突触标记和交叉标记：蛋白激酶Mζ在维持长时程增强而非长时程抑制中的作用

摘要

介绍

长期增强（LTP）和长期抑郁（LTD）被认为是学习和记忆的生理模型(马蒂斯，1989年;布利斯和柯林里奇，1993年;马伦卡，1994年). 这两种形式的突触可塑性都有早期和晚期的特征，后者依赖于蛋白质翻译(Krug等人，1984年; Frey等人。，1988,1996;Otani等人，1989年;Nguyen和Kandel，1996年;Manahan-Vaughan等人，2000年). 新合成的蛋白质如何与表达LTP或LTD的特定激活突触相互作用，而不是与不活动突触相互影响，这是被认为对记忆至关重要的突触特异性的基础。解释这种特异性的一个假设是“突触标记”，即新合成的可塑性相关蛋白（PRPs）与最近增强的“标记”突触相互作用（Frey和Morris，1997,1998). 这一假设解释了强直破伤风如何在一条途径中产生蛋白质合成依赖性LTP（晚期LTP），延长正常情况下只产生早期LTP的独立弱破伤风途径中的增强。最近，突触标记模型已经扩展到包括LTP和LTD之间的相互作用，称为“交叉标记”(Sajikumar和Frey，2004年). 在交叉标记中，一个突触输入中的晚期LTP/LTD将独立输入中与蛋白质合成相关的早期LTD/LTP转化为其长期形式(Sajikumar和Frey，2004年). 交叉标记不仅扩大了通路之间相互作用的范围，而且提出了一个基本问题，即新合成的PRP的功能是普遍延长弱刺激的作用，还是有单独的PRP专门延长增强或抑制。

由于我们对突触标记所涉及的特定分子缺乏了解，因此无法阐明突触标记的分子机制。许多信号转导分子与LTP（如蛋白激酶）或LTD（磷酸酶）的诱导有关(马林卡，1994年;马伦卡和熊，2004年). 然而，突触标记很可能涉及突触获得维持的分子机制，而这些机制的特征不如诱导机制。

蛋白激酶C（PKC）与LTP的维持有关(Lovinger等人，1987年;马利诺等人，1988年;雷曼等人，1988年). 具体来说，一种不寻常的、自主活性的PKC亚型，称为蛋白激酶Mζ（PKMζ），对于维持LTP是必要的，也是足够的(Sacktor等人，1993年;Ling等人，2002年). PKC由一个N端调控域和一个C端催化域组成，其中包含一个自抑制假底物序列和第二信使结合位点(西冢，1995). PKC通常通过这两个结构域之间的相互作用而保持在非活性的基础状态。第二信使通过结合调节域激活PKC，并引起构象变化，从而暂时释放自动抑制。

相反，PKM由一个独立的PKC催化域组成，该催化域缺乏PKC的自主抑制调节域，具有自主活性(施瓦茨，1993年). 在大脑中，只有一种同工酶非典型ζ形成稳定的PKM(Sacktor等人，1993年). 在LTP中，通过增加PKMζmRNA的翻译，通过新的蛋白质合成增加PKMξ，产生独立的ζ催化结构域(Hernandez等人，2003年). PKMζ的持续活性持续数小时增强AMPA受体（AMPA-R）反应，从而维持LTP(Ling等人，2002年;Serrano等人，2005年).

一些研究小组推测PKMζ可能参与突触标记(Drier等人，2002年,Martin和Kosik，2002年;Hegde，2004年). 我们假设PKMζ可能起到PRP的作用，因为它表现出三个关键性质：（1）PKMξ是通过强韧化而非弱韧化新合成的(Osten等人，1996年)，（2）激酶的突触后全细胞灌注足以增强AMPA-R介导的突触传递(Ling等人，2002年)和（3）抑制激酶活性可逆转晚期LTP(Serrano等人，2005年). 在这里，我们研究了PKMζ在突触标记期间的功能。我们发现PKMζ在突触标记和交叉标记中都起着关键作用，并且该激酶代表LTP特异性PRP。

材料和方法

如前所述，我们使用130只雄性Wistar大鼠（7周龄）制备的130个横向海马切片（400μm）（Frey和Morris，1997,1998; 萨吉库马尔和弗雷，2003,2004). 用一根金属棒（颈部脱臼）猛击颈部后部，迅速杀死动物，然后将其斩首（整个过程耗时约3-5分钟）。切片在32°C的界面室中孵育；培养基[人工脑脊液（ACSF）]含有以下成分（单位：m米)：124氯化钠，4.9氯化钾，1.2千赫₂人事军官₄，2.0硫酸镁₄，2.0氯化钙₂，24.6氯化钠_三, 10d日-葡萄糖；耗碳量，18L/h；ACSF的流速为0.74 ml/min。在所有实验中，两个单极涂漆不锈钢电极（5 MΩ；A-M Systems，Carlsborg，WA）位于CA1区域的放射层内，用于刺激两个独立的突触输入S1和S2（参见图1一). 为了记录场EPSP（测量为其斜率函数）和群体峰振幅（PS），将两个电极（5 MΩ；A-M系统）分别放置在单个神经元群体的CA1树突层和细胞体层，并通过定制放大器放大信号。使用剑桥电子设计（英国剑桥）1401模数转换器对信号进行数字化，并使用定制软件（PWIN；莱布尼茨神经生物学研究所）进行分析。切片预孵育至少4小时，这对于可靠长期记录晚期LTP和晚期LTD至关重要（有关更多详细信息，请参阅Sajikumar和Frey，2004年).

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图1。

PKMζ抑制对LTP维持和突触标记的影响。一，LTP后期。上图是一个横向海马切片，显示了电极的位置。显示了两个独立的突触输入S1和S2对相同神经元群的作用，以及群体峰振幅和场EPSP的记录位置，以及作为代表性示例的模拟记录轨迹。该图表明，使用高频刺激（HFS）诱导S1（STET；填充圆圈）晚期LTP导致晚期LTP，与控制输入S2（开放圆圈；n个= 8;第页< 0.05;U型测试）。S2的控制刺激在所研究的时间过程中表现出相对稳定的电位。b条，PKMζ的抑制逆转LTP维持。晚期LTP的诱导(n个=7）通过将HFS应用于S1（填充圆圈）和应用肉豆蔻酰化ζ-假底物肽抑制剂（1μ米; 黑条）1h后逆转LTP的晚期，而控制通路S2的电位在整个8h的记录期内保持稳定（开环）。c（c），PKMζ的抑制逆转标记突触的晚期LTP维持。在S1中诱导晚期LTP（实心圆圈），然后通过WTET在S2中诱导早期LTP（空心圆圈），随后在WTET后30分钟对S2施用myr ZIP（1μ米; 黑条；n个=7），如图所示。STET后210分钟S1的LTP逆转至基线水平，WTET后120分钟S2的增强达到预转换基线值(n个= 7;第页< 0.05; Wilcoxon试验）。d日，scr-myr-ZIP对突触标记（1μ米). S1（填充圆）的晚期LTP在8.5小时内保持稳定，S2（开放圆）观察到突触标记。与预转化水平相比，S1晚期LTP诱导的S2早期到晚期LTP的转化维持了8小时(n个= 4).e（电子）,（f），早期LTP。S1弱破伤风诱导的早期LTP（充满圆圈）显示出持续135分钟的短暂增强（与控制输入S2相比e（电子）;n个= 5;第页< 0.05;U型测试）。诱导早期LTP后对PKMζ的抑制作用(（f）;n个=5）显示两个输入的时间过程与未经药物治疗的对照组相似[与对照输入S2（开环）相比，S1（填充环）的早期LTP维持135分钟；第页< 0.05;U型测试]。模拟记录道代表输入S1强碱化前30分钟（实线）、强碱化后30分钟（阴影线）和强碱化（虚线）后8小时的典型野外EPSP，如果S2也强碱化，则表示该输入强碱化之前或之后的EPSP。箭头表示强韧化的时间点。横线表示药物使用的时间。误差条代表平均值±SEM。

在预孵育期后，确定每个输入的测试刺激强度，以在所有控制和LTD诱导输入和LTP诱导输入中诱发其最大振幅的40%的群体峰值，并在25%的群体峰值。对于刺激，使用了双相恒流脉冲。晚期LTD是使用900次强低频刺激协议（SLFS）诱发的[一次脉冲由三次20 Hz的刺激组成；脉冲间隔为1s（即。，（f）=1 Hz）；刺激持续时间，每半波0.2毫秒；刺激总数，2700]。这种刺激模式产生了稳定的晚期LTD体外至少8小时（Sajikumar和Frey，2003,2004). 在研究LTD弱诱导的实验中，使用弱低频刺激协议（WLFS）诱导短暂早期LTD，该协议由900个频率为1 Hz的脉冲组成，脉冲持续时间为每半波0.2 ms，总刺激次数为900。使用三个100脉冲的刺激序列诱导晚期LTP[强破伤风（STET），100 Hz；持续时间，每极0.2毫秒，间隔10分钟]。使用由一个100 Hz序列（21个双相恒流脉冲；每半波0.2 ms脉冲持续时间；强直刺激强度，PS阈值）组成的弱强直协议（WTET）诱导早期LTP。在线监测种群峰值振幅和场EPSP斜率。为了清楚起见，只显示了现场EPSP数据，因为两个记录的参数在实验中显示了相似的时间进程，除了在LTD期间消除了群体峰值的情况。在LTP/LTD诱导之前，基线记录了至少60分钟；使用四个0.2 Hz双相恒流脉冲（每极0.1 ms）进行基线记录，并在破伤风后1、3、5、11、15、21、25和30 min或LFS后21、25、30 min进行测试，此后每15 min至8 h进行一次。

肉豆蔻酰化ζ-假底物肽（myr-ZIP；myr-SIYRRGARRWRKL-OH；Biosource，Camarillo，CA）和加扰控制肽（scr-myr-ZIP；myr-RLYRKRIWRSAGR-OH；Biosource）(Laudanna等人，1998年)以蒸馏水作为储备溶液（10 m）制备米)并储存在-20°C。最终浓度为1μ米在浴前立即溶解在ACSF中。myr-ZIP对PKMζ的作用是传统PKCα的142倍，对PKMξ的作用则是cAMP依赖性蛋白激酶的196倍【Ling等人描述的分析】(2002)].

当在一组或Mann-Whitney组内进行比较时，使用Wilcoxon符号秩检验对每个时间点的总体峰值振幅（以毫伏为单位测量）的平均值和场EPSP的斜率函数（以毫秒为单位）进行统计分析U型当数据在各组之间进行比较时进行测试；第页<0.05被认为具有统计学显著差异。数据如所示图2，d日和e（电子）、和图3，一和e（电子），部分平行进行，并由Sajikumar和Frey最初描述的附加实验完成(2004).

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图2。

PKMζ抑制对LTD维持和突触标记的影响。一，Late LTD。与控制输入S2（开环；n个= 7;第页< 0.05;U型测试）。b条，使用与中相同的协议诱导的晚期LTD一当myr-ZIP（1μ米;n个=7）在诱导1小时后进行浴处理（填充圆圈）。c（c）,d日在myr-ZIP的影响下，在LTD期间进行Synaptic标记。c（c）表示S1的SLFS（实心圆圈）之后，S2的WLFS（开放圆圈）以及随后应用myr-ZIP后，现场EPSP的时间进程(n个= 5). 无论myr-ZIP对PKMζ活性的阻断如何，该方案都会导致突触标记（即S2早期LTD向晚期LTD的转化）。d日表示LTD期间未经药物治疗的突触标记对照系列(n个= 10).e（电子）,（f），Early有限公司。e（电子），WLFS（虚线箭头；n个=10）持续185分钟（与控制输入S2相比；U型测试；第页< 0.05;n个= 6).（f），当myr-ZIP在诱导1小时后施用时，早期LTD未受影响。控制S2的刺激e（电子）和（f）在所研究的时间过程中显示出相对稳定的电位（开圈）。模拟记录道代表输入S1低频刺激前30分钟（实线）、后30分钟（阴影线）和后8小时（虚线）的典型现场EPSP，如果S2也接受了LTD诱导刺激，则在该输入LFS之前或之后。虚线箭头表示相应突触输入的弱或强低频刺激。横线表示药物使用的时间。误差条代表平均值±SEM。

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图3。

PKMζ抑制对突触交叉标记的影响。一晚期LTP将交叉标记的早期LTD突触转化为持久性LTD。30分钟后，STET在S1（填充圆）诱导晚期LTP，然后在S2（开放圆）诱导WLFS。这里，S2中早期的LTD被转换为晚期的LTD，证明LTP和LTD之间存在突触交叉标记(n个= 7).b条，在S1的tetanization之前2小时至之后2小时的myr ZIP的浴敷防止了LTP和LTD的诱导(n个= 7). S1（填充圆圈）高频刺激强直；30分钟后，对S2（开环）应用WLFS诱导早期LTD。c（c），与中的实验相似b条但使用了非活性的杂化肽（1μm）代替myr-ZIP(n个= 8). 未观察到对LTP、LTD诱导或交叉标记的影响。d日PKMζ抑制不影响晚期LTP与交叉标记早期LTD突触的相互作用，从而建立晚期LTD。交叉标记后，在诱导1 h后应用myr-ZIP逆转S1晚期LTP的维持（填充圆圈）；尽管如此，S2的早期LTD（开放圈）还是被转换为晚期LTD，而不考虑S1的晚期LTP的封锁(n个= 7).e（电子），交叉标记早期LTP突触的Late-LTD转化。SLFS诱导S1（填充圆）晚期LTD，1小时后在S2（开放圆；n个= 7). 这里，S2的早期LTP转化为晚期LTP，显示LTD和LTP之间的突触交叉标记。（f），PKMζ抑制阻断LTD的诱导，随后是LTP的诱导。与中的类似实验b条但以相反的方式(n个=7）[即，S1具有晚期LTD诱导（填充圆）和S2具有早期LTP（开放圆）]。克PKMζ抑制阻止交叉标记突触LTP的维持。实验类似于e（电子）但随后应用了myr-ZIP。myr-ZIP阻止了晚期LTD突触（填充圆圈）与交叉标记LTP突触相互作用并延长其维持时间的能力，揭示了强直化5小时后S2（开放圆圈）早期LTP，随后出现长期抑郁（与强直化前的基线值相比；n个= 7;第页< 0.05; Wilcoxon试验）。小时，scr-myr-ZIP（1μ米)对交叉标记没有影响(n个=4）[即，S2（开放圆）中的早期LTP通过之前S1（填充圆）中晚期LTD的归纳转化为晚期LTP]。模拟记录道和符号类似于图1误差条代表平均值±SEM。

结果

讨论

突触标记为表征新合成的延长突触强度功能变化的蛋白质可能作用于最近激活的特定突触的机制提供了概念基础。尽管自1997年Frey和Morris（Frey and Morris，1997,1998;考德勒和坎德尔，2000年;Barco等人，2002年;杜德克和菲尔德，2002年;马丁，2002;Fonseca等人，2004年;Kelleher等人，2004年;Navakkode等人，2004年;O'Carroll和Morris，2004年;Sajikumar和Frey，2004年)，几乎没有直接参与标记过程的核心分子被鉴定出来。我们现在发现突触标签和PKC持续活性亚型PKMζ之间的相互作用对于弱增强突触转变为持续增强突触至关重要。我们的结果扩展了之前关于PKMζ在LTP晚期的关键作用的观察，特别是在探索交叉标记中，证明了新合成PRP的作用具有意想不到的特异性。

我们首先确认了Ling等人的工作(2002)和Serrano等人(2005)显示PKMζ在LTP晚期维持中的特殊作用。我们在强直1小时后应用低剂量PKMζ选择性抑制剂myr-ZIP，观察到海马脑片内同时记录到的增强反应逆转，而非基线非特异性突触传递逆转。此外，与PKMζ在LTP维持中的作用一致，药物的洗脱并没有导致恢复到增强反应，而是在4小时后的非常晚期阶段，使增强输入低于基线水平的轻度、延迟但持久的抑制。我们可以排除兴奋性的非特异性变化。这表明，除了增强突触外，强直化还可能导致一些通常被掩盖的突触出现抑郁，但现在我们的实验显示，当myr-ZIP特异性逆转了增强作用时。另外，强直化可能会部分破坏维持基线突触反应的机制。PKMζ磷酸化增强AMPA-R介导的突触传递(Ling等人，2002年)结果表明，AMPA-R功能在LTD期间减弱（Carroll等人。，1999;Hirai，2001年;Gutlerner等人，2002年). 因此，通过破伤风化合成的PKMζ活性持续增加，可能会维持增强的AMPA反应，以及部分特定于激活途径的基线反应。之前已经注意到强直作用导致轻度抑郁的能力，这种抑郁被增强作用掩盖或破坏基线反应的稳定性(赫拉贝托娃和萨克特，2000年).

有趣的是，在强直期间和之后应用PKMζ抑制剂myr-ZIP时，未观察到低于基线的晚期抑郁(图3b条). 这表明PKMζ可能具有双重作用：（1）在诱导过程中，它可能参与失稳过程，从而允许可塑性；（2）在维持过程中，对增强突触强度具有指导意义。此处观察到LTP诱导阻滞(图3b条)似乎比Serrano等人报告的强度更大(2005). 然而，在我们的研究中，中等刺激强度下用于诱导LTP的三列，10分钟的脑间间隔，比Serrano等人使用的最大刺激强度下的四列，5分钟的脑内间隔要弱一些(2005). 这得到了观察结果的支持，即我们最初的早期LTP比基线高出约150%（设定为100%），而在Serrano等人的工作中(2005)为～175-200%。塞拉诺等人（Serrano et al(2005)可能导致了更长的myr-ZIP独立响应。此外，PKMζ在诱导中的作用可能与突触变化的方向无关，因为myr-ZIP也阻断了LTD的诱导(图3（f）). 相反，PKMζ在维持增强作用中的作用似乎非常特殊（见下文）。

接下来，我们研究了PKMζ在突触标记中的作用，并观察到标记突触的增强持续依赖于PKMξ的持续活性，因为其增强的后期被myr-ZIP逆转。因为PKMζ直接导致LTP后期的突触增强(Ling等人，2002年;Serrano等人，2005年)，因为PKMζ是在强直刺激下合成的，但不是弱刺激(Osten等人，1996年)，对我们的结果最简单的解释是，新合成的PKMζ是一种PRP，在弱激活的标记突触上保持增强（图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 有趣的是，产生PKMζ的mRNA出现在海马锥体神经元的胞体和树突中(Muslimov等人，2004年). 需要进一步研究以确定新合成的PKMζ蛋白的来源，该蛋白在标记的突触上保持增强作用。

本研究中使用的低剂量myr-ZIP（1μ米)足以逆转突触标记和交叉标记的时间窗期间LTP的维持（Frey和Morris，1997,1998;Ling等人，2002年;Sajikumar和Frey，2004年;Serrano等人，2005年). 有趣的是，剂量稍高（2.5-5μ米)需要在以后逆转已建立的晚期LTP，并完全阻断全细胞灌注PKMζ对AMPA-R介导的突触传递的增强作用(Serrano等人，2005年). 由于myr-ZIP是一种竞争性底物，这表明PKMζ可能在标记发生的关键过渡期磷酸化另一种额外底物。我们推测这种底物可能是增效特异性标签复合物的一种成分（见下文）。

将PKMζ注入CA1锥体细胞的全细胞灌注也足以导致细胞内最多（如果不是全部）谷氨酸能突触的持续增强，这表明在这些条件下增强不需要突触标签。对这种明显差异的最简单解释是，在LTP期间，PKMζ的合成量是有限的，突触标记（以其增强特异形式）是“捕获”激酶所需的高亲和力结合位点。相反，通过记录吸管对PKMζ进行全细胞灌注，即使在使用的低纳米摩尔浓度下，也可能提供丰富的酶源，从而无需标记。

PKMζ的抑制不影响基线反应，这意味着，在我们的实验操作之前，没有突触被激酶持续增强。如果PKMζ对内存存储很重要，这可能会令人惊讶体内一种可能性是，在我们的实验中使用的笼养动物的新体验相对缺乏，海马体中较旧记忆的存储可能已经减少，而大脑中的其他地方仍在保留。另外，海马脑片的制备可能消除了先前增强的证据，可能是谷氨酸释放的结果(Fiala等人，2003年)或程序触发的后续体内平衡机制(Kirov等人，1999年)或PRP（如PKMζ）的半衰期可能缩短至2小时(Sajikumar和Frey，2004年).

与PKMζ和突触标记相关的其他假设是，先前存在的激酶可能参与标记过程，或者新合成的PKMζ可能作为其他下游蛋白或对持续增强很重要的信使核糖核酸的标记。因为最近的研究表明，PKMζ通过调节受体的运输来增加突触后AMPA-Rs的数量，从而增强突触传递(Ling等人，2004年)LTP的分子机制可能需要多个水平的标记。此外，与突触可塑性相关的其他过程，包括翻译、可能的转录和结构变化，可能受到持续的PKMζ磷酸化的调节。

PKMζ的作用是维持增强作用的特异性。与它在LTP维持中的重要作用相比，我们没有观察到PKMζ对LTD维持的任何影响，因为应用myr-ZIP并没有逆转LTD的早期或晚期。我们的交叉标记结果为PKMζ的功能特异性提供了额外证据。我们之前假设过(Sajikumar和Frey，2004年)晚期LTP或晚期LTD的诱导导致PRP池的合成。当时，我们提出这些PRP可以是一种蛋白质，也可以是几种不同的蛋白质(Kelleher等人，2004年;Sajikumar和Frey，2004年). 在LTP和LTD建立后，我们的新交叉标记数据（PKMζ被抑制）支持了这样一个假设，即后期塑性形成会启动不同且确实是特定于过程的PRP的合成。我们首先表明，尽管晚期LTP在PKMζ抑制的影响下受到抑制(图3d日)尽管如此，第二个输入中的早期LTD仍被转换为晚期LTD，因为早期LTD的诱导不能启动PRP的合成，但会设置其过程特异性突触标签(Sajikumar和Frey，2004年)，这些标记捕获的PRP必须由单独突触输入中的强强直化启动，即使晚期LTP被myr-ZIP抑制。这证实了除PKMζ之外的PRP介导了LTD早期到晚期的转变。

此外，在相反的实验中(图3克)myr-ZIP的应用虽然不影响强LTD的维持，但阻止了弱增强突触转化为持续增强突触。这表明PKMζ在LTD晚期合成，但可能通过磷酸化作用，仅与弱增强突触的标记发生功能性相互作用（图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 这些结果还表明，PKMζ是持续性LTP的基础，即使输入中突触效能的持续增强是通过显著不同的刺激范式获得的。

因此，PKMζ是第一个LTP特异性PRP。因此，我们扩展了合成相对非特异性PRP库的假设(Sajikumar和Frey，2004年)PRP包括过程特异性蛋白质。该库由LTP或LTD的特异性PRP以及过程非特异性蛋白质组成，例如4B3型磷酸二酯酶，我们最近已经证明了其在LTP和LTD中的作用(艾哈迈德和弗雷，2003年;Ahmed等人，2004年;Navakkode等人，2004年)，由酶的激活水平决定。总之，我们的结果表明，过程特异性标签不仅由复杂的分子机制组成(弗雷和莫里斯，1998年;Sajikumar和Frey，2004年)，但PRP也代表通过与这些过程特异性标记复合物的选择性相互作用来表达其效应器作用的蛋白质库（图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 需要进一步的工作来确定增强特异性标记的哪些分子与PKMζ相互作用。

脚注

工具书类