二硫异构酶Grp58是朊病毒神经毒性的保护因子

摘要

介绍

朊病毒疾病是一种致命的神经退行性疾病，其特征是大脑海绵状变性，伴有广泛的神经元丢失和PrP积聚^{联合国安全理事会}是正常朊蛋白（PrP）的一种错误折叠和蛋白酶抗性形式^C类) (普鲁辛纳，1998年). PrP的生成^{联合国安全理事会}与蛋白质的结构变化有关，这些结构变化导致其生化特性发生变化，例如在非变性洗涤剂中不溶性和对蛋白酶的部分抗性。

我们之前发现高纯度PrP^{联合国安全理事会}羊瘙痒感染小鼠引起内质网应激和细胞凋亡在体外(Hetz等人，2003年). 此外，我们为克雅氏病（CJD）患者大脑内质网应激的诱导提供了证据(Hetz等人，2003年). 内质网应激反应通常与病理条件下的细胞死亡有关，在病理条件下，错误折叠的蛋白质积聚在内质网中，或当钙稳态受到干扰时(Ferri和Kroemer，2001年). 内质网应激触发一种称为去折叠蛋白反应（UPR）的生存途径，与伴侣蛋白和折叠酶的增加表达有关，后者可减少非特异性聚集或将错误折叠的蛋白质靶向蛋白酶体介导的降解(Sitia和Braakman，2003年). 然而，当内质网内环境无法恢复时，会诱导促凋亡反应(Breckenridge等人，2003年)，通过应力传感器Ire-1α与ER驻留caspase-12的激活有关(Yoneda等人，2001年). 其他成分诱导促凋亡转录因子GADD153/CHOP的表达(Harding等人，2000年).

UPR激活的促生存作用包括葡萄糖调节蛋白（grp）家族伴侣蛋白的表达增加，如Grp78/Bip（免疫球蛋白链结合蛋白）和Grp94(Reddy等人，1999年;Rao等人，2002年;Sitia和Braakman，2003年). 在实验性小鼠瘙痒的晚期，内质网应激反应主要与Grp58的上调有关[也称为ERp60、ER-60、ERp58、ER-58、ERp61和Q2(Turano等人，2002年)]，具有蛋白二硫键异构酶（PDI）样活性的伴侣。然而，只有少数报告描述了Grp58参与内质网应激，其分子机制尚不清楚(Mazzarella等人，1994年;霍尔茨和奥马利，2003年;Dimcheff等人，2003b). Grp58的两种结构同源物PDI和内皮PDI（EndoPDI）对缺血具有神经保护活性(Tanaka等人，2000年;Fischer等人，2002年;Sullivan等人，2003年). Grp58在结构和活性上与PDI相似，因为这两种蛋白质都催化硫醇/二硫键交换，包括二硫键的形成和重排反应(Turano等人，2002年).

在本文中，我们研究了朊病毒复制与内质网应激反应诱导之间的关系。我们的结果表明，二硫腺苷酶Grp58的表达增加是病理学中的早期事件，似乎在调节朊病毒的神经毒性中起着重要作用。这些发现为传播性海绵状脑病（TSE）的治疗提供了一个新的靶点，并提出了错误折叠蛋白积聚引发的神经元毒性的一般机制，这是几种神经退行性疾病中常见的事件(索托，2003年).

材料和方法

材料。Staurosporine、tunicamycin、brefeldin A、钙离子载体A23187和thapsigargin购自VWR International（德国达姆施塔特）。细胞培养基、胎牛血清和抗生素来自Invitrogen（Carlsbad，CA）。Fluo-4和BAPTA AM购自Molecular Probes（尤金，俄勒冈州）。

细胞培养和活性测定。N2a细胞在37°C和5%CO条件下培养于补充有10%胎牛血清和抗生素（10000 U/ml青霉素和10μg/ml链霉素）的DMEM中₂为了进行细胞活性分析，在添加激动剂之前，细胞在含有1%血清的细胞培养基中在IV型胶原涂层的96周板中生长24小时。根据供应商的建议，使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-3-羧甲基氧基-苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑（MTS）和甲基硫酸吩嗪对细胞活力进行量化（CellTiter 96 AQueous；Promega，Madison，WI）。PrP的纯化^{联合国安全理事会}并按照前面的描述进行了毒性研究(Hetz等人，2003年). 对于与BAPTA AM的钙螯合，细胞负载37μ米BAPTA AM，如前所述(Barros等人，2001年).

质粒和细胞转染。针对Grp58 RNA构建基于载体的小干扰RNA（siRNA）：用5′-CCC GAGTCCAACCCGTGG-3′和5′-GGTGTTCGTCCTCTCTCTCCACA-3′引物，通过巢式PCR从基因组DNA中扩增出人类U6启动子序列，然后用5′-ATA扩链GAATTC公司CCGAGTCCAACACCCGTGGG-3′和5′-ATAGAATTC公司GGTGTTCGTCCTTTCCACAAG-3′。第二个扩增子被克隆，使用生态RI（下划线），转化为含有潮霉素耐药性的穿梭载体。使用载体5′-CCG ATT TCG GCC TAT TGG T-3′的正向引物和包含U6启动子3′末端和特定发夹序列（Grp58-1，5′-ATAGCCGCAAAA）退火部分的反向引物克隆了两个不同的siRNAAATAGTCCCATTAGCAAAGG公司GAAGCTTGAACC公司TTTGCTAATGGGACTAT公司CGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3′和Grp58-5，5′-ATACGGCGCAAAAAGAGATACCTGAAGTCTG公司GAAGCTTGAA公司cagacttcaggtactc公司GGTGTTCGTCCTTTCCACA-3′）。获得的PCR片段用Bgl公司II和不是我和克隆到穿梭载体中，用相同的酶进行简化。按照制造商的指示，使用Pfx聚合酶（Invitrogen）进行所有PCR。作为阴性对照，使用与退化发夹融合的完整U6启动子。两个结构体的选定序列（带下划线）都被国家生物技术信息中心表达序列标签数据库“轰炸”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST网站/)并且对人类和小鼠Grp58都具有特异性。siRNA结构在两个方向上都进行了完全测序。按照制造商的指示，使用SuperFect试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根镇）转染产生稳定表达的N2a细胞。转染48小时后，使用G418（基因素；1.3 mg/ml）筛选细胞5天，通过限制稀释获得单个克隆。

Grp58 cDNA（克隆{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BI153534”，“term_id”：“14613535”，“term_text”：“BI153534“}}BI153534号; 用特异引物（5′-GC）通过PCR扩增Invitrogen）GGATCC公司GCCACCATGCTTCAGCTCTAG-3′和5′-GC坦桑尼亚联合共和国TTAGAGTCCTCTTG-3′。扩增子被消化Xho公司我和巴姆HI（带下划线）并克隆到pcDNA4载体（Invitrogen）。通过逆转录-PCR从N2a RNA中克隆小鼠PrP，并使用Hin公司dIII和生态RI限制场所。绿色荧光蛋白（GFP）在密码子25处融合到PrP的N端。

SDS-PAGE和Western blot分析。将脑组织在冰上在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（20mL）中匀浆米Tris，pH 8.0，150 m米含有蛋白酶抑制剂混合物的氯化钠、0.1%十二烷基硫酸钠、0.5%脱氧胆酸和0.5%Triton X-100）（F.Hoffmann-La Roche，瑞士巴塞尔）。蛋白质浓度通过微量BCA分析测定（皮尔斯，罗克福德，IL）。通常将相当于30-50μg总蛋白的溶液加载到10%的SDS-聚丙烯酰胺微凝胶（NuPAGE Novex；Invitrogen，Basel，Switzerland）上，并如前所述通过Western blotting进行分析(Hetz等人，2003年). 使用了以下抗体和稀释液：6H4抗-PrP，1:10000（Prionics，Schlieren，瑞士）；抗半胱天冬酶-12，1:2000（Exalpha Biologicals，Watertown，MA）；抗Grp78/Bip、抗Hsp60（热休克蛋白60）、抗Hps70、抗calnexin、抗Grp58和抗Grp94，1:2000（Stress-Gene，加州圣地亚哥）；和抗肌动蛋白或微管蛋白，1:2000（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。与一级抗体孵育后，在室温下将膜与稀释为1:10000的辣根过氧化物酶偶联二级抗体在洗涤缓冲液中孵育1小时。洗涤后，通过增强化学发光测定法（Amersham Biosciences，Cardiff，UK）检测特异性结合的抗体。

PrP亚细胞定位研究。评估PrP的亚细胞定位^C类用PrP-GFP表达载体瞬时转染稳定表达Grp58、Grp58siRNA或空载体的N2a细胞克隆，48h后分析GFP荧光发射。同时，如前所述，将细胞固定并用ER免疫荧光标记物染色(Leyton等人，2001年). 简而言之，将细胞固定在含有4%多聚甲醛的PBS中30分钟，并在-20°C下用冷甲醇渗透10分钟。用5%明胶封闭1小时后，随后在37°C下与抗calnexin抗体孵育细胞1小时，在PBS中洗涤三次，与罗丹明结合的二级抗体孵育，在表观荧光显微镜上进行分析。细胞核用Hoechst染色。

脱糖研究。为了分析PrP糖基化状态，用小鼠PrP表达载体瞬时转染稳定表达Grp58、Grp58siRNA或空载体的N2a细胞克隆。48小时后，在RIPA缓冲液中制备细胞提取物，并用PNGase F（肽N个-糖苷酶F）（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室），如前所述(Russelakis-Carneiro等人，2002年).

协同免疫沉淀研究。如前所述，细胞感染了落基山实验室（RML）的朊病毒(Hetz等人，2003年)并用10μ米在RIPA缓冲液中制备细胞提取物。按照制造商（Amersham Biosciences）的建议，使用抗PrP抗体6H4和蛋白A/G-Sepharose珠进行免疫沉淀。如上所述，通过Western blots评估PrP和Grp58的存在。

动物样本。在C57BL/6J小鼠的海马区立体定向注射1μl 10%的脑匀浆，该匀浆取自患有139A羊痒病的小鼠末期。如前所述，通过使用网格系统确定体重损失和肌肉力量下降，每周测量临床疾病的发病率(Soto等人，2000年). 从注射日期到临床症状持续3周的时间，定义了瘙痒潜伏期，对于本研究中使用的条件，这相当于注射后16周。为了进行Western blot分析，在感染后的不同时间处死动物，并分别解剖和分析不同的脑区。

免疫组织化学。从小鼠背侧海马取冠状切片（20μm）。切片在含有4%多聚甲醛的溶液中固定过夜，然后转移到20%蔗糖溶液中。在自由漂浮切片上进行免疫染色。使用抗神经元特异性核蛋白（NeuN）抗体对神经元进行特异性染色，并使用Vector Laboratories（Vectastain Elite ABC；Burlingame，CA）试剂和二氨基联苯胺作为染色原，用亲和素-生物素过氧化物酶进行检测。为了分析Grp58和神经元标记物的表达，将脑片与抗Grp58多克隆抗体和单克隆抗体NeuN共培养，并与FITC或罗丹明偶联的二级抗体一起培养。

钙信号。如前所述，通过使用荧光染料Fluo-4，使用荧光成像板读取器1（FLIPR1）机器（加利福尼亚州森尼维尔的分子器件）测量由刺激ER钙释放引起的细胞内钙水平的变化(Hetz等人，2003年). 简言之，细胞生长在96个涂有IV型胶原的黑板上，并以10μg/ml的最终浓度负载Fluo-4。在37°C下培养120分钟后，在FLIPR缓冲液中用不同的钙激动剂刺激细胞（以m米：150氯化钠，5氯化钾，1氯化镁₂、10 HEPES和10葡萄糖）。荧光发射每5秒量化一次，持续30分钟。

统计分析。通过参数化分析数据t吨检验（双尾），显著性表示如下：^*第页< 0.05;^**第页<0.01（见图。​图4，4,​,6).6). 当对两个以上的组进行分析时，还使用ANOVA检验来估计统计显著性。

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图4。

Grp78和Grp94是由139A羊痒病感染暂时诱导的。A类,B类，第78组(A类)和Grp94(B类)通过Western blotting测定12、16和20wpi时的表达水平，并通过密度测定法定量三种不同感染动物的条带强度。顶部，16和20 wpi的代表性Western blot分析。将Grp78和Grp94的底部平均强度与三只对照动物的相应值进行比较。以脑区和注射后周为变量进行双向方差分析，结果显示Grp78和Grp94的表达水平没有显著差异。t吨个别值的测试分析显示出一些统计上的显著差异(^*第页< 0.05;^**第页< 0.01). Cx，皮层；髋，海马；Thal，丘脑；BS，脑干。C类通过Western blotting（左）分析20 wpi时不同脑区的Calnexin、Hasp70、Hsp60和GADD153/CHOP水平，并按照A类和B类（右）。

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图6。

Grp58保护N2a细胞对抗PrP^{联合国安全理事会}毒性。A类用不同浓度的纯化PrP处理转染Grp58siRNA、模拟siRNA或全长Grp58的N2a克隆^{联合国安全理事会}48 h后通过MTS分析测定细胞活力。数据由Student’s分析t吨比较模拟转染细胞与过度表达Grp58或转染Grp58siRNA的细胞之间的差异。^*第页< 0.05;^**第页< 0.01.B类，同时，用PrP处理细胞^{联合国安全理事会}Western blot分析检测caspase-12的活性。肌动蛋白水平显示为蛋白质负荷的内部控制。C类转染Grp58siRNA、模拟siRNA或全长Grp58（OE）的N2a克隆用50 n米PrP公司^{联合国安全理事会}或800 ng/ml衣霉素48 h，通过Western blot分析测定GADD153/CHOP和肌动蛋白水平。

结果

在疾病症状前阶段，瘙痒朊病毒感染诱导Grp58上调

为了评估内质网应激对朊病毒疾病发展过程中神经元丢失的作用，我们以鼠痒病139A株为模型进行了一项时间过程实验。为了建立疾病进展的动力学，向动物海马注射1μl 139A羊痒病脑匀浆，并测定临床症状出现的时间。使用倒置烤架装置测量肌肉容量，并在注射后16周观察到肌肉无力的最初迹象(图1A类) (n个=每组8个）。这还伴随着明显的褶皱皮毛、驼背姿势和行动不便（数据未显示）。23周后，由于食物摄入困难，动物被杀死。根据这些观察结果，注射后12周（wpi）被认为是症状前阶段，而注射后16、20和23周被认为分别代表疾病的早期、晚期和晚期。

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图1。

139A小鼠瘙痒模型中的疾病进展和朊病毒繁殖。A类每组8只动物在海马内注射1μl来自正常（对照）或139A羊瘙痒感染小鼠的10%脑匀浆。肌肉力量是通过测量动物能够抓住倒置烤架的时间来确定的。数值表示倒置后1分钟内倒下的各组动物的百分比。B类Western blot分析16wpi后对照组和感染组不同脑区总PrP水平。微管蛋白水平被用作蛋白质负荷的内部控制。Cx，皮层；髋，海马；Thal，丘脑；理学学士，脑干。D、 M和N分别代表二糖基化、单糖基化和非糖基化形式的PrP。C类PrP的Western blot分析^{联合国安全理事会}在12、16和20 wpi的感染动物的PK消化脑匀浆中。显示了每组三只不同动物的结果。作为对照，正常脑匀浆用PK处理或不处理。D类，PrP的量化^{联合国安全理事会}羊瘙痒感染动物不同脑区的水平占总PrP的百分比^C类在对照动物中。PrP中的差异^{联合国安全理事会}累积具有统计学意义(第页<0.001），以脑区和注射后周为变量进行双向方差分析。

杀死四组感染和对照动物，分别为12、16、20和23 wpi，并对每只动物的大脑进行生化和组织学分析。大脑被分为海马体、皮层、脑干和丘脑。与对照动物相比，蛋白质印迹分析显示PrP总水平随着时间的推移而积累(图1B类和数据未显示）。PrP的积累与PrP单糖基化和非糖基化形式的水平增加有关(图1B类)如前所述，这是这种羊痒病菌株的一个常见特征(Russelakis-Carneiro等人，2002年). PrP水平^{联合国安全理事会}通过蛋白酶K（PK）处理后大脑匀浆的Western blot分析测定(图1C类). 在疾病症状前阶段，12 wpi时，PrP^{联合国安全理事会}在所有脑区都可以检测到，注射部位（海马体和丘脑）附近有较高水平的蛋白。随着疾病的持续进展，PrP^{联合国安全理事会}以高度可重复的动力学遍布整个大脑(图1D类).

通过使用NeuN神经元标记物的组织学分析来评估神经元损失。丘脑在20 wpi时检测到神经元丢失的第一个迹象，在疾病末期下降幅度更大（数据未显示）。如前所述，海马体和其他脑区的神经元丢失仅在疾病晚期才明显(Hetz等人，2003年). 这些数据表明，瘙痒症临床症状的出现不是由于神经元丧失，而是由于神经元功能障碍或突触改变。

我们之前已经证明，在患有CJD的人类和鼠痒病模型中，朊病毒在大脑中的复制伴随着Grp58在疾病晚期的表达增加(Yoo等人，2002年;Hetz等人，2003年). 然而，尚不清楚这种改变是疾病进展过程中的早期还是晚期事件。更精确地定义PrP传播过程中内质网应力的贡献^{联合国安全理事会}Western blot分析羊瘙痒感染过程中不同脑区Grp58的表达水平。图2，A类和B类显示，早在第一个临床症状出现前4周的12 wpi，就可以检测到Grp58的1.5倍至2倍诱导。与对照动物相比，Grp58的表达水平随着时间的推移而增加，海马体（注射部位）、皮层和丘脑中的Grp58水平较高，脑干中的Grp58水平居中(图2B类). 有趣的是，当PrP^{联合国安全理事会}用相应的数据绘制了Grp58在不同脑区和疾病期间不同时间的表达水平(图2C类; 数据来自12、16和20 wpi）。在疾病晚期（23 wpi），在海马（诱导1.5倍）和丘脑（恢复到基础水平）中观察到Grp58的表达水平下降。然而，在皮层中，Grp58的表达水平持续增加，高达9倍的诱导(图2B类). 当比较不同脑区时，疾病末期Grp58的下调与该痒病模型中神经元丢失的发生相关，因为在丘脑和海马中观察到大量神经元丢失（数据未显示）(Hetz等人，2003年).

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图2。

Grp58在139A感染动物的早期大脑中上调，并与PrP相关^{联合国安全理事会}水平。A类，第58组和PrP^{联合国安全理事会}用Western blot分析16wpi时不同脑区的水平。B类通过定量Western blot分析在疾病不同阶段采集的脑匀浆，测定Grp58的表达水平，并取三只动物的结果平均值。在注射后的不同时间，对不同的大脑区域测定来自感染动物和正常动物的Grp58信号的比率。结果代表三种不同动物的平均±SD。Grp58表达水平的差异具有统计学意义(第页<0.01），以脑区和注射后周为变量进行双向方差分析。Cx，皮层；髋，海马；Thal，丘脑；理学学士，脑干。C类、PrP水平^{联合国安全理事会}和Grp58从所述的所有脑匀浆中进行比较B类和图1E类.

作为另一种确定Grp58表达水平和分析Grp58所表达的细胞类型的方法，我们在20 wpi下对对照组和羊痒病感染动物的脑切片进行免疫荧光。与对照动物相比，刮痕感染动物的抗Grp58抗体染色更高(图3). 有趣的是，当切片用特定的神经元标记物（NeuN）双重染色时，观察到Grp58和神经元标记物的共表达，表明Grp58的诱导是神经元对朊病毒复制的反应(图3A、 B类显示放大倍数）。Grp58染色模式显示了一个离散的细胞内定位，由ER相关蛋白的典型染色组成。

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图3。

Grp58的神经表达。A类用抗Grp58（红色荧光）和抗NeuN（绿色荧光）对来自对照组和羊瘙痒感染动物的丘脑切片进行联合免疫。右侧面板显示NeuN和Grp58染色的叠加。B类，放大从感染羊瘙痒病的动物身上获得的两张照片，如中所述A类.C类，在没有初级抗体的情况下进行的对照实验。相控图显示为控制。

Grp58表达是一种保护细胞抵抗内质网应激和PrP的生存因子^{联合国安全理事会}毒性

在疾病晚期之前，在不同的脑区观察到Grp58的表达水平增加。然而，在疾病的晚期，在出现神经元死亡和胱天蛋白酶12激活的大脑区域，观察到Grp58的下调，这表明Grp58可以作为神经保护因子对朊病毒复制做出反应。Grp58在应激条件下被诱导，由ER功能的药理靶向性触发(Mazzarella等人，1994年); 然而，其参与内质网应激反应的情况尚不清楚。为了分析Grp58和朊病毒复制之间的关系，用以Grp58 mRNA为靶点的载体siRNA稳定转染N2a细胞。这些细胞被选为模型，因为它们再现了与TSE相关的几个方面，例如对PrP的敏感性^{联合国安全理事会}毒性(Hetz等人，2003年)，他们表示PrP^C类而且，它们能够维持朊病毒的复制在体外(Butler等人，1988年). 获得了几个Grp58表达完全消失的细胞系(图5A类). 在这些细胞中没有观察到Grp78、Grp94或calnexin的表达水平的改变，这表明靶向Grp58 RNA是特异性的(图5A、 B). 这一结果还表明，下调Grp58并不影响其他相关伴侣的表达，如PDI，这表明阻断Grp58表达后未观察到明显的代偿性变化。即使在用衣霉素（一种N-连接糖基化抑制剂）或布费尔丁A（一种ER-Golgi转运抑制剂）诱导内质网应激后，Grp58siRNA-转染细胞中也未检测到Grp58(图5B类). 在表达Grp58siRNA的细胞中，未观察到PrP表达内源性水平的改变（数据未显示）。

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图5。

阻断Grp58的表达会增加N2a细胞对某些形式内质网应激的敏感性。A类获得了不同的N2a亚克隆，这些亚克隆稳定地转染了针对Grp58 RNA（RNAi）、无关siRNA（mock）或Grp58表达质粒（OE）的载体siRNA。通过Western blot分析几个不同克隆中Grp58、Grp94、PDI、calnexin和actin的表达水平。B类用衣霉素（T）或布氏菌素A（B）处理后测定Grp58、Grp78和Grp94（top）的诱导水平。同时，在相同的样品中测定caspase-12的激活情况（底部）。测定肌动蛋白水平作为适当蛋白质负荷的对照。C类用不同浓度的衣霉素处理转染Grp58siRNA或模拟siRNA的三个不同克隆，48h后通过MTS分析测定细胞活力。衣霉素对Grp58siRNA细胞死亡的影响存在显著差异(第页<0.0001）与单向ANOVA分析的对模拟转染细胞的影响进行比较。D类，一个转染Grp58siRNA或模拟siRNA的代表性克隆用不同浓度的brefeldin A处理。单向方差分析发现效果显著不同(第页<0.01）。E类，用5或20 n处理同一克隆米 A23187型（A） ，thapsigargin（塔普；10μ米)或staurosporine（Sta；80 n米). 在这些实验中，根据Student’st吨测验。在所有这些研究中，数据显示了至少两个不同实验的平均值和标准差，实验分为三次进行。

先前的研究表明，Grp78和Grp94的表达对内质网应激介导的细胞凋亡具有保护作用(Liu等人，1997年;Reddy等人，1999年;Rao等人，2002年). Grp58与Grp家族的这些其他成员没有序列或功能相似性。事实上，虽然与Grp58序列同源的其他二硫键异构酶，如PDI和EndoPDI，已被证明可以防止缺血，但Grp58与凋亡之间没有直接关系(Tanaka等人，2000年;Fischer等人，2002年;Sullivan等人，2003年). 因此，我们决定测试Grp58siRNA细胞对几种不同机制诱导的内质网应激的敏感性。衣霉素通过内质网中错误折叠蛋白的积累导致内质网应激(Breckenridge等人，2003年). 如所示图5C类与mock转染细胞相比，三个不同的稳定转染克隆对衣霉素治疗更敏感。用布雷费尔丁A治疗后也观察到类似的结果(图5D类). 另一方面，由影响钙稳态的试剂，如thapsigargin（钙ATP酶抑制剂）或钙离子载体A23187引起的内质网应激，不会因Grp58表达的缺失而加剧(图5E类). 此外，在用星形孢菌素处理后，未观察到模拟转染和Grp58siRNA转染的细胞之间的差异，星形孢菌素已知可诱导线粒体凋亡途径(图5E类). 因此，Grp58似乎特别参与内质网应激途径中的凋亡保护。在这方面，有趣的是，brefeldin A和衣霉素在Grp58siRNA细胞中的毒性增加与caspase-12的激活有关，如非活性proform水平的降低所证明的那样(图5B类). 总的来说，这些数据表明Grp58的神经保护活性是caspase-12激活的上游，并由内质网应激事件（涉及该细胞器中错误折叠蛋白的积累）特别触发。

然后，我们测试了Grp58siRNA细胞或Grp58过度表达细胞对PrP的敏感性^{联合国安全理事会}毒性。如所示图6A类，Grp58siRNA-表达细胞中Grp58表达减少导致PrP毒性增加^{联合国安全理事会}而Grp58的过度表达导致对PrP的抵抗^{联合国安全理事会}例如，在50 n米PrP公司^{联合国安全理事会}尽管在过表达Grp58的细胞中未观察到明显的神经元死亡，但在Grp58缺失的神经元中，细胞死亡率大于70%。Grp58的保护活性与caspase-12活化的减少有关(图6B类). PrP后未观察到GADD153/CHOP水平的诱导^{联合国安全理事会}对照、Grp58siRNA或Grp58过度表达细胞的处理(图6C类). 然而，在用衣霉素或布雷费尔丁A处理的细胞中检测到这种促凋亡转录因子的诱导，该转录因子受Grp58表达水平的负调控，强化了Grp58具有神经保护活性的概念(图6C类和数据未显示）。因此，我们的数据表明PrP^{联合国安全理事会}引发非典型形式的内质网应激，这与典型内质网压力源（如衣霉素和布氏菌素A）的作用不同。

Grp58与PrP相互作用，但不影响其成熟过程

为了研究PrP和Grp58之间可能的相互作用，我们进行了共免疫沉淀实验。内源性PrP免疫沉淀显示Grp58与PrP在N2a细胞中共沉淀(图7A类). 此外，PrP免疫沉淀后检测到低水平的Grp78。有趣的是，当N2a细胞感染RML羊痒朊病毒时，检测到大量Grp58与PrP相关(图7A类). 由于感染细胞和非感染细胞中PrP免疫沉淀的数量相似，我们得出结论，Grp58可能在感染细胞中大量表达，或与PrP具有更高的亲和力^{联合国安全理事会}PrP和Grp78之间的相互作用不受RML羊痒病感染的影响。当蛋白酶体抑制剂环氧霉素处理野生型N2a细胞诱导错误折叠的PrP积累时，也观察到类似的结果(图7A类). 这种治疗导致内质网异常折叠的PrP积聚。

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图7。

Grp58与PrP相互作用，但不改变其成熟过程。A类、未经处理的N2a细胞（NT）、感染RML羊痒朊病毒或用5μ米用抗PrP单克隆抗体6H4裂解环氧霉素并免疫沉淀（IP）。Western blot分析Grp58和Grp78的水平。作为对照，在PrP免疫沉淀前分析总提取物中这些蛋白的水平。B类在转染Grp58siRNA、模拟siRNA或全长Grp58（Grp58 OE）的N2a克隆中瞬时表达Prp-GFP融合蛋白，并分析GFP荧光分布。C类，用50μ米brefeldin A（Bref.A）或不治疗，分析PrP分布（绿色荧光）。作为细胞内标记物，对染色的calnexin进行分析（红色荧光）。细胞核用Hoechst（蓝色荧光）染色。显示了GFP和calnexin的叠加或calnexin和Hoechst染色。D类小鼠PrP过表达，细胞提取物用PGNase F处理或不处理，PrP模式用Western blot分析。作为阳性对照，用5μg/ml衣霉素（Tunic）处理野生型细胞12小时，二糖基化；M、 单糖基化；N、 非糖基化的。

因为PrP^C类具有细胞内二硫键，评估了Grp58表达变化对PrP成熟和细胞分选过程的可能影响。PrP的表达^C类通过在Grp58siRNA、Grp58过表达或模拟转染细胞中表达PrP-GFP融合蛋白来分析细胞表面。靶向质膜的PrP不受Grp58表达水平改变的影响，因为大部分PrP在细胞表面检测到(图7B类). 在所分析的大多数细胞中，在核周分布的细胞内隔室中检测到少量PrP，这可能反映了正在合成的蛋白质的ER-Golgi定位并分选到质膜。作为对照，用灯盏花素a处理野生型N2a细胞以诱导细胞内PrP的积累。如所示图7C类，brefeldin A触发了PrP亚细胞定位的剧烈变化，观察到核周分布（与Hoechst染色相比）和与ER标记物calnexin的部分共定位(图7C类).

此外，研究了Grp58siRNA、Grp58过表达或模拟转染细胞中PrP的糖基化状态。用小鼠PrP瞬时转染细胞^C类表达式向量，以及N个-通过用PGNase处理蛋白提取物来进行PrP的脱糖基化。作为阳性对照，用衣霉素处理细胞以检测内源性未糖基化形式的PrP^C类结果表明，在PrP上添加成熟的糖基化^C类不受Grp58表达变化的影响(图7D类)表明PrP通过了ER-Golgi蛋白质量控制。

讨论

几种形式的应激改变内质网的稳态，如热休克、突变蛋白的过度表达或蛋白酶体活性的改变，可导致内质网中错误折叠蛋白的积累。这些改变触发保护性细胞反应的特异性激活，即所谓的UPR，导致ER伴侣上调，蛋白质合成普遍下降(Liu等人，1997年;Reddy等人，1999年;费里和克罗默，2001年;Rao等人，2002年). 持续的内质网应激会产生不可逆的细胞损伤，根据刺激的类型和强度，这种损伤可通过细胞凋亡或坏死导致细胞死亡。Caspase-12激活是雌激素受体依赖性细胞凋亡的分子效应器之一(Nakagawa等人，2000年). 有趣的是，caspase-12基因敲除小鼠是活的，并且在发育过程中没有表现出程序性细胞死亡的异常，这表明该途径可能主要与病理条件引起的细胞死亡有关。

在本文中，我们表明，在小鼠瘙痒症的发展过程中，内质网应激的最初迹象与Grp伴侣蛋白的上调有关，尤其是Grp58，在较小程度上，Grp78和Grp94。Grp58的诱导与不同脑区朊病毒复制的动力学直接相关，表明Grp58上调是由朊病毒的复制诱导的一种特异性细胞反应体内caspase-12激活和神经元丢失仅在疾病晚期和晚期检测到。这些观察首次建立了朊病毒复制与内质网应激介导的凋亡之间的时空关系。以前曾描述过，在受散发性和变异性CJD影响的个体的大脑中，以及在疾病晚期的小鼠瘙痒症中，半胱氨酸蛋白酶-12的激活和Grps的上调(Yoo等人，2002年;Hetz等人，2003年). 我们的数据排除了在朊病毒疾病患者中描述的内质网应激反应是一种与疾病进展后期大量神经元损失相关的副现象的可能性。此外，我们的发现表明内质网应激是朊病毒复制的主要反应体内最近在逆转录病毒诱导的海绵状变性的实验系统中也进行了类似的观察，该模型在神经病理学上与TSE相关(Dimcheff等人，2003a). 然而，在我们的羊瘙痒模型中观察到的内质网应激反应似乎是这类疾病特有的，因为并没有观察到内质网胁迫诱导的所有共同特征，例如GADD153/CHOP、热休克蛋白和钙调素诱导。

一般来说，ER伴侣的诱导与应激后细胞死亡的保护有关(Liu等人，1997年;Reddy等人，1999年;Tanaka等人，2000年;Fischer等人，2002年;Rao等人，2002年;Sullivan等人，2003年). 在这方面，我们的数据表明PrP^{联合国安全理事会}被细胞识别为压力因子。ER伴侣可能与PrP的去除有关^{联合国安全理事会}通过纠正错误折叠的蛋白质或促进其移位到细胞质中进行蛋白酶体降解。在通过ER-Golgi合成和成熟的过程中，野生型和突变型PrP分子的这种机制已被广泛描述（有关综述，请参阅Dimcheff等人，2003a); 然而，它还没有被提出与该疾病的传染性形式有关。

为了分析Grp58在朊病毒感染反应中的作用，我们研究了Grp58不同表达水平对PrP的影响^{联合国安全理事会}-诱导毒性在体外siRNA-介导的Grp58敲除增加了N2a细胞对PrP治疗的敏感性^{联合国安全理事会}而蛋白的过度表达可以显著保护细胞抵抗PrP^{联合国安全理事会}毒性。此外，在Grp58siRNA细胞中，暴露于PrP后，观察到caspase-12的激活增加^{联合国安全理事会}表明Grp58是保护神经元抵抗PrP的关键生存因子^{联合国安全理事会}毒性。在用其他试剂处理Grp58siRNA细胞后也进行了类似的观察，这些试剂可以促进ER中错误折叠蛋白的积累。另一方面，钙稳态扰动引起的ER应激对Grp58的表达水平不敏感。

Grp78/Bip和Grp94对钙的高容量和低亲和力导致这些伴侣作为“钙缓冲物”，从而防止钙稳态的改变(Michalak等人，2002年). 对Grp58一级结构的分析表明，其C末端区域不包含假定的钙结合域，这在其他二硫键异构酶（如PDI和EndoPDI）中观察到，并且被认为可以防止钙介导的损伤，如缺血[关于排列，请参见Sullivan等人(2003)]. 最近的一篇文章表明，Grp58对ER-calcium-ATPase介导的钙振荡活性产生负调节作用爪蟾卵母细胞(李和卡马乔，2004). 以前有人认为PrP诱导内质网应激^{联合国安全理事会}治疗可以通过信号传导进行，这取决于细胞器中钙的释放(Hetz等人，2003年). 然而，我们观察到，在神经母细胞瘤细胞中，用thapsigargin、A23187或组胺刺激内质网钙释放在Grp58siRNA或Grp58过度表达细胞中不受干扰（数据未显示）。此外，PrP^{联合国安全理事会}与BAPTA AM的细胞内钙螯合并不能阻止毒性（数据未显示）。因此，这些数据表明，PrP^{联合国安全理事会}诱导内质网应激更为复杂。我们可以推测一个模型，其中PrP^{联合国安全理事会}可能与细胞表面受体相互作用并被转运到内质网并自行诱导内质网应激。这种机制已被描述为细菌毒素，如霍乱毒素，与质膜中的脂筏结构结合，然后通过内吞作用进入内质网(Sandvig和van Deurs，2002年). 有趣的是，PDI与霍乱毒素致病作用的调节有关(蔡和拉波波特，2002年). 此外，研究表明，在感染羊痒病的神经母细胞瘤细胞中，高尔基体-ER或内体-Golgi之间细胞内转运的改变增加了PrP^{联合国安全理事会}形成(Beranger等人，2002年)打开了PrP的可能性^{联合国安全理事会}可以到达ER并被Grp58识别。在这个意义上，我们观察到PrP和Grp58相互作用，如免疫沉淀实验所示。令人惊讶的是，这种相互作用在感染RML朊病毒的细胞或用蛋白酶体抑制剂处理的细胞中增加。这些数据表明Grp58可能优先与异常折叠的PrP结合。这种相互作用的亚细胞定位还有待确定。Grp58是为数不多的在质膜中表现出活性的伴侣蛋白之一，它位于脂质筏中并与N个-糖基化蛋白质(Turano等人，2002年). 有趣的是，PrP是一个N个-含有一个分子内二硫键的糖基化蛋白质，也主要位于脂筏结构中(Vey等人，1996年).

Grp58是Grp家族的一员，因为它能够被葡萄糖剥夺诱导，但不是因为它与其他成员（如Grp78或Grp94）的结构/功能关系，而这些成员与PDI活性无关。Grp58活性在主要组织相容性复合体I类组装中的功能以及通过STAT（信号转导和转录激活物）途径进行的信号转导调节中具有广泛的特征(Turano等人，2002年)但迄今为止，其在内质网应激反应中的作用一直是推测性的。我们的发现首次描述了Grp58对细胞凋亡的保护作用。Grp58是一种具有二硫键异构酶活性的伴侣蛋白。影响二硫键形成的条件，如DTT处理，有利于未糖基化PrP的形成(Capellia等人，1999年)，一种更容易转换为PrP的形式^{联合国安全理事会}此外，DTT处理诱导PrP采用某些PrP^{联合国安全理事会}-类似特性，如抗蛋白酶K性和不溶于非变性洗涤剂(Ma和Lindquist，1999年). 这些数据表明，影响二硫键稳定性的因素可能会影响朊病毒的复制。对这一假设的额外支持来自实验，实验表明在体外PrP放大^{联合国安全理事会}取决于自由巯基的存在(Lucassen等人，2003年). 最后，半胱氨酸桥从分子内形式到分子间形式的重组被认为对PrP转化和错误折叠蛋白聚集体的稳定起到了作用(Tompa等人，2002年). 这些发现表明Grp58对PrP的保护作用^{联合国安全理事会}神经毒性可能由两种蛋白质之间的直接相互作用介导，导致PrP降低^{联合国安全理事会}折叠错误。我们目前正在培育敲除和过表达Grp58的转基因动物，以分析PrP的进展^{联合国安全理事会}复制与神经毒性体内我们的研究结果表明，Grp58的诱导与朊病毒复制触发的细胞反应直接相关，并表明该蛋白的药理诱导可能对蛋白质错误折叠导致内质网应激和细胞死亡的朊病毒相关疾病具有临床益处。

脚注

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