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基因组生物学。2019; 20: 171.
2019年8月26日在线发布。 数字对象标识：10.1186/s13059-019-1776-2
预防性维修识别码：PMC6709553型
PMID：31446895

CRISPR-Cas9方法用于产生条件小鼠等位基因的重复性：一项多中心评估

Channabasavaiah B.古鲁穆蒂,通讯作者1,2 艾丹·奥布莱恩,三，47 罗伦·M·夸德罗斯,1 约翰·亚当斯,4 皮拉尔·阿尔凯德,5 Shinya Ayabe公司,6 乔纳森·巴拉德,4 苏林德·巴特拉,7 玛丽·克劳德·波尚,8 凯萨琳·A·贝克尔,9 纪尧姆·贝尔纳斯,10 大卫·布劳,11 弗朗西斯科·卡里略-萨利纳斯,5 韦斯利陈,8 陈汉英,12 鲁比·道森,13 维多利亚·德曼布罗,9 Jinke D'Hont公司,14,15 凯瑟琳·迪布,16 詹姆斯·欧迪,17 林甘,18 京高,47 艾米·冈萨雷斯,4 Anyonya R.Guntur公司,9 郭惠平,4 唐纳德·哈姆斯,1 安妮·哈林顿,9 凯瑟琳·亨特格斯,19 尼尔·汉弗莱斯,20 Shiho Imai村,21 石井秀史,22 岩岛美穗,6 埃里克·乔纳什,23 米歇尔·卡洛拉克,9 伯纳德·基夫尼,24 奈基钦,47 小野正美,25 小谷由子,26 Yayoi Kunihiro先生,26 伊玛亚瓦兰班·拉克什曼南,7 凯瑟琳·拉罗谢尔,27 凯瑟琳·劳伦斯,11 林莉（Lin Li）,28 沃尔卡德·林德纳,9 刘贤德,23 格洛丽亚·洛佩斯·卡斯特金,29 安德鲁·劳登,30 詹娜·洛伊,47 洛迪·杰罗姆·马杰夫斯卡,8 松下太极,21 三浦裕美,31,32 宫崎骏,26 本杰明·莫普戈,4 凯瑟琳·莫蒂尔,9 中岛友一,33 Nakade先生,6 中岛俊一,6 中岛贤一,6 Yuichi Obata先生,6 萨纳·奥吉瓦拉,34 玛丽埃特·乌埃莱,10 莱夫·奥克斯堡,9,35 桑德拉·皮尔茨,13 伊尔卡·平兹,9 穆尔西·波努萨米,7 大卫·雷,36 罗纳德·雷德,17 克利福德·J·罗森,9 妮姬·罗斯,47 马克·T·鲁赫,37 拉里萨·里佐娃,9 安妮·萨尔瓦多,5 萨布丽娜·沙明·阿拉姆,8 Radislav Sedlacek公司,38 卡兰·夏尔马,39 鼓手,23 凯特里安·斯塔斯,14,15 洛拉·斯塔尔斯,47 杉山富美弘,40 佐托鲁·高桥,40 田中富弘,41 安德鲁·斯特拉福德,16 Yoshihiro Uno先生,26 利恩·范霍特,14,15 弗雷德里克·范洛根（Frederique Vanrockeghem）,14,15 布兰登·J·威利斯,37 克里斯蒂安·赖特,42 山内育子,26 辛毅（Xin Yi）,41 Kazuto Yoshimi先生,26 张雪松,23 于章,28 大冢正人,31,32 萨蒂亚布拉塔·达斯,43 丹尼尔·J·加里,44,45 蒂诺·霍奇皮德,14,15 保罗·托马斯,13 扬·帕克尔·桑伯格,23 安东尼·亚当森,20 吉崎松司,6 Jean-Francois Schmouth牛仔裤,10 安德烈·戈洛夫科,4 威廉·汤普森,42 K.C.肯特·劳埃德,37,45 约书亚·A·伍德,37 米特拉·考恩,46 Tomoji Mashimo先生,26 水野正也（Seiya Mizuno）,40 朱浩,28 彼得·卡帕雷克,38 露西·利奥,9 约瑟夫·米亚诺,18和盖坦·布尔吉奥通讯作者47
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补充资料
数据可用性声明

摘要

背景

CRISPR-Cas9基因编辑技术促进了敲除小鼠的产生，为繁琐耗时的传统胚胎干细胞方法提供了一种替代方法。早期的一项研究报告称，通过微量注射2个单导向RNA（sgRNA）和2个单链寡核苷酸作为供体，产生条件敲除（cKO或floxed）等位基因的效率高达16%（本文称为“双单或floxing”方法）。

结果

我们从世界各地20个实验室组成的联合体中重新评估了双因素方法。该数据集包括56个遗传位点、17887个合子和1718只活生小鼠，其中只有15只（0.87%）小鼠含有cKO等位基因。我们对数据集进行了统计分析和机器学习算法，结果表明，所分析的所有因素都无法预测此方法的成功。我们测试了一些新的方法，这些方法在18个基因座上使用一个供体DNA，而两个或多个基因座的方法无法产生cKO等位基因。我们发现，单施主方法的效率是双施主方法10到20倍。

结论

我们认为双声子方法缺乏效率，因为它依赖于两个同时发生的重组事件顺式这一结果与随之而来的不受欢迎的编辑事件相比相形见绌。使用一个供体DNA的方法相当有效，因为它们只依赖一个重组事件，并且在没有意外突变事件的情况下正确插入供体盒的概率要高得多。因此，单供体方法为常规生成cKO动物模型提供了更高的效率。

电子辅助材料

本文的在线版本（10.1186/s13059-019-1776-2）包含补充材料，可供授权用户使用。

关键词：CRISPR-Cas9，小鼠，转基因，同源定向修复，条件敲除小鼠，Floxed等位基因，寡核苷酸，长单链DNA，机器学习，再现性

背景

通过敲除小鼠等位基因在模型生物体中的基因失活，为基因功能和疾病的机制提供了宝贵的见解[1]. 然而，成功分析敲除（KO）基因在成年模型生物体中的表型影响仍然是一个重要挑战，因为小鼠中超过30%的基因对发育至关重要，删除后会导致胚胎死亡或新生儿亚存活[2]. 为了克服基因敲除模型中的致死表型，出现了条件敲除（cKO）策略[三]. cKO模型通常涉及插入LoxP公司内含子中位于关键外显子/s两侧的位点，或（不太常见）位于基因间区域或启动子和增强子等调控区域的两侧。当与Cre公司表达重组酶的驱动小鼠，Cre酶识别LoxP公司序列并删除干预序列。这导致靶基因仅在细胞中功能性失活Cre公司表达并能够靶向DNA[三]. 以前，要生产KO或cKO小鼠，需要使用基于胚胎干细胞的同源重组以及胚胎操作、显微注射和辅助生殖技术（ART）[4]. 这些技术建立于20世纪80年代，目前仍被用作金标准方法。基于这项技术，大规模的工作，如敲除鼠标项目（KOMP）[5]和欧洲条件小鼠突变（EUCOMM）计划[6]设计了数千种靶向结构，并为90%以上的编码基因生成了改良的ES细胞克隆。使用ES细胞克隆，大约25%的小鼠基因已经转化为cKO小鼠，所有这些都可以在公共仓库中随时获得[7].

最近出现的基因组编辑技术，如ZFN、TALENs和CRISPR-Cas9，可以在基因组中产生精确的双链断裂，通过将试剂直接注射到小鼠受精卵中，提高了基因靶向的效率，大大促进了基因工程动物模型的生成[8]. 2类CRISPR系统通过简单生成的嵌合单引导RNA（sgRNA）靶向在DNA中产生精确的双链断裂，并已成为最常用的基因编辑核酸内切酶系统。在修复模板的指导下，双链断裂导致容易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复或同源定向修复（HDR）[9,10]. 在早期的研究中，目标定位的成功率很高（16%）LoxP公司中的站点顺式据报道，使用两个sgRNAs和两个单链寡核苷酸（ssODN）LoxP公司靶向关键外显子两侧的位点（本文称为“二次浮选法”）（图1) [11].

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创建cKO等位基因的两次浮选方法示意图。一显示假想基因外显子3、4和5的野生型位点，其中外显子4被选为插入的目标外显子LoxP公司地点。指南1和2分别以内含子3和4为目标。b两次浮选法Cas9源的CRISPR成分。c（c）将CRISPR组分导入受精卵的方法（微注射或电穿孔）。d日显示靶外显子（#4）的cKO等位基因具有侧翼LoxP公司地点

我们在这里描述了一个由世界各地20个转基因核心设施和项目组成的联盟所做的全球社区努力，以评估产生cKO等位基因的双基因方法的效率，并将其与最近描述的使用长单链或双链DNA供体或“第二基因供体”的方法进行比较LoxP公司插入下一代”方法。

结果

条件等位基因的产生机械2基因使用二次浮选法

我们试图重现一个针对机械2基因，使用二次浮选法产生浮选等位基因的位点效率为16%[11]. 我们使用了原始报告中描述的相同sgRNAs和ssODN[11]. 澳大利亚澳大利亚国立大学（ANU）、美国内布拉斯加州大学医学中心（UNMC）和捷克共和国捷克表型基因组学中心（IMG）的三个独立中心对C57BL/6N近交系小鼠进行了这些实验。将微量注射的合子培养成囊胚，通过基因分型PCR和Sanger测序分析基因组DNA（表1). 使用10 ng/μl Cas9 mRNA、10 ng/微升体外转录sgRNA和10 ng/微米ssODN的浓度混合液，我们没有观察到成功的靶向作用（即正确插入两个LoxP公司中的站点顺式-配置），即使两种sgRNAs都能裂解靶DNAindels指数或集成LoxP公司位于所需位置，从13%到33%不等（表1).

表1

编辑的胚泡摘要机械2来自三个不同中心的基因

注射Zygotes囊胚基因型目标明确错误瞄准5′站点（%）错误瞄准3′站点（%）
澳大利亚国立大学10651011indels指数和6LoxP公司正确插入（33%）6indels指数和1LoxP公司正确插入（13%）
美国内布拉斯加州大学医学中心8070014indels指数和1LoxP公司正确插入（21%）21indels指数(30%)
捷克共和国捷克表型基因组学中心（BIOCEV/IMG）402808indels指数和1LoxP公司正确插入（32%）5indels指数(18%)

有趣的是，我们注意到在LoxP公司表明目标位点发生非法修复事件或商业合成供体DNA引起错误的位点。成功瞄准两个目标的频率LoxP公司地点顺式此前报道为16%[11]我们未能复制。

使用二次浮选法产生条件等位基因的全球调查

为了更好地评估两个供体杂交方法在其他基因座上的效率，我们评估了来自澳大利亚、比利时、日本、美国、英国、捷克共和国和加拿大的20个机构联盟的小鼠基因组中的56个额外基因座（附加文件1：表S1）。这项研究不是预先设计的，相反，它构成了许多实验室进行的实验的数据，这些实验室试图使用两个供体的漂浮方法来生成cKO小鼠模型。值得注意的是，由于原始方法中描述的实验条件没有产生理想的效率，我们联盟中的实验室进一步修改了实验条件，试图提高其效率。我们报告了这些实验室的此类数据汇编，因此，它自然代表了“真实情况”，因为它构成了许多未事先计划的不同特征。因此，该数据集提供了一个机会来研究许多不同参数对方法效率的影响。

该联合体的两人浮选数据是通过一项调查收集的，调查人员被要求在excel电子表格文件中输入实验的各种参数的详细信息。为了方便显示大型数据集，我们将单个电子表格中的信息拆分为3个较小的电子表格。这些数据和结果显示为附加文件1：表S1，附加文件2：表S2和附加文件三：表S3，结果的总体总结见附加文件4：表S4。在17887个合子中（17557个微注射和330个电穿孔；详见下文），12764个（71.4%）合子通过手术转移到受体雌性体内。受体雌性产下1718只幼崽（9.6%的微注射/电穿孔合子），其中只有15只幼崽子（0.87%）含有漂浮等位基因。

影响二次浮选结果的因素分析

这个庞大的数据集使我们能够分析影响两次浮选法结果的各种因素。这些因素包括不同的小鼠菌株、基因座的性质（必需基因与非必需基因）、两个引导者之间的距离、不同的递送方式（微注射或电穿孔）、不同的试剂格式、不同的药剂浓度、，以及指导测试实践中的差异（一些实验室预先测试指导RNA，而一些实验室没有）。大多数项目是在C57BL/6J背景下执行的（39个），而18个项目使用C57BL/6N背景，另外3个项目使用混合鼠标背景（B6C3HF1、B6SJLF1、FVBCD1F1）。我们数据的统计分析（Fisher精确检验，第页 = 0.74）未发现应变背景对方法效率的任何影响。根据小鼠基因组数据库，在56个靶基因座（49个微注射和7个电穿孔）中，21个基因根据纯合子敲除小鼠早期胚胎或出生后的致死率被列为必需基因http://www.informatics.jax.org[12]. 据报道，在56个基因座中，有18个基因座之前的靶向缺失产生了可存活到成年的纯合子小鼠，17个基因座的无效突变的后果尚不清楚。总之，这表明假定的必需靶基因和非必需靶基因之间的重配频率相等（Fisher精确检验，第页 = 0.76). 使用先前发布的机器学习方法预测小鼠的基因重要性[13]，我们确认了数据集中基本基因和非基本基因的频率相等（Fisher精确检验，第页 = 0.99）sgRNA之间的距离从250 bp到1.1 Mb不等，中位数为2 Kb。整个基因或调控基因组区域的单个外显子（附加文件1：表S1）被浮起。我们研究了sgRNA之间的距离是否对两次浮选法成功的可能性至关重要。我们未能在数据集中找到此类证据（Kruskal-Wallis秩和检验，chi-squared=32，第页 = 0.42），尽管样本量太小，无法得出结论（科恩效应量d日 = 0.40，功率1-beta=0.27）。在56个位点中，49个位点被微注射（附加文件2：表S2）和7个基因座被电穿孔（附加文件三：表S3）。在具有53个独立设计的49个基因座的微注射合子中，单独将更多的合子微注射到原核（26/53）而不是细胞质（10/53）或原核和细胞质（17/53）（Fischer精确检验第页 = 0.004），这与目前大多数转基因核心设施的做法一致（图2a） ●●●●。使用了不同形式的CRISPR试剂（合成或体外转录的sgRNA、Cas9 mRNA或Cas9蛋白，或sgRNA-和Cas9表达质粒）（附加文件1：表S1）。大多数项目使用不同浓度的体外转录mRNA（35/59），Cas9 mRNA的浓度从10到100 ng/μl不等（图2b） 以及10至50 ng/μl sgRNA。以10至200 ng/μl的浓度输送ssODN。在18个实例中，Cas9以蛋白质的形式递送，浓度为10至75 ng/μl。67%（61对中的41对）的sgRNAs在受精卵注射前进行了体外切割试验。我们发现受试和未受试sgRNA集之间的编辑效率没有差异[5′指南：Kruskal-Wallis秩和检验，chi-squared=0.004，第页 = 0.94; 3′指南：Kruskal-Wallis秩和检验，chi-squared=0.2，第页 = 0.65]. 有趣的是，对于6个位点，Cas9和sgRNAs以嵌合sgRNA-SpCas9质粒（pX330）的形式以5 ng/μl的浓度传递。我们试图确定试剂传递的形式，如质粒、核糖核蛋白（RNP）或mRNA，是否会影响使用二次浮选法靶向的总体效率。我们没有找到这样的证据（费希尔精确测试第页 = 1).

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定量评估两次浮选法的成功。一报告中心使用的传递CRISPR试剂的合子注射方法（原核、细胞质或两者）。数字表示微注射或电穿孔的合子总数的百分比。b传递到合子的CRISPR试剂（mRNA、蛋白质或质粒）的形式。数字表示百分比。c（c）成功编辑的等位基因数和正确数LoxP公司从显微注射和转移的受精卵中活产幼崽总数中插入。数字表示绝对数。d日从25个基因座的子样本中对活产幼崽进行基因分型，观察到编辑类型。数字表示绝对值

最近，合子电穿孔已被发展成为产生敲除、点突变、标记或条件等位基因的有效方法[14–20]. 从我们的联合体中，三个实验室和项目调查了该方法成功的可能性。对于调查的七个基因座，我们发现成功地插入了一个LoxP公司等位基因（附加文件三：表S3）。相比之下，我们注意到大量缺失和indels指数（高达39%的大型删除）表明编辑成功。然而，没有一个基因座显示两个LoxP公司插入的站点顺式在后代中，这表明通过电穿孔递送CRISPR试剂在从两个供体的floxing方法获得所需结果方面没有统计学差异，尽管可以操作的大量胚胎允许回收非常少量的正确靶向的等位基因。

接下来，我们假设，使用二次浮选法成功产生浮选等位基因可能取决于以下因素：（i）sgRNA效率，（ii）同时性LoxP公司插入，或（iii）Cas9、sgRNA和ssODN试剂的浓度。为了深入了解这些可能性，我们进一步分析了56个基因座的数据（附加文件2：表S2，附加文件三：表S3）。注意，54个基因座的后代在出生后阶段进行了分析（附加文件2：表S2，附加文件三：表S3），而在胚泡期分析了2个基因座（附加文件三：表S3）。在某些情况下，对基因座进行进一步分析，以评估引导裂解活性。在1684只创始人老鼠中，676只（40%）进行了编辑活动。273只老鼠（16%）表现出某种编辑(indels指数和/或替代），并且225（13%）和180（11%）只小鼠携带一个LoxP公司两个解理位点之间的插入或缺失（图2c） ●●●●。对25/56个基因座的小鼠进行进一步的编辑事件评估，包括大的缺失（图2c） ●●●●。在分析的487只创始人小鼠（来自这25个基因座）中，219只（45%）203只（41%）、52只（10.7%）和2.7%的样本没有编辑，indels指数，单个LoxP公司插入或大删除（图2d） ●●●●。从分析的1684只动物中，只有15只小鼠（0.87%）被正确定位为完整的目标LoxP公司中的站点顺式-配置（附加文件2：表S2）。在56个位点中，只有11个位点成功定位（19.6%）。产生1只正确靶向动物所需的平均合子数为1192。这些基因的重要性对二次或二次浮选成功的可能性没有影响（费希尔精确检验，胚胎或出生后致死的靶向成功率为4/23，活纯合小鼠为5/18，未知胚胎或出生后致死的靶点成功率为2/15第页 = 0.27). 我们还从我们的数据中注意到，在分析的56个位点中，14%的位点在Cas9裂解的2个靶位点之间出现缺失。我们还注意到单一LoxP公司插入超过20%的小鼠基因型（来自所有基因座），以及一些反式-LoxP公司插入（在不同的等位基因上，降低了正确插入LoxP公司现场）（图三). 因此，我们假设这种方法的成功取决于sgRNA的综合效率和LoxP公司在两个站点插入以启用两个顺式HDR事件同时发生。为了评估这一假设，我们进行了广义线性回归分析，以建模Cas9、sgRNA浓度、sgRNA切割效率、LoxP公司插入和频率LoxP公司插入，两人浮选法的成功是一个积极的结果。分析总结见表2.效率LoxP公司在5′和3′位点的插入似乎是两次浮选法成功可能性的最佳预测因子，占总方差的80%以上。然而，该预测因子在我们的线性回归模型中并不显著。其他预测因子，如sgRNA效率或5′或3′插入的效率LoxP公司解释了大约15%的总方差，但这些预测因子在我们的模型中都不显著。Cas9 mRNA的浓度占总方差的0.1%以下，但具有统计学意义(第页 < 0.01）作为二次浮选法成功的预测因子。然而，两次浮选法的成功与Cas9 mRNA浓度的增加略有关联(第页2皮尔逊=0.27，第页 = 0.08). 根据我们的分析，成功的LoxP公司在中插入顺式太小，无法明确排除任何其他预测因素（科恩效应大小d日 = 0.4，功率1-β=0.41）。我们推论出，只有在LoxP公司观察到的插入事件可以更好地预测这种方法成功的可能性（即使这些插入没有顺式-配置）。为了验证这一点，我们只对那些含有LoxP公司位点，并排除缺失的位点LoxP公司在任一导向裂解位点插入。我们确定了28个这样的基因座（共56个基因座）。我们没有发现与之前所有基因座的分析预测结果有任何差异（数据未显示）。总之，这些结果表明，两个同时发生的重组事件似乎是产生两个漂浮等位基因的最佳预测因子顺式; 虽然较高的Cas9 mRNA浓度似乎是另一个预测因素，但其影响微乎其微。

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二次浮选法的预期结果和不良结果。 a-f型显示假想基因外显子3、4和5的野生型位点，其中外显子4被选为插入的目标外显子LoxP公司地点。 一期望的结果显示一个漂浮的等位基因。总发生率<1%。b–（f）各种意外结果，仅包括一种LoxP公司场地插入(b)，仅限indels指数在一个或两个站点创建(c（c）)，组合LoxP公司插入和indels指数(d日)，两个解理位点之间的缺失(e（电子）)，没有吲哚或无插入事件(（f）)

表2

广义回归分析确定预测2-sgRNA 2-ssODN方法成功的因素

估算标准误差t吨价值第页价值
拦截− 0.140.150.910.37
5′sgRNA的效率0.190.230.840.4
3′sgRNA的效率− 0.310.22− 1.360.18
5′LoxP公司插入0.010.920.0170.98
3′LoxP公司插入0.010.380.270.79
5′LoxP公司× 3′LoxP公司插入4.052.321.740.09
Cas9 mRNA浓度0.0040.0021.920.06*
Cas9蛋白浓度0.00030.0030.10.91
SgRNA浓度− 0.0020.002− 1.120.27
ssODN浓度0.0020.0010.1321
距离− 0.00001< 0.0001− 1.280.21

***第页 < 0.01, *第页 < 0.05

为了进一步确定供体ssODN的核苷酸组成、ssODN长度或试剂浓度等因素是否可以解释这种方法的成功，我们对所有正确或错误定位的位点应用了机器学习算法（随机森林）[21]. 通过自举聚合对机器学习模型进行交叉验证（也称为“带外误差”），我们没有发现这种方法的成功与试剂浓度之间有任何关联(第页值=0.84），5′和3′ssODN供体长度（分别为第页值为0.21和0.18）或目标位点的核苷酸组成。总的来说，当包括ssODN供体长度、靶位点的核苷酸组成和试剂浓度时，我们观察到该模型的性能较低，“异常估计值”为0.222。总之，回归评估与机器学习分析相结合，无法明确识别导致两人浮选法效率低下的任何特定因素。

微量注射技术因素对双供体浮选法结果的影响

因为微量注射是小鼠基因组编辑实验中最关键的步骤之一，我们假设这种方法的效率可能取决于执行微量注射的技术人员的技能。如果技能影响结果（例如成功浮选等位基因），我们将能够确定实验室之间的差异。我们通过计算实验室作为预测值与阳性结果（成功固定等位基因）之间的相关性来评估这一参数。我们没有发现任何证据表明“技能”影响阳性结果（Kruskal-Wallis秩和检验，chi-squared=22，第页 = 0.16).

作为对显微注射技能效应的独立分析，我们从我们的联盟中收集了另一种类型的大型数据集（使用一个ssODN供体创建敲除模型），用于衡量我们联盟中技术人员的显微注射技能。参与本研究的20个实验室（包括仅测试机械2基因座）在建立单ssODN供体敲除模型方面有近90%的成功率；在330个基因座中，有293个成功，携带所需敲除等位基因的活生小鼠的总效率为13%（附加文件5：表S5），表明参与研究的所有实验室都有足够的微注射技能，可以使用CRISPR工具创建模型。因此，在20个参与的实验室中，使用两次或两次浮选法未能成功产生浮选等位基因，并不是因为缺乏CRISPR试剂的受精卵微注射技术技能。

评估产生条件等位基因的其他方法的效率

近年来，利用单供体DNA产生条件等位基因的其他几种方法被描述，例如容易-CRISPR（利用ssDNA插入进行有效添加-CRISPR）或CLICK（利用lssDNA诱导cKO等位基因的CRISRP）或基于双链DNA（dsDNA）的方法[17,22,23]. 我们假设，两次浮选法效率较低的原因之一可能是它需要两个重组事件（每个重组事件都独立地受到突变事件的影响），而“单供体DNA”方法只需要一个重组事件。为了验证这一假设，我们使用了一个供体DNA方法，即在几个基因座中生成一个条件等位基因，而这些基因座最初使用两次浮选法失败。在61个独立的靶向项目（针对56个位点）中，48个项目在两人法中失败。然后使用长单链DNA供体方法重复了其中9个项目（其中4个是容易-CRISPR方法，5个使用CLICK方法），2个使用dsDNA供体方法的项目，1个使用传统ES细胞靶向的项目。值得注意的是，所有的单捐赠者方法都成功地产生了漂浮的等位基因（附加文件6：表S6）。在使用Easi-CRISPR、CLICK或dsDNA方法的11个项目中，我们发现平均成功率为18.3%±13%，中位数为13.2%，这相当于两次浮选法（Kolmogorov-Smirnov检验）的平均改进20倍第页值<10−5). 我们研究了平均18.3%的成功率是否是由于sgRNAs的较高切割效率所致。我们对5′和3′波导劈裂效率的分析（通过计算indel或LoxP公司插入事件）表明情况并非如此（Mann-WhitneyU型使用相应的第页值0.43和1表明，编辑效率的差异并不是这些方法之间成功率差异的原因）。

两次浮选法和使用单捐赠者DNA的方法在效率上存在巨大差异的一个可能解释是，后者只需要一次重组事件，而两次浮选方法依赖于两次重组事件发生在顺式如果这个假设是真的，我们应该观察到这些方法在3′和5′位点同时插入的频率上的差异。为了确定这个假设，我们比较了同时插入LoxP公司对于Easi-CRISPR、CLICK或dsDNA传递和二次浮选法，3′和5′位点确实存在差异（6±20%二次浮选vs 76±27%其他方法；曼·希特尼U型测试W公司 = 1,第页值=4.7×10−5)证实了我们的假设。

最近报道了对双供体漂浮方法的两种修改。第一个修改涉及插入第二个LoxP公司通过将试剂第二次注射到来源于第一次注射的小鼠系的合子中来定位，所述第一次注射仅包含两种中的一种LoxP公司插入[24]. 我们将此方法称为“第二种LoxP公司插入下一代。”第二个修改包括引入LoxP公司同一合子中两个不同间隔的位点；第一个在1细胞期，第二个在2细胞期[25]. 我们将此方法称为“连续交付LoxP公司网站。”我们使用“第二个LoxP公司插入下一代”（附加文件6：表S6）方法，所有这些都导致了floxed等位基因的成功生成。我们发现，第一次和第二次的效率分别为14±6%和27±32%LoxP公司插入实验表明，仅插入一个时重组的频率要高得多LoxP公司被视为单独的事件。换句话说，“一个捐赠者”插入事件（单个事件）的效率显著高于两个捐赠人插入的综合效率。尽管这种方法需要将近一年的时间才能完成，但该方法最终以与“单捐赠者方法”（如Easi-CRISPR、CLICK或dsDNA传递）等效的效率生成漂浮的等位基因。我们还在三个新基因座上测试了“顺序递送法”，即上述两次浮选法的第二次修改，但没有产生条件等位基因（附加文件7：表S7）。我们注意到，我们只测试了微注射给药模式，以评估顺序给药方法。考虑到电穿孔被认为是一种不太苛刻的方法（因为在连续两轮引入试剂后，它保持了足够合理的合子活力），我们建议可能需要在其他位点进一步评估该方法，以得出其效率的结论。

讨论

CRISPR-Cas9技术极大地促进了含有敲除或敲除等位基因的小鼠系的产生[26,27]. 然而，使用传统ES细胞和CRISPR-Cas9基因编辑技术生成条件等位基因仍然是一个挑战。以前的一份报告显示，使用两个嵌合sgRNAs和两个单链寡核苷酸（此处称为双单浮选法）在小鼠中产生条件等位基因的效率为16%[11].

为了评估二次浮选法的效率，我们重复了初始报告中描述的实验机械2（10） 在三个实验室使用相同的实验方法生成sgRNA和Cas9，并与ssODN供体一起微注射到小鼠受精卵中。虽然我们观察到单身LoxP公司站点插入和茚在切割位点，该方法未能成功插入两个LoxP公司站点位于顺式这些结果促使我们对全球转基因研究界使用这种方法常规生成cKO模型的经验进行了调查。20个转基因核心设施或大型敲除小鼠中心参与了该联盟，为56个基因座和17000多个微注射或电穿孔合子提供了数据。与第一份报告中观察到的16%的效率相比[11]来自该联盟的大型数据集表明，该方法的效率低于1%，并且该方法通常会产生一系列不希望出现的编辑事件，其发生率几乎是正确插入这两个事件的100倍LoxP公司中的站点顺式。这些结果与之前的报告相比较，表明在成功率方面存在重大差异，在携带两个LoxP公司网站插入顺式是否通过微量注射交付[22,25,28–30]或通过电穿孔[25]. 我们和其他人也注意到DNA断裂后靶位点出现大量缺失[22].

什么决定了两次浮选法的成功？

因为我们的数据集代表了由不同实验条件组成的“真实情况”，它实际上提供了一个机会来研究几个不同参数对方法效率的影响。我们分析的因素包括CRISPR试剂格式；试剂浓度，无论指南是否预先测试；靶位点的核苷酸组成；基因座的性质（致命或非致命）；两个导向解理位点之间的距离；所用小鼠品系；微注射技术人员技能；以及实验室/现场因素。我们的统计和机器学习分析表明，这些因素都不能解释这种方法效率低下的原因。一种可能的解释是，该方法依赖于两个重组事件，导致两个供体成功插入同一染色体DNA，而这种事件的概率（在众多其他组合事件中）变得非常低。我们使用单捐赠者DNA方法（参见“二次浮选法的替代方法有哪些?” 列表部分），效率提高10到20倍。这支持了我们的假设，即使用单供体DNA方法时发生的一次重组事件比使用双供体DNA方式时需要的两次同时重组事件具有更好的效率.这引发了一个相关的问题：如果LoxP公司插入的内容彼此相距很远（例如，相隔几千到100千字节）？在这种情况下，因为两个重组事件彼此相距足够远，它们是否会以类似于彼此靠近时的方式对彼此的效率产生负面影响？一项研究报告称，当他们将LoxP公司地点足够远，研究包括6个位点[31]. The distances between theLoxP公司插入位点（和插入效率）分别为361kb（5%）、4kb（2.5%）、205kb（18%）、1.6kb（8%）、348kb（0%）和7kb（%）。我们在数据中没有发现证据表明LoxP公司尽管我们的样本量太小，无法正式排除这个假设，但相隔数千个碱基的站点将提供更高的效率。

二次浮选法有哪些替代方法？

在过去的2-3年中，有报道称，一些策略为低效的两次浮选法提供了潜在的替代方案。这些较新的方法使用单DNA供体格式，包括长单链DNA、线性双链DNA或环状双链DNA（质粒）。第一组替代方法利用长单链DNA作为供体；该方法的一种基于微注射的方法被命名为容易-CRISPR（ssDNA插入的高效添加-CRISPR）[23,32]一种基于电穿孔的方法被命名为CLICK（带有lssDNA诱导cKO等位基因的CRISPR）[17]. 的效率容易-创造条件等位基因的CRISPR范围为8.5%至18%，中位数为13%（在以前的出版物中，七个不同位点的CRISRP范围为8.5至100%[23,32]). CLICK方法使用三个基因座（有四次独立尝试）进行验证，效率范围为3.7至16.6%，中位数为11%。沿着“单供体DNA方法”的路线，已经报道了使用两种版本的双链DNA供体的方法，其中一种使用线性和环形dsDNA。一种称为Tild-CRISPR（与线性化dsDNA-CRISPR靶向整合）的方法使用长dsDNA作为供体，两个位点的效率分别为18.8%和33.3%[33]. dsDNA供体的第二个版本是利用环状dsDNA分子（质粒）插入的方法LoxP公司三个位点的原核微注射效率为1.5%至5.9%[22]在我们的数据集中，两个基因座分别占20%和22%。

我们使用最近开发的替代方法，如“第二种LoxP公司在下一代方法中插入“使用单面LoxP公司插入第一次注射的模型并重新注射第二面LoxP公司供体进入由它们衍生的合子。所有项目均以21%的平均效率成功产生了条件等位基因。第二种方法使用“顺序交付LoxP公司位点”分别在1细胞和2细胞阶段将每个引导RNA ssODN集引入相同的合子中。尽管样本量太小，无法对该技术的效率做出任何结论，但我们未能为三个尝试基因座生成cKO等位基因。总的来说，我们的研究结果表明，较新的方法，特别是那些使用单一供体DNA方法的方法，似乎是两个供体的漂浮方法的优越替代品。

基于这些结果，我们提出以下建议。尽管使用二次浮选法可以获得cKO等位基因，但由于效率低，该方法可能不适合作为常规生成cKO小鼠模型的首选。新的方法，尤其是那些使用长DNA供体（ssDNA或dsDNA）的方法，为常规生成cKO动物模型提供了更高的效率。

基于CRISPR的研究方法的再现性

利用CRISPR-Cas系统的基因组编辑工具改变了许多生物医学研究领域，因为它们为许多强大的研究方法做出了贡献。虽然许多已发表的方法都是可复制的（其广泛使用证明了这一点），但研究界在复制某些已发表方法时经常会遇到问题。这可能是因为最初的“概念验证”论文在演示该方法时使用了一些不足的研究，其结果可能是一个例外，而不是规则。我们的社区努力利用了来自多中心转基因小鼠核心设施和研究实验室的专业知识和丰富数据，从而能够评估以前发布的cKO小鼠等位基因生成方法的集体经验。我们的结论和推荐的可重复和有效的基因组编辑方法将减少资源浪费，包括动物生命。我们的工作证明了对影响较大研究群体的方法进行关键重新评估的重要性。像这样的研究是至关重要的，其中收集了有关已发表方法的更大社区经验，并对大型数据集进行了批判性分析，以提出最佳实践建议，尤其是随着CRISPR-Cas9技术在基础研究和最终进入临床的应用都在不断增长。

结论

综上所述，我们发现二元浮选法在以下情况下存在固有偏差indels指数或双链断裂处的替换，导向裂解位点之间的缺失，或反式-插入LoxP公司地点。尽管使用二次浮选法不可能获得cKO等位基因，但由于其效率很低（生成1只正确靶向动物需要约1200个受精卵），该方法可能不适合常规生成cKO小鼠模型。该方法需要两个同时发生的HDR事件，我们发现这种结果很少发生（<1%），并且在切割位点受到意料之外的基因组编辑事件的影响。较新的方法，尤其是那些使用长DNA供体（ssDNA或dsDNA）的方法，提供了更高的效率，因此更适合常规生成cKO动物模型。

材料和方法

道德声明

根据美国国家卫生研究院、国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）的指南或实践规范，所有实验均由美国动物护理与使用机构委员会和澳大利亚、比利时、捷克共和国、日本、西班牙和英国伦理委员会批准在澳大利亚，英国1986年动物（科学程序）法案，或教育、文化、体育、科学技术部（MEXT），日本卫生、劳动和福利部（MHLW），捷克共和国动物福利中央委员会（CCAW），加拿大动物护理委员会（CCAC），比利时皇家比利时（佛兰德斯）医学院的《国家道德规范》，以及所有欧洲学院的《欧洲科研诚信行为准则》。

机械2利用CRISPR-Cas9进行基因靶向

机械2左单嵌合导向RNA（sgRNA）5′-CCCAGGATAGAGTATCCTA-3′和机械2右sgRNA 5′-AGGAGTGAGGTCTAGTAGTACTT-3′的设计如Yang等人所述[11]. 超分子寡核苷酸（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA）是根据T7启动子的序列设计的，用于体外转录、DNA靶区和嵌合RNA序列。每个靶序列的互补寡核苷酸在95°C下退火5分钟，使用PCR机器（BioRad T100）将温度降低0.20°C/s至16°C，然后用作sgRNA合成模板。使用HiScribe™T7快速高产RNA合成试剂盒（新英格兰生物实验室）合成sgRNAs。Cas9 mRNA从Life Technologies获得，或从Addgene仓库获得的Chimeric pX330-U6-Chimeric-BB-CBh-hSpCas9表达质粒（plasmid 42230；Feng Zhang实验室捐赠）体外转录。鉴于Yang等人浮选实验中使用的CRISPR试剂浓度缺乏详细信息[11]，我们选择10 ng/μl sgRNA、10 ng/微升Cas9 mRNA和10 ng/微米ssODN作为机械2内布拉斯加州大学转基因核心实验室的三个实验室中，第一个实验室在所有12个基因座上进行了基于这些浓度的高效ssODN插入的浮选实验机械2进行了复制实验。然后在另外两个实验室（一个在澳大利亚，一个在捷克共和国）重复相同浓度（10:10:10 ng/μl）的实验。

SgRNA设计

SgRNAs的设计使用了可用的在线工具，如CRISPOR、Chop-Chop或CCTop[34,35]. SgRNAs被克隆到pX330中并在体外转录[27,36,37]，或合成并退火[38]. 购买Cas9 mRNA或蛋白，体外转录或内部纯化。Cas9蛋白与sgRNA或crRNA复合反式-激活crRNA[39]然后在微量注射之前与ssODN混合。Cas9蛋白或mRNA、sgRNA的浓度和注射部位以及每个位点的模板修复在附加文件中指出1：表S1。

小鼠饲养、受精卵显微注射和电穿孔

小鼠从各种来源购买，并在特定的无病条件下饲养。小鼠保持在12/12小时光周期下，并随意提供食物和水。对3～5周龄雌性大鼠进行超排卵，先腹腔注射孕马血清促性腺激素（5IU），48小时后再腹腔注射人绒毛膜促性腺素激素（5UU）。超排卵雌性与8至20周龄的雄性交配。第二天对交配的雌性进行安乐死，并从其输卵管中采集受精卵。在倒置显微镜下，使用相关的微操作器和微注射装置进行细胞质或原核注射。胚胎的电穿孔是用电穿孔装置进行的，电穿孔装置使用试管或1mm板电极，参数如下：30-V方波脉冲，间隔100-ms，使用BioRad电穿孔装置或四个穿孔脉冲（40V，3.5ms，间隔50ms，10%电压衰减+极性），然后使用NEPA21电穿孔装置进行五到六个传输脉冲（5 V，50 ms，间隔50 ms，40%电压衰减，交替+和−极性）。微注射或电穿孔合子要么通过手术转移到假孕母鼠的壶腹中，要么在37°C下培养过夜，然后在2细胞发育阶段进行手术转移。

基因分型

作为一种常规做法，在所有研究中心，首先通过PCR分析基因组DNA，以确定含有这两种基因的小鼠LoxP公司地点。如果基因分型没有发现与细胞大小相对应的移位带，则这些动物被宣布为阴性LoxP公司（34个基点）。根据制造商的说明，使用DNA提取试剂盒，对从15天以上的小白鼠幼崽身上采集的耳钉或尾尖进行DNA提取。引物被设计用于放大包含整合LoxP公司顺序。在标准PCR条件下，使用Taq聚合酶进行PCR。然后根据制造商的说明，使用ExoSAP-IT1或PCR清洁系统试剂盒对PCR产物进行纯化。在核心设施中进行Sanger测序。要识别LoxP公司作为所有中心的常规做法，插入时分别放大两个目标位点，以寻找放大子大小的增加，如果LoxP公司站点已成功插入。如果LoxP公司在第一组PCR分析中未观察到插入，样本被宣布为阴性LoxP公司插入，在许多这样的情况下，样品没有被进一步分析（因为项目的最终目标，即产生floxed等位基因，没有实现）。在某些情况下，还对这些样本进行测序以评估indels指数了解向导是否成功地切割了目标位置。在某些情况下，对包含两个导向裂解位点的整个区域进行扩增，以评估裂解位点之间的缺失。

机器学习建模

我们使用Python准备数据集来建模随机森林[21]分类模型。这要求为每个目标分配一个二进制标签，即0或1。我们包括了附加文件中的每个目标2：表S2共有54个样本（49个独特位点）。由于成功率相对较低，我们将数据分为“积极”和“消极”两类。为此，我们使用了附加文件中的“正确定位”列2：表S2。我们将一个或多个成功编辑的目标分配给阳性，将零个成功编辑目标分配给阴性。这导致12例阳性，42例阴性。

然后，我们为数据集生成了一个特征矩阵。这是数据集的表示，其格式适合使用随机森林算法建模，其中矩阵中的每一行表示一个目标。这涉及将属性从目标转换为数字表示。例如，我们将DNA序列AAATC转换为[A:0.6，T:0.2，C:0.2，G:0]。然而，除了单核苷酸比例外，我们还包括二核苷酸比例（即AA、AT、CT）。我们对附加文件中的每个序列（5′引导RNA、3′引导RNA，5′供体序列和3′供体顺序）执行此操作1：表S1。我们还包括每个靶点的5′和3′供体序列的长度。

利用标签和特征矩阵，我们使用scikit-learn训练了一个随机森林模型[40]. 我们使用默认参数训练模型。然而，由于类不平衡（1s与0s的数量较少），我们指示算法使用自定义的“class_weights”参数。

为了量化模型的性能，我们利用了随机森林的带外误差特性。该值是在训练期间生成的，方法是使用训练该树时未包含的样本（通过引导）评估随机森林模型中的每个“树”。我们观察到OOB错误为0.222。最后，我们可以使用随机森林模型的“feature_importances_”属性来识别重要特征。

GitHub存储库中提供了源代码https://gist.github.com/aydun1/932f526867f7f8139b8e8eae7c76e866和Zenododoi:10.5281/Zenodo.3339039，根据麻省理工学院许可证。

统计

为了确定比例之间的统计差异，我们进行了Fisher精确检验或Kruskal-Wallis和秩检验或Kolmogorov-Smirnov检验。为了节省开支，我们表演了一个Mann WhitneyU型测试。以二次浮选法的成功作为响应，进行了广义线性模型计算。预测变量为sgRNA的效率；概率LoxP公司5′和3′（5′）中的插入_LoxP公司和3′_LoxP公司); 同时插入两个LoxP公司位置（5′之间的相互作用_洛克普和3′_LoxP公司); Cas9 mRNA、蛋白质、质粒和ssODN浓度；以及远端和近端靶点之间的距离。通过计算方差-方差矩阵的对角线来确定每个预测值的方差。使用科恩效应大小来确定效应大小和II型误差d日统计和功率计算。所有统计分析均使用Rstudio v1.1.423进行。结果被认为具有统计学意义第页 < 0.05.

其他文件

附加文件1：（30K，xlsx）

表S1。本研究报告了指导RNA和单链寡核苷酸DNA序列、它们的浓度和漂浮的基因组区域的长度（单位：bp）。（XLSX 29 kb）

附加文件2：（22K，xlsx）

表S2。通过微注射对49个独特位点进行二次浮选的结果。（XLSX 21 kb）

附加文件3：（12K，xlsx）

表S3。通过电穿孔对7个独特位点进行二次浮选的结果。（XLSX 11 kb）

附加文件4：（9.9K，xlsx）

表S4。两个供体（2sgRNA-2ssODN）漂浮法产生cKO等位基因（XLSX 9kb）的总效率

附加文件5：（14K，xlsx）

表S5。为ssODN敲除项目（即点突变敲除或短标签插入项目）尝试的330个独特位点的详细信息和结果。（XLSX 14 kb）

附加文件6：（23K，xlsx）

表S6。在18个基因座上测试了不同浮选方法的细节和结果。（XLSX 23 kb）

附加文件7：（12K，xlsx）

表S7。Horii等人2017年报告中报告的改进的二次浮选法（顺序输送法）评估。（XLSX 11 kb）

致谢

不适用

作者的贡献

CBG和GB设计、协调和监督了该研究。CBG、RMQ、MO、SD、DJG、TH、PT、JP-T、ADA、AY、J-FS、AG、WRT、BJW、KCKL、JAW、MC、TM、SM、HZ、PK、LL、JMM和GB设计并监督了单个小鼠靶向实验。所有作者都协助或进行了实验。GB进行了统计分析。AOB负责机器学习算法。JMM就研究设计的各个方面提供了有益的建议和反馈。CBG和GB撰写了这份手稿。所有作者都对手稿进行了投稿、批判性审查和批准。

基金

这项工作得到了国家合作研究基础设施（NCRIS）通过澳大利亚物候网络（APN）的支持（加伊坦·布尔吉奥（Gaetan Burgio）和保罗·托马斯（Paul Thomas）），并获得了机构发展奖（PI:Shelley Smith）P20GM103471（CBG、RMQ、DWH、JDE和RR），由NIGMS 1P30GM110768-01和P30CA036727（作为对内布拉斯加州大学小鼠基因组工程和DNA测序核心的支持的一部分）、英国心脏基金会FS12-57、FS12/57/29717和CH/13/2/30154以及RG/15/12/31616（给凯瑟琳·亨格斯和伯纳德·基夫尼）项目拨款，威康信托基金会拨款107849/Z/15/Z、097820/Z11/B，和105610/Z/14/Z，医学研究委员会MR/N029992/1（致DB和CBL），日本教育、文化、体育、科学和技术部/日本医学研究与发展署（MEXT/AMED）的国家生物资源项目，加拿大卫生研究院MOP#142452（MCB和LJM）。LJM是部分由FQRS支持的麦吉尔大学健康中心研究中心的成员。William Thompson博士得到了印第安纳州临床和转化科学研究所的支持，部分由美国国立卫生研究院（NIH）国家转化科学促进中心的拨款UL1 TR001108资助，临床和转化科学奖。KC Kent Lloyd得到了NIH（UM1OD023221）的支持，加州大学戴维斯分校老鼠生物学项目（MBP）工作人员的工作得到了美国实验动物医学院的资助。NIH以P30CA16672（XL、CS、EJ、XZ、JPT）和R50CA211121（JPT）的奖项支持了刘贤德、查德·史密斯、埃里克·乔纳什、张雪松和简·帕克尔·桑伯格的工作。约瑟夫·米亚诺（Joseph Miano）获得NIH的支持，获奖编号为HL138987型.R Sedlacek得到了LM2015040（捷克表型基因组学中心）、CZ.1.05/1.1.00/02.0109（BIOCEV）和CZ.1.0.5/2.1.00/19.0395（教育、青年和体育部（MEYS）以及捷克共和国科学院（RVO 68378050）的支持。David Ray得到了威康信托基金研究员（107849/Z/15/Z）和医学研究委员会（MR/P011853/1和MR/P02-3576/）的资助。Andrew Loudon得到了Wellcome信托研究员（107849/Z/15/Z）、生物技术和生物科学研究委员会（BB/N015584/1）、医学研究委员会（MR/P023576/1）的支持。Gloria Lopez Castejon贡献的工作得到了威康信托基金（104192/Z/14/Z）和英国皇家学会的支持。Pilar Alcaide得到了美国国立卫生研究院（HL 123658）的支持。苏林德·巴特拉（Surinder K.Batra）贡献的工作得到了NIH的支持，合同号为P01 CA217798。

数据和材料的可用性

本研究期间生成和/或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件（附加文件1,2,三,4,5,6、和7). GitHub存储库中提供了随机林模型的源代码https://gist.github.com/aydun1/932f526867f7f8139b8e8eae7c76e866和Zenododoi:10.5281/Zenodo.3339039，根据麻省理工学院许可证[41].

道德批准和参与同意

根据美国国家卫生研究院、国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）的指南或实践规范，所有实验均获得了美国动物护理与使用机构委员会和澳大利亚、比利时、捷克共和国、日本、西班牙和英国伦理委员会的批准在澳大利亚，英国1986年动物（科学程序）法案或教育、文化、体育、科学和技术部（MEXT）、日本卫生、劳动和福利部（MHLW）、捷克共和国动物福利中央委员会（CCAW）、加拿大动物护理委员会（CCAC），比利时皇家比利时（佛兰德斯）医学院的《国家道德规范》，以及所有欧洲学院的《欧洲科研诚信行为准则》。

出版同意书

不适用

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

脚注

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

参与者信息

Channabasavaiah B.Gurumurthy，ude.cmnu@yhtrumurugc.

盖坦·布尔吉奥，ua.ude.una@oigrub.nateag公司.

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文章来自基因组生物学由以下人员提供BMC公司