed，1:1）共同转染。

免疫细胞化学。使用标准程序固定转染细胞的盖玻片（PBS中的4%甲醛）并渗透（0.1%Triton X-100）(Haubensak等人，1998年). 分泌颗粒蛋白抗体（兔子；1:200；德国德累斯顿Max-Planck-Institute of Molecular Cell Biology and Genetics，Dresden，Germany）W.Huttner善意提供）、突触蛋白I（SynI）抗体（小鼠；1:400；意大利罗马拉萨皮恩扎罗马大学L.DeGennaro善意提供）和钙连蛋白抗体（兔；1:200）；加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚州的Stressgen和GM130抗体（兔子；1:100；新泽西州富兰克林湖的BD Biosciences）在RT下孵育1小时，然后与Alexa Red-coupled抗兔二级抗体或Alexa Red-coupled-抗鼠二级抗体（均为1:1000；分子探针）孵育（RT，1小时）。使用以下多克隆羊一级抗体（RT培养24小时）进行过表达和内源性神经营养素的免疫细胞化学检测：抗BDNF（1:200）、抗NT-3（1:2000）、抗NT-4（1:200，抗NGF（1:200；均来自加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）。次级Alexa Red偶联抗羊抗体在RT培养1小时。

荧光成像。如前所述，对表观荧光信号进行可视化(Hartmann等人，2001年). 简单地说，将带有转染细胞的盖玻片转移到带对开底的Petriperm培养皿（德国汉诺威Vivascience-Sartorius）中，并使用40×[数字孔径（N.A.），1.0]和100×（N.A.，1.35）油浸物镜用倒置显微镜（IX70；纽约梅尔维尔奥林巴斯）进行检查。使用MetaView软件（宾夕法尼亚州西切斯特Universal Imaging Corporation）控制的冷却CCD相机（Sensys 1401E；PhotoMetrics，加利福尼亚州亨廷顿比奇）进行图像捕获。选择暴露时间，避免饱和。图像处理是由MetaMorph（Universal Imaging Corporation）和Adobe Photoshop（Adobe Systems，San Jose，CA）软件执行的，不会影响明显的主图像信息。然而，在图中，体细胞和近端树突中的荧光常常增强到接近饱和状态，以使远端神经突中的单个小泡也清晰可见。

共焦成像。使用Nipkow旋转盘共聚焦系统（Visitech，Sunderland，UK）评估NT与不同标记物的共定位，该系统连接到配备有高孔径浸油物镜（40×，N.a.，1.0；100×，N.a.，1.35）的常规荧光显微镜（Olympus BX51 WI）上。使用冷却CCD相机进行全帧图像捕获（CoolSnap总部；Roper Scientific，纽约州特伦顿）。绿色和红色荧光由氪/氩激光器的488和568 nm线激发（犹他州西约旦的激光物理）。

神经突DsRed和NT共定位的量化。将DsRed和相应的GFP标记NT共同转染海马神经元。转染后2天，取红色荧光图片作为神经突起面积的测量，取绿色荧光图片作为NT颗粒占据神经突起的测量。每个神经元的两张照片都由眼睛进行阈值分割，并转换为二进制图像。删除胞体面积（包括主树突；直径>3μm），计算所有神经突中两个二值图像之间的重叠百分比，并以总神经突面积的百分比表示。所有计算均使用MetaMorph软件进行。

神经营养素释放。如前所述，对GFP标记的NT的突触分泌进行实时成像(Hartmann等人，2001年). 将表达NT-GFP的海马神经元的盖玻片安装在倒置荧光显微镜的灌注室中。如有必要，可使用FM4-64染色或与DsRed-VAMP或PSD-95-DsRed共转染来观察NT-GFP囊泡簇的突触定位。在整个实验过程中，将具有突触定位NT-GFP的细胞与HBS局部混合，并分别每隔5秒或10秒拍摄图像。在5分钟的控制期后，细胞通过50 m的超极化作用去极化5分钟米K（K）⁺-RT处含有HBS。对含有NT-GFP突触簇的区域随时间变化的细胞内荧光强度进行分析。平行记录并减去同一视野中空白区域的背景荧光水平。通过对整个记录时间内初始5 min控制期内的荧光下降进行单指数外推，校正了由光漂白引起的荧光下降。原始荧光值除以该漂白曲线的相应值，从而提供由释放引起的荧光降低的测量。这种荧光减少以前已经被证明反映了NT的释放(Hartmann等人，2001年). 在莫能菌素的实验中，对莫能菌肽应用期间的光漂白进行了推断和补偿，如上所述。

在1μ米TTX和标称Ca²⁺-游离HBS以排除自发调节分泌的观察。曝光时间和激发光强度被最小化，以消除光漂白。在连续输注含TTX的钙10分钟期间，记录荧光强度的变化²⁺游离HBS。组成性分泌NT的量被确定为观察10分钟内荧光强度下降的百分比。记录结束时，50米米用正常HBS中的KCl检测同一细胞中的调节分泌。

PC12纤维生长试验。PC12细胞表达NGF的TrkA酪氨酸激酶受体，并在Trk信号激活时显示纤维生长(Tischler等人，1978年). 为了测试TrkB配体依赖性纤维的生长，将镀在玻璃盖玻片上的PC12细胞与TrkB共转染。FL和GFP（重量TrkB:GFP，3:1）(Klau等人，2001年). 转染后一天，分别以100 ng/ml的浓度添加重组人（rh）BDNF、NGF或NT-4（均来自以色列耶路撒冷Alamone实验室）。或者，按照所示稀释度添加表达不同NT-GFP的COS细胞上清液。四天后，测定转染细胞（通过GFP共表达鉴定）中纤维长度超过其各自胞体直径的百分比。

试剂。从Alamone实验室购买重组人NT。莫能新来自西格玛。

结果

GFP标记的神经营养素被正确处理并保持生物活性

为了追踪所有哺乳动物神经营养素的时间分辨突触分泌，我们构建了BDNF的GFP融合构建物(Haubensak等人，1998年)、NGF、NT-3和NT-4（参见材料和方法）。在COS7细胞中表达后，在COS细胞裂解物的抗GFP Western blot中检测到相应的前-NT(图1A类). 转染两天后，发现COS细胞上清液中主要含有所有四种神经营养素的加工和随后释放的成熟形式。检测到的各个前-NT及其成熟对应物的分子量（MWs）与生成的融合蛋白的预期大小（mNGF-GFP前体，57 kDa；成熟mNGF--GFP，43 kDa，hNT-4-GFP前体，53 kDa和44 kDa（成熟）；hNT-3-GFP，59kDa（前体）和43kDa；rBDNF-GFP、58kDa（前体）和43kDa（成熟）；仅GFP标签的MW，29 kDa）。COS细胞上清液中分泌的成熟NT的生物活性通过PC12细胞中的纤维生长试验测定（见材料和方法）。在过度表达TrkB受体的PC12细胞中，TrkB配体BDNF-GFP和来源于COS细胞上清液的NT-4-GFP分别诱导纤维生长，其程度与100 ng/ml重组BDNF和NT-4相似。同样，COS细胞衍生的NGF-GFP通过内源性表达的TrkA NGF受体支持PC12细胞纤维的生长（所有GFP标记的NT与EGFP对照组相比有显著差异第页< 0.01; 所有上清液与各自的重组因子没有显著差异第页> 0.1) (图1B、 C类). 在这些实验中，NT-3-GFP（已知在较高浓度下可激活TrkA和TrkB受体）也诱导纤维生长，尽管这种作用没有达到显著水平。总之，这些结果表明，所有GFP标记的NT都能被哺乳动物细胞的分泌机制有效处理，并能有效结合和激活Trk激酶受体。因此，神经管的生理功能似乎主要不受GFP延长的影响。

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图1。

GFP标记神经营养素的完整加工和生物功能。GFP标记的NT在COS7细胞中表达，转染后2天分析细胞裂解物和上清液。A类，Anti-GFP Western blot显示NT前体在细胞裂解物中占主导地位（顶部，箭头，与其他NT相比分子量更低的NT-4前体），以及在COS细胞上清液中正确处理的成熟NT（底部，箭头）。左侧的水平标记表示GFP的位置。B类NT-分别通过过度表达的TrkB和内源性表达的TrkA受体诱导PC12细胞的纤维生长。用TrkB和GFP质粒在1 DIV条件下共同转染PC12细胞，并用分别过度表达GFP标记的BDNF、NGF、NT-3、NT-4或wt-GFP的COS细胞上清液培养3 d，或用rhBDNF培养。C类，与COS细胞上清液和重组（rec.）神经营养素孵育3d后，定量NT-诱导的PC12细胞纤维生长。^**与所有NT有显著不同第页< 0.01.D类分别表达wt BDNF和BDNF-GFP的COS细胞和人重组BDNF的抗-BDNF Western blot。印迹表明，用于E类.E类、上清液PC12细胞纤维生长测定和重组BDNF分析D类.^*与EGFP显著不同第页< 0.01. 数据输入C类和E类每个实验中来自100个以上的细胞，每个条件下来自两个以上的独立制剂。误差条代表SE。

为了进一步量化BDNF-GFP与wt-BDNF激活TrkB的相对效力，在生长测定中分别测试了等量的BDNF-GFP和wt-BDNF：发现分别过表达BDNF-GFP和wt-BDNF的COS细胞上清液中含有相当量的BDNF，通过抗BDNF蛋白质印迹估计(图1D类). 从中可以明显看出图1E类BDNF-GFP和wt-BDNF的系列稀释液显示出相似的诱导纤维外生长的效力，表明wt-BDNF和BDNF-GFF在结合和激活TrkB受体方面具有相似的亲和力。

神经营养素在海马神经元中的表达模式

众所周知，海马神经元内源性表达所有四种哺乳动物神经干细胞，因此被认为具有处理、靶向和分泌这些蛋白质的能力(Korsching等人，1985年; Ernfors等人。，1990，1992;Hofer等人，1990年;Maisonpierre等人，1990年;周和拉什，1994;Friedman等人，1998年;Lessmann等人，2003年). 为了能够在相同条件下直接比较不同NT的亚细胞靶向性，我们在大鼠海马神经元的姊妹培养物中表达了四个GFP标记的NT。转染后两天（即10 DIV时），通过外荧光显微镜在活神经元中观察到亚细胞靶向(图2). 三分之一的转染神经元（无论是何种NT）在整个细胞内，包括所有突起和细胞核，都显示出均匀明亮的荧光（数据未显示）。由于缺乏任何可见的靶向性，这些细胞被排除在分析之外。仅对细胞内呈现斑片状GFP荧光的细胞进行了进一步分析，其中不包括细胞核。这些神经元可分为两组：（1）远端表达子，显示囊泡靶向远端轴突[即，距胞体>30μm（比较图2)]或（2）近端表达者，显示荧光点主要保留在胞体中，从而保留远端轴突，但在树突中显示弥漫性GFP信号(图2A类). 虽然BDNF-GFP和NT-3-GFP在大多数神经元的树突中显示出远端囊泡靶向性（BDNF-GFF，98±2%；NT-3-GPP，85±8%），但NGF-GFP和NT-4-GFP的远端囊泡靶标性观察较少（NGF，43±10%；NT-4，26±6%；两者与BDNF-GFP和NT3-GFP均存在显著差异第页< 0.01). 由于具有微弱树突状GFP信号的远端囊泡和近端表达对任何给定细胞来说都是事实上唯一的现象，因此将这两个单独的组分为两组与观察到的表达模式相匹配，而不是计算所有细胞上囊泡的平均树突状共定位。我们将BDNF-GFP或NT-4-GFP与可溶性DsRed共表达的实验证实了这两个组的存在，并量化了NT小泡覆盖的树突状区域的百分比（由Ds Red荧光指示）(图2C类). 在这项分析中，两个NT明确显示了两个可区分的组。远端囊泡靶向的BDNF-GFP神经元与DsRed的共定位率为16.5±1.2%（NT4-GFP，12.5±0.7%）（范围为10.6-21.0%），而与DsRed的重叠率为3.3±0.5%（NT-4-GFP，3.2±0.6%；范围为1.0-5.4%）（对于显示BDNF-GFF或NT-4-GPP近端表达的神经元）。远端表达者与近端表达者的树突定位差异非常显著(第页< 10^-7;n个=29个单元格）。NT-3和NGF也观察到类似结果（数据未显示）。

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图2。

海马神经元中神经营养素的差异性囊泡靶向性。A类，在8DIV处用GFP标记的神经营养因子转染海马神经元，转染后2d进行分析。虽然BDNF和NT-3主要存在于体细胞和远端树突的小泡中（即远端小泡靶向），但NGF和NT-4通常保留在体细胞的小泡结构中，并在树突中显示微弱的GFP信号（即近端靶向）。这是一种细胞特有的现象。B类，量化远端树突中囊泡靶向转染海马神经元的百分比。^*与BDNF-GFP和NT-3-GFP显著不同第页< 0.001. 靶向来自n个对每种构建物分析≥8种独立制剂。C类，用DsRed共转染BDNF-GFP和NT-4-GFP以定量树突靶向。左柱，典型的BDNF-GFP表达细胞，显示远端囊泡表达。右栏，显示近端靶向的典型NT-4-GFP表达子。合并的图片显示了被GFP标记的NT覆盖的各个树突的百分比（即BDNF细胞为12%，NT-4细胞为4%；参见材料和方法）。D类，GFP标记的BDNF和NT-4树突中DsRed共定位的量化。步骤（如中所述C类)显示出显著不同(第页< 10^-6)两个NT的远端囊泡和近端表达者的树突状定位值。误差条代表SE。

总之，这些结果表明，大量神经元亚群缺乏将NGF和NT-4小泡分类为远端树突的能力，而绝大多数BDNF和NT-3表达子显示远端小泡靶向性。然而，所有神经管都可以分别观察到远端和近端的表达模式（比较图2D类). 用抗GABA神经元标记物GAD67的抗体进行的免疫细胞化学染色显示，远端囊泡或近端表达模式与GABA表达之间没有相关性。

为了研究GFP标签是否影响靶向模式，我们进行了实验，将所有未标记的NTs版本与野生型GFP一起表达，以鉴定转染的神经元。在这些细胞中，免疫细胞化学检测再次显示，与NGF和NT-4相比，BDNF和NT-3的靶向性更强（参见补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). BDNF和NT-4远端与近端表达子的分析显示，与GFP标记的对应物相比，存在数量差异。

使用相同的抗体，我们还试图观察海马神经元内生表达的NT。然而，大量表达的BDNF以前可以在许多神经元的树突中检测到点状染色（参见。Haubensak等人，1998年;Swanwick等人，2004年)NT-3、NT-4和NGF在我们的海马培养物中很少表达。由于树突中的低信噪比，不能安全地将近端表达者与显示非特定背景荧光的细胞区分开来，而远端囊泡表达者可以清楚地识别出来（参见补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 因此，对内源性表达NTs的远端与近端靶向进行定量分析是不可行的。

重要的是，这些未标记神经干细胞和内源性表达神经干细胞的结果清楚地表明，所有神经干细胞至少在某种程度上显示了远端囊泡靶向性，这是海马神经元中所有神经干的生理分类模式。

因为我们的结果表明神经干细胞存在细胞特异性差异分类，所以我们认为在克隆大鼠神经元细胞系中，靶向性的细胞特异性变化应该可以忽略不计。因此，我们在大鼠PC12细胞系中表达所有GFP标记的NT，通过添加NGF（100 ng/ml，持续7天）将其分化为嗜铬样神经元(蒂施勒和格林，1978年). 在这些条件下，所有NT以同样高的效率（70-90%）分拣到靶向远端突起的囊泡中（对比补充图3A类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 因此，PC12细胞在所有NT中的行为与在海马神经元中观察到的远端表达类似。有趣的是，未分化的PC12细胞（已知靶向NTs的构成通路，因为在这些条件下，调控通路没有很好的发育）(Nomoto等人，2000年)显示了所有GFP标记的NT在整个细胞中的扩散表达（参见补充图3B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料)类似于近端表达的弥漫性GFP信号。这证实了这样一种观点，即观察到的NT排序由给定细胞的个体靶向能力决定，并且这种能力可以改变（例如，随着细胞分化）。

神经营养素在内质网、高尔基体和分泌颗粒之间的分配

我们用内质网（ER）和高尔基体标记物对神经元进行免疫细胞化学标记，进一步表征了远端和近端的表达模式。作为内质网标记物，我们选择了一种针对内质网跨膜伴侣calnexin的抗体，该抗体有助于目的地为高尔基体的糖基化蛋白（如NTs）的折叠，此前已经证明，该抗体可以在海马神经元的胞体和树突中染色粗糙和光滑的内质网(Krijnse Locker等人，1995年;Weclewicz等人，1998年;Horton和Ehlers，2003年). 显示近端表达模式的细胞显示，细胞体中calnexin和相应的NT明显共定位，树突中弥漫的NT信号经calnexiin染色进一步共定位(图3E、 F类). 虽然远端表达子与胞体中的ER标记显示类似的共定位，但远端NT小泡没有calnexin免疫反应。在近端表达者中与calnexin共定位的弥漫NT信号在远端表达者中基本上不存在(图3A至D). 这些数据表明，在树突中，近端表达者至少部分保留了ER衍生结构中表达的NT，而在远端表达者中，在这个过程中到达了ER后腔室。

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图3。

用ER标记物calnexin对神经营养素进行克隆化。将GFP标记的NT在8DIV处转染海马神经元，并用针对10DIV处一般ER标记物calnexin的抗体进行免疫染色A-F公司，对于相同的视场，显示了GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光calnexin染色（中）和两个荧光通道的合并图片（右）。A类，BDNF-GFP表达的远端囊泡表达者的典型结果。B类，装箱区域A类放大倍率更高。C类，D类，NT-4-GFP表达，显示远端囊泡定位（23%的细胞）。E类，F类表达NT-4-GFP的神经元具有近端定位模式（77%的细胞）。注意，远端囊泡表达子显示树突中NTs与ER标记物的共定位有限(A至D)，而近端表达者树突中的NT信号在树突ER中积累(E类，F类).

已知用于调节分泌途径的蛋白质会通过高尔基体室并积聚在分泌颗粒中(Halban和Irminger，1994年). 因此，我们用针对高尔基体标记物GM130的抗体对我们的细胞进行染色，之前已经证明该标记物与海马神经元中的分泌蛋白部分共定位(Horton和Ehlers，2003年). 有趣的是，GM130在近端和远端表达体中与GFP标记的NT部分共定位(图4). 在树突中，很少有GM130阳性小泡染色，仅在远端表达者中很少与NT小泡共定位。重要的是，远端和近端表达者中GM130阳性小泡的频率相同。这些结果表明，高尔基体细胞的GM130阳性部分集中在胞体中，并且在两种类型的表达子中的NT都能到达。

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图4。

高尔基体标记物GM130对神经营养素的克隆化。海马神经元，如图3，在10 DIV用针对高尔基体标记物GM130的抗体进行免疫染色。A-G公司显示GFP（绿色）和GM130（红色）荧光的共焦图像。A类，B类，BDNF-GFP表达细胞显示远端囊泡表达（98%的BDNF细胞）。C类，D类，NT-4表达神经元显示远端囊泡定位（23%的NT-4细胞）。E类高倍镜下，远端囊泡表达者（46%的NGF细胞）中的NGF-GFP。F类，G公司，NT-4表达神经元显示近端定位，周围有微弱的NT信号。注意，远端和近端表达者在胞体中与高尔基体标记物显示出明显的共定位。

鉴于远端囊泡表达者树突中的大多数NT-GFP标记结构既没有与ER标记calnexin也没有与高尔基体标记GM130共定位，因此出现了GFP标记的NT在这些细胞树突中占据哪个细胞室的问题。如分泌颗粒标记物分泌粒蛋白II（SgII）抗体的免疫荧光染色所示(Huttner等人，1991年;Halban和Irminger，1994年;小泽和高田，1995年)，远端囊泡表型对应于将相应的NT靶向调节分泌途径的囊泡(图5E-I公司). 有趣的是，SgII和NT在远端和近端表达者的胞体中共定位，表明SgII小泡在两组细胞中都能到达。因此，与BDNF和NT-3相比，NGF和NT-4的近端表达模式反映出含NGF-和NT-4分泌颗粒靶向远端树突的效率较低。

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图5。

神经营养因子与分泌调节蛋白II的共定位。在8DIV处转染海马神经元和相应的NT，并在2天后用针对SgII的抗体进行免疫染色。在A-I公司图中显示了相同视野下GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光SgII（中）以及两个荧光通道的合并图像（右）。A至D，近端表达子的典型示例（此处为NT3-GFP和NT-4-GFP）。白色方框输入A类和C类以更高的放大倍数显示B类和D类注意到NT信号与树突中的分泌颗粒标记物没有共同定位，尽管这些神经元在其树突中明显具有分泌颗粒。E-I公司，远端表达者中树突状SgII信号的NTs染色。E类，低倍镜下BDNF-GFP表达神经元。装箱区域如所示F类放大倍率更高。G-I公司，高倍下其他NT的SgII共定位示例。注意，树突状NT信号与远端表达的所有NT的分泌颗粒标记物明显共定位。

为了探索前pro序列在将NT定向到远端树突中的作用，我们开发了一种cDNA构建，将BDNF的前pro结构域融合到NT-4的成熟部分。有趣的是，BDNF前pro结构域靶向NT-4的调控途径比观察到的wt-NT-4更有效（前pro-BDNF-NT-4-GFP与具有第页< 0.05) (图6)和BDNF-GFP和NT-3-GFP几乎一样有效。然而，BDNF的前原结构域单独与GFP融合并不足以达到调控途径(图6B类). 这些数据表明，BDNF的前原结构域包含囊泡靶向的重要决定因素，但也表明需要在神经干成熟部分进行额外的靶向序列。

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图6。

BDNF的前原结构域将NT-4导向分泌颗粒。在8DIV处用GFP标记的NT或NT结构域转染海马神经元，转染后2d进行分析。A类将BDNF的前原结构域融合到NT-4的成熟部分，改变了NT-4的定位模式，产生更多具有远端囊泡靶向性的神经元。B类，所指示的蛋白质的靶向的定量。ppB-GFP，用GFP标记的BDNF的分离前原结构域。^*与NT-4-GFP显著不同第页< 0.05. 靶向来自n个对每种构建物分析≥3种独立制剂。误差条代表SE。

神经营养素的突触靶向性

在接下来的一系列实验中，我们询问在所有NT的远端表达子中发现的树突状小泡是否以突触为靶点。因此，我们用谷氨酸突触后标记物PSD-95-DsRed对每一个GFP标记的NT进行了共转染实验。如所示图7发现所有神经元的囊泡簇与同一神经元中表达的PSD-95-DsRed共定位。此外，突触前终末附近可以发现转染神经元的树突状NT囊泡簇，这是用针对一般突触前标记物SynI的抗体进行免疫细胞化学标记所揭示的(图8). 在与DsRed VAMP共转染的培养物中，观察到树突GFP标记的NT和突触前VAMP的类似并置(图9D类). 总之，这些结果表明，对于所有哺乳动物的神经干细胞，含神经干细胞的分泌囊泡在突触后靶向谷氨酸能突触。这种突触后树突状靶向与所有四个GFP标记的NT与树突状标记物微管相关蛋白2的显著共定位一致（数据未显示）。最后，我们想确定NT囊泡簇附近的突触位置是否代表活跃的突触。因此，我们用FM4-64对突触前终末进行活性依赖性活染色(Cochilla等人，1999年)显示了含NT的分泌颗粒和FM4-64标记的活动性突触前终末的邻近定位（补充图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).

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图7。

GFP标记的NT和PSD-95-DsRed在同一细胞中共表达后的染色。在8DIV条件下，用GFP标记的NT和PSD-95-DsRed（DNA比率，1:1）共同转染海马神经元，转染后2d对细胞进行分析。仅显示具有远端囊泡靶向性的细胞。在A-E公司图中显示了相同视野下GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光PSD-95（中）和两个荧光通道的合并图像（右）。A类，低倍镜下BDNF-GFP表达神经元。白色框如所示B类放大倍率更高。C-E公司，高倍下其他NT的PSD-95共定位示例。注意NT囊泡簇与PSD-95-DsRed的共定位，表明所有NT都靶向远端囊泡表达者谷氨酸能突触的突触后结构。

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图8。

GFP标记的NT囊泡簇和突触前标记物突触素I的邻近定位。在8 DIV处用相应的NT转染海马神经元，并在2天后用针对突触前标志蛋白SynI的抗体进行固定和免疫染色。仅显示具有远端囊泡靶向性的细胞。在A-E公司图中显示了相同视野下GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光SynI（中）和两个荧光通道的合并图像（右）。A类低倍镜下NT-4-GFP表达神经元。白色框如所示B类放大倍率更高。C-E公司，在高倍率下对其他NT进行SynI染色的实例。注意树突状NT小泡簇和突触前标记的明显邻近定位，表明所有NT的突触后定位。

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图9。

所有四种哺乳动物NT的突触分泌。海马神经元在8 DIV时与相应的GFP标记的NT和PSD-95-DsRed共同转染(A-C公司)或DsRed-VAMP(D类). 在10 DIV时，选择与共表达突触标记共定位的树突状NT囊泡簇，进行去极化诱导（50 m）的延时视频记录米K（K）⁺，5分钟）NT分泌。在A至D，左边的图片显示突触标记（红色）和相应的GFP标记NT（绿色）的共定位（黄色）。黑白系列图片显示了延时记录过程中指定时间点的GFP信号。用紫色标记的区域表示所分析的突触NT簇。右边的图表显示了与左边所示相同细胞的平均GFP荧光强度随时间的分析。箭头表示50米的起点米K（K）⁺-诱导去极化。虚线水平线将控制期间的荧光变化外推到以后的时间点（见材料和方法）。误差条指示平均值超过的SEn个每个细胞≥3个区域。注意所有四种哺乳动物神经管的突触分泌。初始荧光增加D类表明GFP荧光不受小泡中pH值增加的影响，在表达BDNF-GFP或NT-3-GFP的细胞中经常观察到（见结果）。刺激。，刺激。

神经营养素的分泌

接下来，我们询问NGF、NT-3和NT-4是否可以在谷氨酸能突触处分泌。因此，我们将GFP标记的NT与突触标记物（PSD-95-DsRed或DsRed-VAMP）共表达，并通过细胞内GFP荧光强度的降低来监测分泌(Hartmann等人，2001年). 突触定位的NT囊泡簇通过涂抹50 m去极化米K（K）⁺（替换等量的Na⁺)在细胞外溶液中。经电生理记录证实，应用这种升高的K⁺5分钟的溶液可逆地使神经元去极化至-25至-30 mV的膜电位（数据未显示）。在整个实验过程中，细胞被层流的细胞外溶液连续地过度灌注，以实现释放肽的快速清除。从中的结果可以明显看出图9，每一个NTs都被突触释放以响应这种去极化。荧光强度的变化在去极化开始后的前10-30秒内变得明显。在BDNF和NT-3的情况下，荧光强度的短暂升高通常先于荧光强度的降低（见图。​图9D类，9D类，11C、 D类). 先前已经证明，这种最初的荧光增强是由于在融合孔开放的情况下中和囊内pH值后，分泌颗粒中的GFP荧光减弱，从而增加(Han等人，1999年;Barg等人，2002年)（见下文）。这种去极化诱导的GFP荧光增加在NT-4和NGF中观察到的频率较低。

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图11。

NT分泌对K反应的不同时间进程⁺-诱导去极化。A至D，平均去极化诱导（50 m米K（K）⁺)显示的NT（NT-4，6个细胞；NGF，4个细胞；NT-3，8个细胞；BDNF，5个细胞）的荧光减弱。误差条代表SE。垂直线表示去极化的开始。每个图中的顶部曲线表示阴性对照的平均荧光强度(n个=3个单元格；无K的BDNF-GFP和NT-3-GFP表达子⁺-诱导去极化）。星号C类和D类表示GFP不抑制引起的荧光增强。E类，平均(n个=3个细胞；>分析每个电池50个端子）去极化诱导的时间过程（50 m米K（K）⁺)释放FM4-64染色的突触前终末。与中相同的刺激条件A至D。顶部曲线表示未模拟的阴性对照。F类GFP标记的NT和FM4-64的归一化荧光下降。平均值超过n个每种情况下≥3个细胞。只选择没有初始GFP抑制的细胞。注意半最大分泌的不同时间点（灰色圆圈），代表化合物释放的初始速度。相对，相对；刺激。，刺激。

我们还对海马神经元的结构性分泌物进行了延时视频记录。在控制条件下（4 m米K（K）⁺, 1 μ米TTX阻断自发动作电位；0米米钙²⁺阻止Ca²⁺流入）。选择体细胞和树突区域，分别在NT-3转染的远端表达器和NGF转染的近端表达器中观察组成型释放(图10). 表达可溶性GFP的细胞作为阴性对照。在对照灌注的10分钟内，近端表达者的荧光强度下降了9.1±1.3%，而远端表达者为2.1±2.3%，GFP对照组为-0.3±1.6%第页<0.02和GFP控制第页< 0.0005). 因此，近端（而非远端）表达子揭示了GFP标记NT的重要部分，其通过分泌组成途径释放。有趣的是，随后远端表达子的去极化显示了近端表达子不存在的调节分泌(图10). 这些结果表明，近端表达模式反映了NTs对分泌组成途径的靶向性，而远端囊泡表达模式表明有效靶向调节分泌途径。

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图10。

近端表达子显示结构性分泌。转染海马神经元图9.A类NGF-GFP近端表达者、NT-3-GFP远端表达者和GFP对照的GFP荧光。在用对照溶液（0 m米钙²⁺, 1 μ米TTX）。B类，两个NT表达细胞分泌NT的时间进程A类在10分钟的对照灌注期间（-600至0秒），随后用50米去极化米K（K）⁺存在2 m米细胞外钙²⁺（无TTX）。请注意，近端表达物（NGF-GFP；红色括号）中细胞内NT荧光明显丢失，并且该神经元中缺乏调节分泌。相反，远端表达子（NT-3-GFP；绿色括号）显示无可比较的组成性分泌，但NT.rel.，Relative的调节性释放。C类中确定的本构释放量化B类用于近端(n个=15个细胞）和远端(n个=6）表达者。近端表达子显示出比远端表达子更多的组成性分泌(^*第页< 0.02). 误差条代表SE。

神经营养素突触分泌的慢时程

进一步分析了通过调节通路释放突触NT的时间进程。平均而言(图11)在50 m刺激5 min期间，四个NTs的荧光强度损失为12-21%米K（K）⁺。由于使用较短成像间隔（即300 ms）的初始实验未能揭示任何更快的释放成分，因此在所有后续实验中，成像间隔与观察到的释放时间过程（即5 s间隔）相匹配。荧光衰减可以用单指数函数拟合，NT-4的时间常数为121±29 s(n个=6个细胞），NGF为198±16 s(n个=4），NT-3为214±30秒(n个=8），BDNF为307±78 s(n个=5），分别（NT-4与NT-3和BDNF显著不同第页< 0.05). 这些结果揭示了不同哺乳动物NT分泌速度的显著异质性，以及与其他NT相比NT-4的释放更快。

我们使用亲脂性染料FM4-64来测定在相同刺激条件下常规递质的突触前释放。突触前终末FM去训练的时间过程已经被证明是一种可靠的相对测量递质小泡胞吐平均速度的方法(Cochilla等人，1999年). 如前所示，高K⁺-在我们的实验中，FM4-64的诱导释放显示分泌开始于<5s，并且释放以13±2s的单指数衰减时间常数进行(n个=3个单元格）(图11E类)刺激50秒后，初始荧光强度损失40%。因此，与释放速度最快的神经营养素（NT-4，开始，10-30 s，τ=121±29 s；FM4-64，开始，<5 s，τ》=13±2 s）相比，开始的延迟和递质分泌的时间进程大约快5到10倍。为了能够直接比较分泌时间过程，而不考虑释放物质的绝对量，我们分别对FM4-64-和NT-GFP-分泌细胞荧光强度的平均变化进行了标准化(图11F类). 为了排除GFP在该分析中对BDNF和NT-3释放时间过程的扭曲，只选择那些在去极化过程中没有显示初始荧光增加的细胞（比较图9D类). 在该分析中，荧光变化的初始斜率是囊泡融合概率的度量，近似为半衰减时间（即荧光减少50%的时间点），FM4-64产生10±2 s，相比之下，NT-4是最快的神经营养素，其值为75±12 s，其他三个NT的值甚至更高（NT-3，140±29 s；NGF，81±6 s；BDNF，228±44 s）(图11F类，灰色圆圈）。该分析表明，分泌速度最快的NT的速度至少比释放发射器的速度慢7倍（半衰减时间；NT-4为75±18 s，而FM4-64为10±2 s）。

以前已经证明，肽核的溶解作用可以决定性地决定分泌颗粒的蛋白质分泌速度，颗粒内pH值的中和是肽溶解的关键因素(Aspinwall等人，1997年;Han等人，1999年;Barg等人，2002年). 因此，我们认为NT分泌速度的异质性可以反映出含有不同NT的分泌颗粒中pH-依赖性肽缩合的不同程度。为了使所有神经管的溶解速度相似，我们用4μ米莫能菌素，已知可中和粒内pH值(Han等人，1999年). 从中可以明显看出图12对于BDNF-GFP，这种处理产生了预期的荧光强度增加，这是由依赖于pH的GFP荧光不受抑制引起的。其他神经管也观察到类似的荧光变化（比较图13). 在达到荧光强度的稳定水平后，我们通过切换到50 m来激发释放米K（K）⁺解决方案。这导致荧光强度在没有任何额外瞬时升高的情况下（15个细胞中的15个）快速降低。重要的是，在颗粒释放前中和的这些条件下，所有NTs显示出几乎相同的分泌时间过程，在无莫能菌素的情况下，其分泌速度快于NT-4的释放（所有NTs的开始时间为10-20秒；τ（BDNF）=81±22秒；τ（NGF）=76±29秒；τ（NT-3）=92±23秒；τ（NT-4）=59±16 s）（对比图。​图11，11，​,13).13). 此外，释放时间过程的初始斜率（根据半衰减时间估算）现在接近所有NT的类似值（半衰减；BDNF，52±14 s；NGF，39±13 s；NT-3，51±13 s，NT-4，37±12 s）。然而，通过NT核的释放前溶解来实现的NT分泌的最大速度仍然比用FM4-64测量的递质分泌慢四到五倍（半衰变时间，10±2 s）。这些数据部分解释了生理条件下神经管释放时间慢10倍的原因(图11).

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图12。

去极化前莫能菌素对分泌颗粒pH值的中和作用加速了BDNF的释放。在8DIV处用GFP标记的NT转染海马神经元，转染后2d用于分泌A类，BDNF-GFP表达神经元。B类，中标记框的时间序列A类放大倍率更高。C类，中标记区域的荧光强度分析B类注意，使用莫能菌素（4μ米)中和先前酸性颗粒中的pH值。字母a-e表示中所示的图片B类注意BDNF分泌的更快时间过程（比较图11)K后缺乏GFP抑制⁺-诱导去极化。相对，相对；刺激。，刺激。误差条代表SE。

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图13。

莫能菌素中和粒内pH后NT分泌的平均时间过程。A至D，表达不同GFP标记NT的海马神经元按图9莫能新（4μ米)-在随后的去极化过程中，观察到所有神经管的诱导荧光增强和释放时间进程加速（比较图11). τ值表示单指数拟合曲线的结果n个每个NT≥4个单元。E类，归一化平均去极化诱导（50 m米K（K）⁺)与莫能菌素预孵育后，显示的神经干细胞的荧光降低，而FM4-64对突触小泡的去染色则分别降低。垂直线表示去极化开始。平均值超过n个每种情况下≥4个细胞。F类，中的装箱区域E类在扩展的时间范围内。请注意，在这些条件下，所有NT的半衰变时间（灰色圆圈）相似，但FM4-64从突触小泡释放的速度仍明显加快。刺激。，刺激。误差条代表SE。

总的来说，我们的数据表明，一旦靶向谷氨酸能突触的突触定位分泌颗粒，每一个NT都可以在这些突触处释放出来，并具有活性和缓慢的时间过程，这是肽分泌的典型特征，与NT的快速传递类作用不相容（参见。Kafitz等人，1999年). 此外，我们的数据表明，NT分泌的速度严重依赖于分泌颗粒内NT核的pH依赖性溶解。

讨论

这是第一项证明谷氨酸能突触分泌NT-3、NT-4和NGF的研究。使用GFP标记的神经干细胞，我们显示靶向调节分泌途径的颗粒，以及来自远端树突的所有神经干细胞的活性依赖性突触释放。然而，虽然BDNF和NT-3注定要在大多数神经元中调节突触分泌，但NGF和NT-4在许多细胞中是针对组成通路的。因此，观察不同神经管突触分泌调节的可能性取决于特定细胞将相应肽定位于树突状分泌颗粒的能力。一旦NT到达这个隔室，活动依赖性突触分泌就得到保证。此外，所有神经管突触分泌的时间进程比传统的递质分泌慢10倍。

脚注

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