新皮质突触后稳态可塑性的突触后表达

摘要

介绍

在发展和学习过程中，突触连接通过许多依赖活动的过程进行调整和完善。除了Hebbian可塑性，还需要稳态可塑性形式来保持神经元或网络活动在功能范围内(米勒，1996年;Marder和Prinz，2002年;Turrigiano和Nelson，2004年). 稳态突触可塑性已在多种生物体和系统中得到确认，并且似乎是一种非常普遍的现象(Davis和Bezprozvanny，2001年;Burrone和Murthy，2003年;Turrigiano和Nelson，2004年). 尽管关于中枢突触稳态突触可塑性的文献越来越多，但其表达机制（突触前、突触后或两者）仍不完全清楚。

原则上，突触强度可以通过突触后受体积累、突触前释放概率、神经元对之间功能性突触接触的数量或同时改变这三种机制来改变。在中枢神经元中，许多研究发现量子谷氨酸能电流的振幅（而不是频率）是由神经元活动的改变双向调节的(O'Brien等人，1998年;Turrigiano等人，1998年;Ju等人，2004年). 这些变化正是稳定放电的正确方向，因为降低活性[使用谷氨酸受体（GluR）阻滞剂或TTX]会增加量子振幅，而增加活性（通常通过阻断抑制）会降低量子振幅。兴奋性突触传递的变化伴随着突触后对谷氨酸敏感性的变化(O'Brien等人，1998年;Turrigiano等人，1998年)和表面AMPA受体（AMPAR）积累(Lissin等人，1998年;O'Brien等人，1998年)这表明突触后对稳态突触可塑性有重要贡献。相比之下，其他研究发现量子振幅几乎没有变化，但发现微型EPSC（mEPSC）频率增加(Bacci等人，2001年;Thiagarajan等人，2002年). mEPSC频率的增加被认为是由于突触前释放概率增加所致，这一解释得到了以下观察结果的支持：N个-海马培养物中的（3-三乙基氨丙基）-4-[4-（二丁胺基）苯乙烯基]二溴吡啶（FM1-43）在活动阻断后增加(Murthy等人，2001年).

稳态可塑性的表达位点具有重要的功能意义。突触前释放概率的变化将深刻影响短期突触可塑性(Zucker和Regehr，2002年)而这些突触传递动力学的变化反过来又会改变中央电路中的信息流(Abbott等人，1997年;Markram等人，1998年). 相反，受体积累的突触后变化可以使突触后活动正常化，而不会影响突触传递的短期动力学。迄今为止，还没有关于中枢突触的研究对同一制剂中突触前和突触后的功能以及稳态可塑性对短期突触动力学的影响进行过检测。

在这里，我们使用培养的新皮质神经元，在7-10天后，详细研究了活动阻断对突触间隙两侧突触传递的影响体外（DIV）。在TTX治疗2天后，我们无法检测到显著的突触前变化。相反，1或2天的活动阻断显著增加了单个神经元中天然AMPAR或增强绿色荧光蛋白（EGFP）标记的GluR2的突触积累。此外，通过TTX敏感钠通道增强树突状AMPA电流通过活性阻断而增加。我们的结果表明，在年轻的兴奋性新皮质突触中，稳态可塑性是通过突触后AMPAR和钠通道的协同变化而发生的，并且是一种增益控制机制，不会影响突触传递的短期动力学。

材料和方法

神经细胞培养。如前所述，从出生后第3天或第4天的Long-Evans幼鼠中制备分离的神经元培养物(Pratt等人，2003年). 在7-10 DIV后使用培养物。在使用前的第2天，用0.5或1μ米TTX，而另一半未经治疗。

免疫细胞化学。如前所述，对培养的神经元进行免疫染色(卢瑟福等人，1997年). 为了对表面GluR1（癌基因，马萨诸塞州坎布里奇）和GluR2（化学素，特梅库拉，CA）受体进行染色，将活神经元与抗-GluR1或用培养基稀释的抗-GluR2在5%的CO中孵育1小时₂37°C培养箱，然后用1.8 ml培养基培养1小时，以清洗未结合和非特异结合抗体。然后按照上述方法固定细胞，在不渗透的情况下应用二级抗体Alexa Fluor 594或488（分子探针，Eugene，or），仅标记表面受体。我们验证了单独固定并不能充分渗透膜以检测突触后密度-95（PSD-95；局限于细胞内），这表明该方法允许我们选择性地检测表面受体（参见补充图，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 对于带有其他突触标记的双重或三重标记，AMPAR按上述方法染色，然后按上述方法进行额外的免疫染色(卢瑟福等人，1997年). 使用了以下主要抗体：兔或鼠抗突触素I（1:800；Chemicon）、鼠抗金抗体（1:1000；BD Transduction Laboratories，Lexington，KY）、鼠PSD-95抗体（1:100；亲和生物试剂，Golden，CO）、豚鼠抗囊泡谷氨酸转运体1（抗Vglut1）（1:500；Chemiconic）、兔抗GluR1抗体（1:10；癌基因）、，小鼠抗GluR2（1:20；Chemicon）和小鼠抗GFP（1:500；分子探针）。次级抗血清按1:100或1:500稀释。

时间推移显微镜。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）转染质粒进行延时成像。质粒pBluescript含有EGFP标记的GluR2 DNA，从R.Malinow博士（纽约州冷泉港冷泉港实验室）处获得(Shi等人，2001年). 这个Sma公司我-Xha公司将I片段亚克隆到pEF（伸长因子启动子）射手载体（Invitrogen）中。PSD-95型-迪斯科马红色（DsRed）T4是通过插入PSD-95 DNA制成的（来自加利福尼亚大学旧金山分校D.Bredt博士）(Craven等人，1999年)转化为N1-DsRedT4载体（来自伊利诺伊州芝加哥大学B.Glick博士）(Bevis和Glick，2002年).

转染后3d开始成像。我们的实验只选择了EGFP-GluR2表达适度的锥体神经元。成像溶液包含以下内容（单位：m米)：117氯化钠、5.3氯化钾、1.8氯化钙₂，0.814硫酸镁₄，1 NaH₂人事军官₄、20个HEPES、50个葡萄糖和100 mg BSA，最终渗透压在315和320 mOsm之间，pH值7.3。在成像期间，培养皿被放回孵化器。为了尽量减少漂白和光损伤，我们使用了3%的中性密度过滤器。点状突起的平均峰值强度与同一神经元的树突状强度密切相关（数据未显示），表明表达较多EGFP-GluR2蛋白的神经元的峰值和树突状密度较高，反之亦然。

摄影和图像分析。在倒置的Olympus Optical（Tokyo，Japan）IX70显微镜上观察培养物，该显微镜具有数值孔径为1.25的60×油浸物镜（FM1-43实验除外；见下文）。数码照片是用SenSys CCD相机（PhotoMetrics，Huntington Beach，CA）拍摄的（见图6)或Orca ER CCD相机（滨松光电，日本滨松）（见图。​图1，1,​,2,2,​,3,三,​,5).5). 对于图形​图1，1,​,2,2,​,3,三七个或八个z（z）-通过使用z（z）-区段焦点驱动。每个标签的曝光时间和图像位范围在实验中都是固定的，以便在不同条件下进行比较。使用Openlab软件（Improvision，马萨诸塞州列克星敦）对数字图像进行量化。

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图6。

成对锥体神经元之间假定的突触接触数。A类用贴片吸管将生物细胞素注入锥体神经元，固定并染色。箭头表示突触前神经元（pre）的轴突走行。顶部锥体神经元的动作电位在底部锥体神经元中诱发突触后反应。比例尺，30μm。B类，轴突-枝晶交叉的放大。突触前和突触后结构都充满了生物细胞蛋白（蓝色），但只有轴突含有τ蛋白（红色）。突触蛋白染色显示为绿色。比例尺，2μm。C类，对照培养物中锥体神经元对之间假定的突触接触数量总结(n个=11）和TTX处理的培养物(n个= 8;对= 0.76).D类用生物细胞素填充物通过贴片吸管（蓝色）观察锥体神经元的树突。突触用抗突触前蛋白突触素（绿色）和突触后蛋白PSD-95（红色）的抗体标记，后者是谷氨酸能突触的标记。比例尺，1μm。E类，控制锥体神经元每微米树突突触点数量(n个=6）和TTX处理(n个=8）培养基。F类，与PSD-95点相关联的突触点百分比。

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图1。

活性阻断增加表面AMPA受体的积累。A类，对照和TTX处理的皮层神经元染色的代表性免疫荧光图像。在活神经元上对细胞表面GluR1受体进行免疫标记（绿色），然后将神经元固定并渗透用于突触蛋白I（SynI）染色（红色）。与红色点子相关的绿色点子被视为突触GluR1（61±5%的抗GluR1-点子）。地下一层GluR1和GluR2染色的定量。测量GluR1或GluR2点的峰值强度，并计算对照神经元或TTX治疗2 d的神经元的细胞平均值；值表示为控制值的百分比。TTX处理显著增加了表面GluR1和GluR2。突触GluR1和GluR2比非突触GluR1和GluR2增加更多。地下二层，测量GluR1点的总强度（而非峰值）得出了类似的结果。Syn、Synaptic；非同步、非突触。n个代表20个对照和19个TTX处理的神经元（GluR1），7个对照和7个TTX治疗的神经元（GluR2）。此处和下图中，误差条代表SEM。星号表示显著差异(^*对< 0.05;^**对< 0.01.)

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图2。

TTX处理对GluR1和GluR2共定位的影响。A类，突触GluR1和GluR2的克隆化。在活神经元上免疫标记细胞表面GluR1（红色）和GluR2（绿色），然后固定和渗透神经元进行Vglut1染色。B类，TTX治疗增加了与突触前标记物Vglut1共定位的点GluR1/GluR2共定位[n个=10个神经元用于控制（续），13个神经元用于TTX]。条被归一化为每个条件下突触GluR1（顶部2条）和GluR2（底部2条）穿孔的总数。C类，典型对照（左侧）和TTX处理（右侧）神经元的GluR1和GluR2总强度的相关性。点表示单个点。对于这些神经元，皮尔逊相关系数和对斯皮尔曼秩检验值如下：对照，第页=0.91和对= 0.0002; TTX公司，第页=0.91和对= 0.0005. a.u.，任意单位。D类，对照组和TTX处理的神经元之间的平均相关性和斜率没有差异。仅在至少有五个点状突起且强度高于组平均值的神经元中计算相关性（对照组，n个= 6; TTX公司，n个= 11).

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图3。

EGFP-GluR2的时间推移成像。A类转染EGFP-GluR2的皮层神经元显示点状EGFP信号（绿色），在非渗透条件下可被抗GFP抗体（红色）染色，表明EGFP-GulR2受体的表面表达。小部分暗淡的EGFP-GluR2斑点（20%）未与表面抗体共定位，可能代表内部受体簇（箭头所示）。B类，对于用表面染色可检测到的EGFP-GluR2簇，来自同一点的EGFP和Alexa Fluor 594信号（抗GFP抗体）的强度之间存在强相关性。从这个例子来看，第页=0.89和对< 0.0001. TTX治疗并没有改变这种关系的斜率（对照组261个点；TTX组253个点；每种情况下7个神经元）。a.u.，任意单位；控制。C类PSD-95-DsRed被用作突触后标记物来识别突触EGFP-GluR2点。D类，EGFP-GluR2表达神经元的延时分析示例：TTX治疗1天对EGFP强度的影响。E类，TTX处理的神经元显示EGFP-GluR2强度增加。数据来自10个控制神经元（第2天7个）和12个TTX处理神经元（第二天10个）。对照组和TTX处理组神经元的树突强度均略有下降。强度值标准化为第0天的值。F类，EGFP-GluR2点状物峰值强度与枝晶强度的比值。TTX神经元的突触/树突状细胞强度比在1天后显著增加，在TTX治疗的第2天则略有增加。对于控制神经元，这个比率没有改变(对> 0.2).G公司，TTX处理神经元中所有EGFP-GluR2点的突触/树突强度比的累积分布。第0天，245 punta；第1天，306 punta；第二天，286点。对照组分布没有改变（第0天193 punta；第1天244 punta，第2天200 punta）（数据未显示）。星号E类和F类指出配对学生的显著性水平t吨测试(^*对< 0.05;^**对< 0.01;^***对< 0.001). 比例尺：A类,C类，5微米；D类，10微米。

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图5。

突触缩放不会显著影响囊泡回收。第1页，锥体神经元的远端树突，用Alexa Fluor 594标记。A2类，突触前终末在15μ米FM1-43。A3号，在去训练（1500个刺激，10 Hz）后，FM1-43点消失。分析中只包括接触填充神经元树突的FM1-43点。比例尺，5μm。所有图像都是从同一视野拍摄的。B类，弱电刺激标记的FM1-43点强度值的累积分布（20个刺激，0.5 Hz）。数据来自111个对照和113个泪点；每种情况下有9个神经元。强度值以任意单位（a.u.）显示。C类，高K标记的FM1-43点强度值的累积分布⁺协议。数据来自1404控件和1191 TTX punta；每种情况下有14个神经元。D类，控制神经元中单个点状突起的去训练时间过程。粗黑点是平均值。E类，对照组（黑色）和TTX点状物（灰色）的平均去沉积时间进程。误差条代表160个控制和103个TTX点的SD（每个条件下6个神经元）。在10Hz的1500次刺激下，Puncta的去训练率最高，因为额外的刺激不会导致更多的去训练。

免疫细胞化学或延时图像的AMPAR强度值分析如下。根据背景强度测量树突强度。根据与局部枝晶强度的固定强度差异选择点滴。对于所有选定的点，测量峰值强度（最亮像素；1像素=0.11×0.11μm）和总强度（阈值以上所有像素的总强度）。这两种强度测量结果在质量上相似。从所有点状强度中减去局部树枝状强度。在延时分析中，仅选择与PSD-95-DsRed相关的EGFP-GluR2突触点来增强突触点的选择。所有分析都是在实验条件下进行的。

配对录音。为了进行电生理记录，将培养物放在尼康（日本东京）Diaphot倒置显微镜的台上，并灌注人工脑脊液（ACSF）；用葡萄糖将培养物注入320毫奥斯米，并用5%的CO起泡₂/95%O₂) (卢瑟福等人，1997年;Turrigiano等人，1998年;Watt等人，2000年). 内部溶液包含以下物质（单位：m米)：100 K-葡萄糖酸盐，20 KCl，10 K-HEPES，0.5 EGTA，4 Mg-ATP，3 Na-GTP，10 Na₂磷酸肌酸和0.1%生物细胞素，pH～7.4，KOH（290 mOsm，含蔗糖）。结电位（～15 mV）未得到补偿。使用Axopatch 200B放大器（Axon Instruments，Foster City，CA）获得全电池电压灯记录。只有当静息膜电位(V（V）_米)低于-50 mV，串联电阻(对_秒)小于30 MΩ，如果在记录过程中这些参数变化小于20%。平均单元参数包括以下内容：V（V）_米=-66±3 mV，输入电阻=529±91 MΩ，对_秒=19.3±1.5 MΩ，全细胞电容=21±2 pF；它们在不同条件下没有差别。对于振幅和变异系数（CV）测量，我们将数据集限制为具有对_秒<20 MΩ。这并没有显著改变任何平均细胞参数。

在室温下对两到四个锥体神经元同时进行全细胞记录。单突触连接通过短潜伏期（<4ms）和小时间抖动（<1ms）确定。通过在突触前神经元中以20 Hz的频率诱发10个动作电位序列来测量单突触兴奋性连接（反转电位，～0 mV）的短期可塑性。ACSF含有50μ米防止APV诱导突触传递的任何长期变化。在一些录音中，2-5μ米DNQX被添加到ACSF中，以减少干扰我们记录的自发发生的突触事件。在这种低浓度下，DNQX使EPSC振幅降低不超过10%，我们证实APV和DNQX均不影响短期抑郁。为了探索短期抑郁的恢复情况，在20赫兹的序列之后，增加一个动作电位，间隔可变（100、200、300、500或700毫秒）。突触前动作电位序列被分离25-30秒，以便短期可塑性完全恢复。在10 kHz下对痕迹进行采样。

通过假设突触反应的线性相加，确定了火车上每个刺激的突触后电流的振幅。为此，我们使用IgorPro（WaveMetrics，Lake Oswego，OR）编写的内部软件，用指数函数拟合上述响应的衰减。我们使用对序列中每个动作电位的突触后反应（9-50次重复）的平均振幅（通过其SE加权）来拟合指数函数，从而得出每对抑郁时间常数的估计值。所有配对的抑郁症都用一个指数来描述。抑郁症的恢复也可以用一个单一时间常数的指数函数来描述。

荧光苯乙烯染料实验。使用基因枪转染DsRed金字塔神经元(Kilman等人，2002年)或Lipofectamine 2000]或在FM1-43标记前通过贴片吸管注入红色染料Alexa Fluor 594。在荧光Stylyl染料FM1-43存在的情况下，通过细胞外电极（两条银线相隔约5 mm，距离成像神经元约2-3 mm）激发突触前活动来标记突触前终末。我们证实，刺激可靠地诱发了成像神经元附近神经元的动作电位。在含有以下物质的HEPES缓冲溶液中应用标记刺激物（单位：m米)：119氯化钠，2.5氯化钾，2硫酸镁₄，2氯化钙₂，25 HEPES，30葡萄糖，pH 7.35（～320 mOsm），加上（μ米)10个DNQX、50个APV、20个荷包牡丹碱和15个FM1-43。用含有突触阻滞剂的ACSF冲洗15分钟后，拍摄标记锥体神经元的远端树突图像。使用Orca ER CCD相机（滨松光电）拍摄图像，该相机具有40×油浸物镜（1.3数值孔径），带有500-550 nm（绿色）和590-650 nm（红色）滤光片。然后用1500个10 Hz的脉冲对终端进行去污，然后再次进行图像采集。取FM1-43阳性点状细胞的荧光值作为这两幅图像中荧光的差异。在测量去训练时间过程的实验中，在去训练刺激期间每隔10秒拍摄一次图像。应用第二个去训练刺激以确保去训练达到最大。点刺强度标准化为其起始值（去训练方案前三到五张图像的平均值），并减去结束值（第二次去训练方案后三张图像的均值）。通过线性拟合每个点的最后三个强度值来估计漂白。在校正亮度值以进行漂白后（每张图像约1%），单个FM1-43点的去染色用单指数函数拟合。只包括去染色前强度变化不超过20%的斑点。

或者，通过高钾超灌注2分钟来诱发突触活动⁺HEPES缓冲溶液（同上，但81.5 m米氯化钠和40 m米KCl）15μ米FM1-43。在洗脱过程中，含有0.2 m的ACSF中的突触活动被阻断米钙²⁺，5米米镁²⁺，和0.1μ米TTX（15分钟）。喷5分钟高钾可以去除斑点⁺在没有FM1-43的情况下解决。

使用IgorPro（WaveMetrics）编写的定制软件对图像进行量化。荧光值显示在图5通过平均每个视觉选择点的2×4最亮像素的面积（1像素=0.16×0.16μm）获得。如果我们使用计算机算法（基于Nägler等人(2001)]仅从平均背景中选择荧光值至少为3个SDs的点，或者如果在5×5像素区域上进行强度测量，则选择荧光值为3个SD的点。

谷氨酸反应。使用基于KMeSO的内部解决方案进行全细胞录音₄(Watt等人，2000年). 谷氨酸（5 m米在ACSF中），用玻璃吸管（直径～2μm）在15-25 psi的压力下放置5-7 ms，位于距体细胞100-250μm处的树突顶端。所有记录都是在50μ米APV隔离AMPA反应。在ACSF中建立稳定的基线反应后，1μ米在大约一半的录音中，我们从TTX开始，在ACSF中清洗，以避免任何偏见。在洗入期间，在电压钳中监测响应，我们总是在测量响应之前检查洗入是否完成。只有当输入电阻变化不超过30%且膜电位变化不超过16 mV时，才接受记录。ACSF中谷氨酸反应的平均振幅和动力学在对照组和TTX处理的神经元中相似（数据未显示）。在一些TTX处理的神经元中，谷氨酸在ACSF中的应用诱导了电流-电流模式下的动作电位。对于这些神经元，在更高的超极化电位（-80至-100 mV）下测量谷氨酸反应，导致对这些细胞中TTX效应的轻微低估。

统计。对未配对学生的t吨测试，除了比较延时实验中的不同时间点和不同灌注介质中的谷氨酸反应外，配对学生的t吨使用了测试。相关性用皮尔逊相关系数描述，显著性用斯皮尔曼秩和检验。

结果

实验在出生后7-10次DIV后对视觉皮层神经元进行培养。所有记录和细胞填充都是从视觉识别的锥体神经元获得的，如前所述(卢瑟福等人，1998年;Pratt等人，2003年). 除非另有说明，所有TTX治疗均为2天。

短期塑性

上述数据表明，突触后AMPAR积累的变化可以解释活动阻断引起的量子振幅增加。然而，尽管2天的活动阻滞使量子振幅增加1.5到2倍(Turrigiano等人，1998年)，诱发的单一EPSCs增加两倍至三倍(图4A、 B类) (Turrigiano等人，1998年;Watt等人，2000年). 这表明量子振幅的变化不能完全解释诱发传输的增加。在前面的章节中，有证据表明长期TTX治疗会导致突触后改变。在海马神经元中，活动阻断可导致FM1-43循环的突触前变化(Murthy等人，2001年). 突触前释放概率的增加会增加EPSC的振幅，但也会增加短期抑郁(Zucker和Regehr，2002年). 为了确定短期可塑性是否因活动阻断而改变，我们从对照组和“姊妹”TTX处理的新皮质培养物中的锥体神经元对中进行了记录。我们在突触前神经元（保持在电流钳中）中以20 Hz的频率诱发10个精确计时的动作电位序列，并在-70 mV电压钳中记录突触后神经元的突触电流(图4A类). 两天的TTX治疗使诱发EPSC的振幅增加了两倍至三倍(图4A、 B类)，但尽管振幅大幅增加，但对照组和TTX治疗组的短期可塑性没有差异。单突触连接在两种情况下都表现出类似的抑制(图4A、 C). EPSC振幅的短期抑制可以用单指数拟合，对照组的时间常数为86±24 ms，TTX治疗组的时间常量为81±9 ms。在两种条件下，EPSC振幅达到相似的稳态水平（对照组为初始振幅的22±4%，TTX治疗组为22±6%）。通过在训练后的不同时间段激发突触前神经元的单一动作电位来探索抑郁的恢复。对照组和TTX治疗组之间的恢复时间常数没有差异(图4D类). 对照组和TTX治疗组诱发EPSC的平均潜伏期（2.6±0.2 ms）和衰减时间常数（13.4±2.2 ms）没有差异。此外，静息膜电位、输入电阻和其他全细胞参数没有显著差异（见材料和方法）。

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图4。

突触缩放不会改变短期突触可塑性。A类，来自对照（CTL）和TTX处理（TTX）皮层培养物的锥体神经元对10个动作电位的20 Hz序列的突触后反应（底部轨迹）的典型示例。B类控制和TTX处理对的EPSC振幅（第一列）。星号表示显著差异(对< 0.02).C类，作为突触前动作电位时间的函数，所有神经元的归一化EPSC振幅平均值。根据所有神经元的平均抑郁时间常数构建指数曲线（对照组，τ=86 ms；TTX，τ=81 ms；两种情况下均为7对）。D类，描述抑郁症恢复的单指数函数的时间常数（对照，n个= 7; TTX公司，n个= 6;对= 0.41).E类、来自对照组和TTX处理组的EPSCs的CV。

两个神经元之间突触连接的简单二项式模型预测，EPSC振幅的CV强烈依赖于突触前参数N个和对:

1

哪里N个是独立发布站点的数量对是平均释放概率(Faber和Korn，1991年;Korn and Faber，1991年). 当突触效能改变时，CV不变反映突触后变化(Faber和Korn，1991年;Korn and Faber，1991年)而突触前增加对或N个我们从我们的锥体神经元对中测量了诱发EPSCs的CV，发现对照组和TTX治疗组的CV值没有差异（对照组，0.34±0.03；TTX，0.34×0.04；对= 0.92) (图4E类)并且非常接近我们之前报告的对照对的值(Pratt等人，2003年). 再加上对短期抑郁缺乏影响，这表明对对活动阻断诱导的突触传递增加没有显著贡献。

钠通道对突触后反应的放大作用

上述实验表明，释放概率和释放位点数量的变化不太可能对活动阻滞诱发的诱发传递的增加做出显著贡献。这表明，活动阻断对诱发传递的影响大于对量子电流的影响，这是由于额外的突触后机制。诱发的突触电流比量子事件大得多，它们产生的局部去极化可能足以激活树突状电压门控钠通道，众所周知，钠通道可以增强突触电流(Magee和Johnston，1995年;施温特和克里尔，1995年;斯图亚特和萨克曼，1995年;Lipowsky等人，1996年). 我们之前已经证明，2天的活动阻滞会增加钠电流密度(Desai等人，1999年)，这表明这一提升可能会得到加强。因此，我们研究了电压门控钠通道在对照神经元和TTX治疗2天的神经元对谷氨酸的突触后反应中的作用。

为了测试TTX敏感电流的贡献，我们发现有必要在TTX洗脱前后测量同一神经元中诱发的AMPA反应的振幅。由于TTX阻断突触传递，我们无法测量突触诱发的反应，因此我们使用谷氨酸直接作用于树突来激发AMPA介导的反应，如前所述(Turrigiano等人，1998年;Watt等人，2000年). 谷氨酸（5 m米)通过靠近树突的贴片吸管应用，以诱发与突触诱发EPSCs（50-300 pA）幅度相同的突触后反应。在冲洗1μ之前和之后，在电压钳和电流钳中测量响应，总是从-70 mV的膜电位开始米TTX。在电流钳中，TTX仅轻微降低对照神经元的谷氨酸反应，而在TTX处理的神经元中，谷氨酸反应的幅度和面积减少了20-30%(图7A、 B类). 这表明，在TTX处理的神经元中，但在对照神经元中，TTX敏感的钠通道显著放大了树突状谷氨酸反应。这不是由于谷氨酸诱发反应的初始振幅不同，因为我们调整了谷氨酸的应用，使TTX处理的神经元和对照神经元具有相似的初始振幅（对照，19.1±3.7 mV；TTX处理，20.4±4.6 mV）。在电压钳中，TTX的作用稍小，但方向相同(图7C类). 我们注意到，TTX洗脱作用的程度明显依赖于谷氨酸施用距离躯体的距离（Pearson’s第页= -0.56). 当谷氨酸施用量大于150μm时，TTX洗脱效果最强(图7C类). 在对照组和TTX处理的神经元中，谷氨酸应用与胞体之间的平均树突状距离相似（对照组，149±15μm；TTX，151±9μm）。这表明，TTX处理神经元的远侧树突局部发生突触后反应的显著放大，其中局部膜电位逃逸体细胞电压钳，并且这种放大在更远的位置更强。

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图7。

钠通道对谷氨酸反应的放大作用。A类，电流灯记录对照和TTX处理神经元对树突状谷氨酸应用的反应。黑色痕迹是ACSF中的响应；灰色痕迹是洗入1μ后的反应米TTX公司。保持膜电位为-70 mV。校准：10 mV，100 ms。B类，黑色条代表控制神经元(n个= 6); 灰色条表示TTX处理的神经元(n个= 10). 星号表示显著差异(对<0.05）在TTX洗脱前后的反应之间（配对学生的t吨测试）。C类，TTX洗脱后电压钳（-70 mV）中记录的谷氨酸反应的平均振幅，仅以ACSF值的百分比表示。左栏表示来自所有树突位置的数据，右栏表示来自树突位置>体150μm的数据。数据来自8个对照组和12个TTX处理的神经元。

为了估计锥体神经元之间突触的位置，我们根据来自图6，A类和B类这些接触以明显随机的方式分布在树突树上，距离躯体10至270μm（平均距离为112±8μm）。在对照组和TTX治疗组中，约40%的假定突触接触位于距体部>150μm的位置。许多触点位于薄树突上，这使它们进一步远离体细胞电压钳的影响。这表明，锥体神经元之间的突触有很大一部分位于遥远的位置，在那里钠通道可以放大诱发的突触去极化。

讨论

突触缩放是一种稳态可塑性，可调节突触强度，以应对活动的长期变化。为了理解突触缩放的功能后果，我们认为了解其表达机制非常重要。在这里，我们详细描述了在视觉皮层培养中，当网络中的突触活动被阻断1-2天后，兴奋性突触发生的稳态变化。我们的结果表明，年轻的新皮质突触的突触缩放主要表现为突触后。通过增加突触后膜中AMPAR的积累和突触后钠通道增加AMPA电流的增加，活动阻断使锥体神经元之间的突触连接强度增加了一倍以上。兴奋性突触的数量以及突触前终末的囊泡释放和再循环没有受到显著影响。最重要的是，从功能的角度来看，突触传递的短期动力学和EPSC振幅的可变性没有改变。通过视觉剥夺降低视觉皮层活动也会调节兴奋量子振幅，但对突触动力学没有太大影响(Desai等人，2002年;Maffei等人，2004年)表明稳态可塑性的这一特征是保守的体外和体内这些结果表明，年轻新皮质神经元中的稳态突触缩放作为一种增益控制机制发挥作用，在不影响突触动力学的情况下调节神经元活动。

我们使用了几种方法来证明受体积累的突触后变化。与先前脊柱培养的结果一致(O'Brien等人，1998年)TTX处理2 d后，通过GluR1和GluR2亚单位的比例增加，显著增加了天然AMPAR表面染色的强度。这与对mEPSC动力学的仔细测量很吻合，在这些新皮质突触使用TTX或谷氨酸受体阻滞剂阻断活动后，mEPSC的动力学没有变化(Turrigiano等人，1998年)如预期，如果AMPAR的亚基组成没有改变(Geiger等人，1995年;Thiagarajan等人，2002年;Grosskreutz等人，2003年). 相反，最近的报告表明，在海马培养物中，活性阻断导致GluR1合成和/或突触定位的优先增加，而GluR2没有显著变化，并以与更高GluR2含量一致的方式改变mEPSCs的衰变动力学和药理学敏感性(Thiagarajan等人，2002年;Ju等人，2004年). 据报道，活动阻断后GluR1点密度的增加可能反映了现有突触中GluR2插入增加，因为mEPSC振幅增加，但频率没有改变(Ju等人，2004年). 新皮质和脊髓神经元以及海马神经元之间受体积累的这些亚单位特异性差异表明，在这些不同类型的中枢突触中，活动依赖性受体运输存在根本性差异。突触后部位AMPA受体积累增加的机制尚待阐明。存在几种可能性：转录后调节、翻译后调节，或者可能由于与其他（突触）蛋白质的相互作用而导致蛋白质周转的变化。

作为定量改变受体积累的第二种方法，我们使用EGFP标记的AMPAR的延时成像。通过这种方法，我们可以首次跟踪TTX治疗期间单个神经元中受体积累的变化。随着时间的推移，对单个神经元中相同数量的突触进行观察，结果表明，在活动阻断期间，突触受体强度的整个分布都增加了，与之前报道的mEPSC振幅分布的增加类似(Turrigiano等人，1998年). 这些数据表明，在活动阻滞的2天内，突触AMPAR积累增加了50-100%，这一变化幅度与量子振幅的变化密切相关(Turrigiano等人，1998年;Watt等人，2000年).综上所述，这些数据表明，受体积累增加可以解释量子振幅的增加，并显著有助于增强诱发兴奋性传递。

与对受体积累的明显影响相反，活动阻断未引起突触前传递参数的明显变化。对突触前功能的彻底分析，包括短期可塑性、突触传递的可变性以及FM1-43染料的摄取和释放，显示这些参数中没有任何显著变化。我们没有发现对照组和TTX处理组神经元对FM1-43的摄取有任何差异。在TTX处理的神经元中，FM1-43点的去训练稍慢，可能表明释放概率略有下降，或突触前小泡循环存在细微差异，但这些影响的方向是错误的，导致了活动阻断诱导的EPSC振幅增加。电生理测量对N个比英寸对然而N个预计会增加FM1-43标记点的数量和/或FM1-43标签的强度，但未检测到此类变化。此外，我们的免疫染色实验表明，锥体神经元之间的假定突触数量或总兴奋性突触密度没有任何差异。总之，这些数据表明，充其量，这些新皮质突触的突触前功能只有细微的变化。

与对照EPSCs相比，TTX处理神经元的突触电流振幅增加了一倍以上(图4A、 B类)而量子振幅（和AMPAR积累）仅增加了50-100%(Turrigiano等人，1998年;Watt等人，2000年). 我们的数据表明，诱发传递的额外增加部分归因于钠通道对突触电流的增强放大。TTX治疗2天后，钠电流振幅增加约30%(Desai等人，1999年)最近的一份报告表明，经过2天的TTX治疗后，树突状钠通道上调(Aptowicz等人，2004年). 树突状定位的钠通道可以提高突触电流的振幅(Magee和Johnston，1995年;施温特和克里尔，1995年;斯图亚特和萨克曼，1995年;Lipowsky等人，1996年). 我们发现，当对照神经元的钠通道被阻断时，谷氨酸诱发电流几乎没有减少，但TTX处理的神经元减少了20-30%。如观察到的那样，除了量子振幅的增加外，30%的放大率增加将导致EPSC振幅的总增加2到2.5倍。TTX处理后，其他电压依赖性电导也会发生变化(Desai等人，1999年)另外，额外的树突状电导可能有助于控制和TTX处理神经元中突触电流的差异性增强。

在海马培养物中，长时间不活动会增加突触的大小和可供释放的小泡数量(Murthy等人，2001年). 这导致了这样一种观点，即动态平衡可塑性是通过突触大小的增加而发生的，突触前和突触后区域随之扩大，释放概率和突触后传受器数量同时增加。这个模型的一个困难是突触生长缓慢[在2天后突触面积仅增加30%(Murthy等人，2001年)]而mEPSC振幅的变化更大更快【2天后振幅加倍(Turrigiano等人，1998年)]. 我们现在表明，增加受体积累可以独立于突触前功能的任何可测量的变化。这强烈反对稳态可塑性的“突触生长”模型，突触前和突触后功能的变化是不可分割地耦合在一起的。相反，我们的数据支持这样一种观点，即突触前和突触后的变化反映了可分离和独立的稳态机制，在不同突触、不同发育阶段或不同实验操作的反应中可能存在差异表达(Turrigiano等人，1998年;Paradis等人，2001年;Burrone等人，2002年;Thiagarajan等人，2002年;Ju等人，2004年).

突触将信息从一个神经元传递到下一个神经元。信息如何传递的一个重要决定因素是突触的动态行为。促进突触可以加强动作电位的爆发(Lisman，1997年;Kepecs和Lisman，2003年)而突触抑制可以作为一种动态增益控制机制，强调突触前放电速率的变化，而不依赖于绝对速率(Abbott等人，1997年;Markram等人，1998年). 因此，改变短期动态的可塑性机制将影响突触能够传递的信息。在这里，我们表明，稳态突触缩放不会影响突触传递的短期可塑性或可变性。有趣的是，兴奋性突触传递的另一个重要方面，即通过AMPA和NMDA受体的电流比率，也在活动阻断后保持不变(Watt等人，2000年). 这些结果表明，年轻新皮质突触的突触标度是在突触后表达的，并在不从根本上改变兴奋性突触传递的信息含量的情况下调节增益。

脚注

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