细胞塌陷和脊髓运动轴突引导中的ephrin-B:EphB信号需要内体分选适配器HD-PTP

HD-PTP和EphB2可以形成分子复合物

虽然HD-PTP可以与受体酪氨酸激酶相互作用²²，尚未分析其与Eph受体的关联。因此，我们在转染了HD-PTP-HA表达质粒的EphB2-过表达HEK293细胞系中进行了联合免疫沉淀分析。EphB2 BirA*-FLAG表达诱导后，用ephrin-B2-Fc、Fc或培养基处理细胞，并裂解。EphB2-FLAG定向下拉在eB2刺激后产生HD-PTP-HA带，但在Fc或中等条件下不产生（图2a、b;n个 = 4; 补充图^{S1（第一阶段）})表明HD-PTP可以与EphB2形成配体诱导复合物。

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图2

EphB2和HD-PTP可以形成配体依赖的复合物。(一)在用HD-PTP-HA转染并单独表达EphB2 BirA*-FLAG或FLAG的HEK293细胞中进行的共免疫沉淀实验的代表性印迹。HA的吸液显示，仅在用1.5µg/mL eB2刺激15分钟的细胞中，HD-PTP和EphB2的下拉。(b条)在转染HD-PTP-HA并单独表达EphB2-BirA*-FLAG或FLAG的HEK293细胞中进行的联合免疫沉淀实验的总细胞裂解物的代表性印迹。全尺寸的蛋白质印迹在补充材料中。tr：转染；ip：免疫沉淀；kDa：千道尔顿；eB2：肾上腺素-B2-Fc。

肾蛋白B2诱导的HeLa细胞崩溃需要HD-PTP

接下来我们评估HD-PTP是否在ephrin-B2:EphB2信号传导中发挥作用。我们首先转向HeLa细胞崩塌实验，这是一个用于量化肾上腺素信号的排斥效应的模型³⁸。我们利用了HD-PTP^shRNA细胞系²⁵与对照组相比，HD-PTP蛋白减少了50%（补充图^{S1（第一阶段）}). 我们转染了Control^shRNA和HD-PTP^shRNA带有EphB2-GFP融合表达质粒的HeLa细胞（补充图^{S1（第一阶段）}; EphB2-OE）并用eB2或Fc刺激他们。控件的大小^shRNA与Fc处理相比，eB2处理的EphB2-OE细胞减少了约50%（图3a、b;n个 = 三；第页 = 0.0003），但eB2处理降低了HD-PTP的大小^shRNA与对照组相比，EphB2-OE细胞仅增加25%（图3a、b;n个 = 三；控制^shRNA电子商务2与HD-PTP（HD-PTP）^shRNAeB2，第页 = 0.0008). 为了确定这种迟钝的反应是否是eB2刺激所特有的，对照组^shRNA和HD-PTP^shRNA细胞暴露于Sema3A中，Sema3A是另一种通过HeLa细胞表达的神经胶质和丛蛋白起作用的崩塌诱导趋化因子^39,40当用Sema3A刺激时，两种细胞株都以相同的程度塌陷（图3c、d;n个 = 三；控制^shRNA 与.HD-PTP^shRNA 不适用.,第页 = 0.3880），表明HD-PTP的丢失减弱了eB2诱导的HeLa细胞塌陷，但不影响对无关细胞塌陷诱导信号的响应。

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图3

HD-PTP是ephrin-B2诱导的细胞崩溃所必需的。(一)Alexa Fluor 568-共轭类卵磷脂染色对照的代表性图像^shRNA和HD-PTP^shRNA用EphB2-GFP转染HeLa细胞，并用1µg/mL eB2或Fc刺激15分钟。(b条)HeLa细胞面积的定量显示对照^shRNAEphB2-OE细胞在1µg/mL eB2的作用下收缩至约一半大小，而HD-PTP^shRNAEphB2-OE细胞仅崩溃约20%(n个 = 3、60–80个电池/n个; 控制^shRNA,第页 = 0.0003; HD-PTP（HD-PTP）^shRNA,第页 = 0.0008; 学生的t吨-测试）。(c（c）)Alexa Fluor 568-共轭对照卵磷脂染色的代表性图像^shRNA和HD-PTP^shRNA用0.3µg/mL Sema3A-Fc或Fc处理HeLa细胞15分钟(d日)HeLa细胞面积定量显示对照^shRNAHeLa细胞在0.3µg/mL Sema3A-Fc和HD-PTP的作用下塌陷至其大小的一半以下^shRNAHeLa细胞崩解程度相同(n个 = 3、60–80个电池/n个; 控制^shRNA 与.HD-PTP^shRNA,第页 = 0.3880; 学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值可在补充表中找到^S4系列.eB2：肾上腺素-B2-Fc***第页 < 0.001; *第页 < 0.05; 注：不重要。反转灰度荧光图像。

HD-PTP在脊髓运动神经元中的表达

Ephrin-B:EphB信号是引导胚胎脊髓运动轴突到达肢体靶点所必需的^5,41，增加了该过程可能还需要HD-PTP的可能性。首先，我们可视化PTPN23型当脊髓外侧运动柱（LMC）轴突受ephrin-B:EphB信号引导时，胚胎鸡Hamburger和Hamilton期（HH-st.）25和28的脊髓（HD-PTP）mRNA^5,42在这些阶段，PTPN23型mRNA广泛表达于脊髓背侧以及运动神经元ISL1系统mRNA表达⁴³（图4a类); 然而，在相同年龄段的脊髓中未检测到编码密切相关的磷酸酶PTPN13和PTPN14的mRNA（补充图^S2系列).

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图4

胚胎运动神经元中HD-PTP的表达和CRISPR介导的耗竭。(一)HH st.25和HH st.28鸡胚脊髓切片的代表性图像，其中ISL1型和PTPN23型（鸡HD-PTP-encoding基因）mRNA检测采用就地杂交。注释的表达式PTPN23型在里面ISL1系统-表示运动柱（箭头）。(b条)用对照品电穿孔从胚胎脊髓收获的游离运动神经元的生长锥和细胞体中的抗HD PTP抗体染色的代表性图像^CRISPR公司或HD-PTP^CRISPR公司质粒。(c（c）)从胚胎脊髓采集的分离运动神经元生长锥中HD-PTP信号的量化显示HD-PTP的信号减少^CRISPR公司与对照组相比^CRISPR公司(n个 = 3、10–12个生长锥/n个;第页 = 0.0023; 学生的t吨-测试）。(d日)胚胎脊髓分离运动神经元胞体中HD-PTP信号的定量显示HD-PTP的信号减少^CRISPR公司与对照组相比^CRISPR公司(n个 = 3、30–50个细胞体/n个;第页 = 0.0009; 学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值可在补充表中找到^S4系列. ***第页 < 0.001; **第页 < 0.01. 可见光图像(一)和倒灰度荧光图像(b条).

肾上腺素B2诱导的LMC生长锥塌陷需要HD-PTP

为了测试LMC神经元中正常的ephrin-B:EphB信号是否需要HD-PTP，我们使用CRISPR-Cas9在LMC运动神经元中诱导HD-PTP功能丧失^44,45我们设计了两个靶向第2外显子的导向RNA和一个靶向PTPN23型基因，增加编码序列双链断裂和移码的可能性，因为容易出错的Cas9非同源末端连接^46,47（补充图^S2系列). 我们将三个质粒共同电穿孔，每个质粒编码一个导向RNA、一个Cas9-FLAG融合蛋白和使用T2A自裂解肽系统表达的GFP，进入HH st.18/19鸡神经管⁴⁸并收获HD-PTP^CRISPR公司HH st.25的脊髓。作为对照，我们使用编码Cas9-FLAG、GFP的质粒和靶向非翻译区域的引导RNA作为对照EPHA4型基因（对照^薯片). 删除PTPN23型通过对从HD-PTP中提取的基因组DNA进行PCR扩增，发现该位点与指南1和3之间的序列删除一致^CRISPR公司，但不是来自Control^CRISPR公司脊髓（补充图^S2系列). 当HH st.25 HD-PTP^CRISPR公司和控制^CRISPR公司脊髓腹侧神经元被移植并培养体外至少18小时，HD-PTP中的HD-PTP信号^CRISPR公司与对照组相比，生长锥和细胞体显著减少^薯片控件（图4b–d日;n个 = 三；生长锥，第页 = 0.0023; 细胞体，第页 = 0.0009).

这种培养的HD-PTP^CRISPR公司和控制^CRISPR公司神经元形成生长锥的能力没有差异（图4b个)，延伸轴突（补充图^第3章)，或表示EphB2（补充图^第3章). 为了确定HD-PTP是否是LMC生长锥eB2:EphB2信号传导所必需的，我们将重点放在LMC神经元的中间亚群上，这些神经元表达高水平的EphB2并被eB2排斥体内和体外^5,49HD-PTP（HD-PTP）^CRISPR公司或控制^CRISPR公司分离LMC神经元，并通过转录因子Isl1的表达鉴定LMC内侧神经元⁴³.控制^CRISPR公司eB2治疗后，内侧LMC生长锥明显塌陷，但HD-PTP^CRISPR公司内侧LMC生长锥表现出明显减弱的塌陷反应（图5a、c;第页 < 0.0001). 这种效应是eB2治疗特有的，因为HD-PTP^CRISPR公司和控制^CRISPR公司当暴露于Sema3F时，生长锥也会以同样的程度塌陷，Sema3F是一种已知的排斥内侧LMC轴突的蛋白质⁵⁰（图5a、c).

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图5

脊髓运动轴突生长锥需要HD-PTP来应对肾上腺素B2诱导的塌陷。(一)GFP的代表性图像⁺游离对照的生长锥^CRISPR公司-或HD-PTP^CRISPR公司-电穿孔运动神经元，与eB2、Sema3F或Fc孵育，并用抗GFP抗体染色。(b条)使用与Control电穿孔的分离运动神经元进行的救援实验中生长锥的代表性图像^CRISPR公司质粒或HD-PTP^CRISPR公司与hHD-PTP或hHD-PTPC/S质粒共同电穿孔，用10µg/mL eB2或Fc孵育30分钟，并用抗HD-PTP抗体染色。(c（c）)量化用CRISPR构建物电穿孔并用配体刺激的分离运动神经元中坍塌的生长锥。HD-PTP（HD-PTP）^CRISPR公司或控制^CRISPR公司用10µg/mL eB2或Fc培养生长锥30分钟。HD-PTP的崩溃响应^CRISPR公司与对照组相比，eB2的生长锥显著减弱^CRISPR公司(n个 = 3、90个生长锥/n个;第页 < 0.0001; 费希尔精确测试）。用Control电穿孔的分离运动神经元的生长锥进行救援实验^CRISPR公司或HD-PTP^CRISPR公司与hHD-PTP或hHD-PTPC/S表达质粒共同电穿孔，用10µg/mL eB2或Fc孵育30分钟，并用抗HD-PTP和抗Isl1抗体染色。两组人群对eB2治疗的反应与对照组无明显区别(n个 = 4，50个生长锥/n个; 费希尔精确测试）。HD-PTP（HD-PTP）^CRISPR公司或控制^CRISPR公司生长锥与0.3µg/mL Sema3F-Fc或Fc孵育30分钟。两个CRISPR生长锥群体表现相同，表明HD-PTP缺失不会影响对Sema3F的反应(n个 = 4，30个生长锥/n个; 费希尔精确测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值可在补充表中找到^S4系列.h：人类；S3F:Sema3F；eB2：肾上腺素-B2-Fc***第页 < 0.001; 注：不重要。反转灰度荧光图像。

为了进一步表征HD-PTP敲除的特异性，我们通过将人（h）HD-PTP表达质粒与鸡特异性HD-PTP共电穿孔进行了拯救实验^CRISPR公司质粒如上。与HD-PTP共同电穿孔的内侧LMC神经元^CRISPR公司和hHD-PTP表达质粒，HD-PTP蛋白水平恢复到接近对照水平（补充图^第3章)因此，它们对eB2的崩溃响应恢复到控制水平（图5b、c). 我们还询问了HD-PTP磷酸酶结构域是否是通过共同电穿孔HD-PTP在生长锥塌陷中发挥作用所必需的^CRISPR公司质粒和编码人类HD-PTP的质粒，点突变破坏磷酸酶活性位点⁵¹（hHD-PTP C/S）。这种突变型HD-PTP能够拯救HD-PTP^CRISPR公司–诱导生长锥塌陷缺陷（图5b、c)表明EphB2下游的HD-PTP功能不需要磷酸酶活性。

HD-PTP是ephrin-B2诱导的SFK激活、EphB2磷酸化和EphB2-表面修补所必需的

Eph正向信号的最早事件之一是SFK在其418位激活酪氨酸上的磷酸化（磷酸化-Y418-SFK）⁵²，一种可由特定抗血清检测到的事件⁵³LMC神经元内⁴¹为了检测SFK磷酸化事件是否需要HD-PTP，我们将此抗血清用于固定的HD-PTP^CRISPR公司和控制^CRISPR公司暴露于eB2或Fc的中间LMC生长锥。控制^CRISPR公司与经Fc处理的生长锥相比，经eB2处理的LMC生长锥显示出磷酸化Y418-SFK信号水平增加（图6a、b;n个 = 三；第页 < 0.0001). 相反，HD-PTP^CRISPR公司LMC生长锥没有显示出这种效果（图6a、b;第页 = 0.9810). 我们在控制和HD-PTP中复制了这一结果^shRNAHeLa细胞，并通过Western blot进一步表征其SFK磷酸化动力学。虽然配体刺激后两种细胞系中总Src水平保持不变，但对照组中明显存在肾上腺素B2诱导的SFK磷酸化^shRNA细胞，但在HD-PTP中被废除^shRNA电池（补充图^S4系列). 因此，HD-PTP的丢失消除了ephrin的关键效应物Eph-信号的激活。

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图6

HD-PTP是ephrin-B2诱导的SFK激活、EphB2磷酸化和EphB2-表面修补所必需的。(一)Control的代表图像^CRISPR公司和HD-PTP^CRISPR公司脊髓运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟，并用抗磷-Y418-SFK染色，显示eB2暴露后SFK激活。(b条)对照组中抗磷酸化Y418-SFK信号的量化^CRISPR公司和HD-PTP^CRISPR公司运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟。控制^CRISPR公司生长锥显示配体诱导的SFK活化增加(第页 < 0.0001），但HD-PTP^CRISPR公司生长锥没有(第页 = 0.9810) (n个 = 3、10–12个生长锥/n个; 单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。(c（c）)对照组EphB2（含抗FLAG抗体）下拉后使用抗磷酸酪氨酸和抗FLAG的代表性Western blot^shRNA和HD-PTP^shRNA用1µg/mL eB2或Fc刺激HeLa细胞5分钟。谱带大小与EphB2相对应。(d日)FLAG信号上磷酸化酪氨酸信号的定量显示配体诱导的对照组EphB2磷酸化^shRNAHeLa细胞(第页 = 0.0284），但在HD-PTP中没有^shRNA单元格(第页 = 0.3908) (n个 = 三；单因素方差分析，然后是Student’st吨-测试）。(e（电子）)Control的代表图像^薯片和HD-PTP^CRISPR公司脊髓运动神经元生长锥，用未聚集的10µg/mL eB2或Fc孵育2分钟，并用抗Fc抗体染色，显示eB2暴露后抗Fc染色增强。(（f）)控制中抗Fc信号的量化^CRISPR公司和HD-PTP^CRISPR公司运动神经元生长锥，与10µg/mL未聚集的eB2或Fc孵育2分钟。控制^CRISPR公司生长锥显示配体诱导的抗Fc信号增加(第页 = 0.0011）和HD-PTP^CRISPR公司eB2刺激后，生长锥也表现出增加(第页 = 0.0028) (n个 = 3、10–12个生长锥/n个; 单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。(克)Control的代表图像^CRISPR公司和HD-PTP^CRISPR公司运动神经元生长锥，与10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟，并使用非渗透固定条件对EphB2进行免疫染色。通过增加表面抗EphB2染色的信号强度，可以观察到EphB2-修补。(小时)控制中EphB2修补的量化^CRISPR公司和HD-PTP^CRISPR公司运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟，用含有表面EphB2信号的生长锥面积百分比测量。与Control相比^CRISPR公司生长锥(第页 = 0.017），HD-PTP^CRISPR公司生长锥未能在配体结合时引发EphB2表面修补(第页 = 0.5707) (n个 = 三；单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值可在补充表中找到^S4系列全尺寸的蛋白质印迹在补充材料中。tr：转染；ip：免疫沉淀；kDa：千道尔顿；eB2：肾上腺素-B2-Fc；perm：渗透***第页 < 0.001; **第页 < 0.01 *第页 < 0.05; 注：不重要。反转灰度荧光图像。

Eph信号还涉及对Eph激酶活性至关重要的膜旁酪氨酸残基的自磷酸化¹⁴为了确定HD-PTP对此是否重要，我们转染了对照^shRNA和HD-PTP^shRNA带有EphB2-FLAG表达质粒并用eB2或Fc刺激的HeLa细胞。然后我们溶解细胞，进行抗FLAG下拉并用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹。与Fc治疗相比，对照组在eB2刺激后EphB2磷酸化显著增加^shRNA电池（图6c、d;n个 = 三; 第页 = 0.0284); 然而，HD-PTP中没有这种作用^shRNA电池（图6c、d;n个 = 三；第页 = 0.3908).

EphB2自动磷酸化需要在细胞表面形成受体和多聚体阵列^9,11,38为了检验这个过程是否依赖于HD-PTP，我们首先确认了EphB2的细胞表面表达在HD-PTP丢失后没有改变。非渗透性HeLa细胞和LMC生长锥与未簇集的ephrin-B2-Fc重叠显示，在HD-PTP丢失和控制条件下，配体结合水平相似，表明表面EphB受体的正常可用性（图6e、f; 补充图^S4系列). 对对照LMC生长锥和HeLa细胞中的细胞表面EphB2的检测表明，集群eB2处理导致EphB2-细胞表面形成显著的斑块，这与Eph受体多聚体相关³⁸（图6克，小时;第页 = 0.017与.Fc；补充图^S4系列). 相反，HD-PTP的丢失导致LMC生长锥中明显缺乏eB2诱导的EphB2细胞表面补丁（图6克，小时;第页 = 0.5707）和HeLa电池（补充图^S4系列). 这些实验表明HD-PTP在eB2诱导的EphB2表面聚集中起着关键作用。

HD-PTP保护EphB2免受配体诱导的溶酶体降解

作为ESCRT复合物的一种成分，HD-PTP调节配体结合的细胞表面受体向降解途径和回收内体的内吞分选^24,54为了检测HD-PTP是否参与Eph受体的这种加工，我们首先使用了一种分析来量化在基础或eB2刺激条件下HD-PTP水平正常或降低的LMC生长锥中的内化受体。细胞表面的EphB2受体被标记，配体刺激10分钟后，所有膜蛋白被酸破坏，然后固定和染色。HD-PTP（HD-PTP）^CRISPR公司eB2处理后，生长锥细胞明显缺乏内化的EphB2（图7a、b;n个 = 三；第页 = 0.9831）与对照组相比^薯片生长锥（图7a、b;n个 = 三；第页 = 0.0023). 在HD-PTP功能丧失的HeLa细胞中也观察到这种作用：对照^shRNA与Fc相比，eB2刺激的细胞含有大量内吞的EphB2（图7c、d;n个 = 三；第页 = 0.0216），而HD-PTP^shRNA即使受到刺激，细胞内的EphB2水平也可以忽略不计（图7c、d;n个 = 三；第页 = 0.9001），表明HD-PTP耗竭降低了EphB2的内化或加速了内化的EphB2降解。

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图7

HD-PTP损失增加了EphB2溶酶体降解的速率。(一)Control的代表图像^CRISPR公司和HD-PTP^CRISPR公司脊髓运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育20分钟，用抗EphB2抗体染色，然后进行酸剥离，以显示内化的EphB2。(b条)对照组内化EphB2的量化^CRISPR公司和HD-PTP^CRISPR公司运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育20分钟。控制^CRISPR公司生长锥显示配体诱导的内化EphB2增加(第页 = 0.0023），但HD-PTP^CRISPR公司生长锥没有(第页 = 0.9831) (n个 = 3、10–12个生长锥/n个; 单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。(c（c）)Control的代表图像^shRNA和HD-PTP^shRNAHeLa细胞，用1µg/mL eB2或Fc孵育10分钟，用抗EphB2抗体染色，然后进行酸剥离，以显示内化的EphB2。(d日)对照组内化EphB2染色的定量^shRNA和HD-PTP^shRNAHeLa细胞与1µg/mL eB2或Fc孵育10分钟。控制^shRNAeB2刺激后，EphB2内吞信号增加(第页 = 0.0216），但HD-PTP^shRNAHeLa细胞内吞EphB2没有明显增加(第页 = 0.9001) (n个 = 3、10–12个电池/n个; 单因素方差分析，然后是校正的学生t吨-测试）。(e（电子）)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2表达的代表性Western blot^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺孵育后的不同时间点裂解，暴露于1µg/mL eB2或Fc。β-actin检测用作内部控制。(（f）)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2的Western blot定量^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和1µg/mL eB2或Fc孵育后裂解。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。与Fc相比，在环己酰亚胺处理后30分钟，eB2刺激似乎可以保护EphB2免受降解(n个 = 三；学生的t吨-测试）。(克)用转染HD-PTP的抗FLAG抗体检测EphB2的代表性Western blot^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和1µg/mL eB2或Fc孵育后的不同时间点裂解。β-actin用作内部控制。(小时)转染HD-PTP中抗FLAG抗体检测EphB2的Western blot定量^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和1µg/mL eB2或Fc孵育后裂解。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。与Control相比^shRNAHeLa细胞，HD-PTP中^shRNA在放线菌酮处理后30分钟，HeLa细胞，eB2刺激似乎比Fc增加了EphB2降解率(n个 = 三；学生的t吨-测试）。(我)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2表达的代表性Western blot^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和溶酶体阻滞剂10 mM NH孵育后的不同时间点裂解₄Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。β-actin检测用作内部控制。(j个)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2的Western blot定量^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和溶酶体阻滞剂10 mM NH孵育后裂解₄Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。在环己酰亚胺处理和溶酶体阻断后60分钟，EphB2的降解水平似乎得到了挽救(n个 = 4; 学生的t吨-测试）。(k)用抗FLAG抗体检测转染HD-PTP中EphB2表达的代表性Western blot^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和溶酶体阻滞剂10 mM NH孵育后的不同时间点裂解₄Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。β-肌动蛋白检测被用作内部控制。(我)转染HD-PTP中抗FLAG抗体检测EphB2的Western blot定量^shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和溶酶体阻滞剂10 mM NH孵育后裂解₄Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。在环己酰亚胺处理和溶酶体阻断后60分钟，EphB2的降解水平似乎得到了挽救(n个 = 4; 学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±标准差。所有数值可在补充表中找到^S4系列全尺寸的蛋白质印迹在补充材料中。CHX：环己酰亚胺；eB2：肾上腺素-B2-Fc***第页 < 0.001; **第页 < 0.01; *第页 < 0.05; 注：不重要。反转灰度荧光图像。

为了解决这些可能性，我们比较了在存在或不存在eB2的情况下，HD-PTP水平降低的细胞中蛋白质合成受到抑制后EphB2蛋白的水平。为此，我们将EphB2-FLAG表达质粒转染到对照组^shRNA和HD-PTP^shRNAHeLa细胞，在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）存在下用eB2或Fc处理它们，并通过FLAG免疫印迹测量EphB2蛋白水平的动态变化²⁵.Fc-治疗对照^shRNAHeLa细胞保持EphB2的稳定水平，直到添加CHX后约30分钟，EphB2的水平开始下降（图第7e条，第f条). 然而，当与eB2和CHX孵育时，EphB2水平在60分钟内保持稳定（图7e、f;第页 = 0.0018），表明eB2暴露可能抑制EphB2降解。相反，Fc和CHX暴露30分钟后，HD-PTP^shRNA与经Fc处理的对照组相比，HeLa细胞的EphB2水平较低^shRNAHeLa细胞（图7小时;n个 = 三；第页 = 0.002). 此外，HD-PTP的eB2和CHX治疗^shRNAHeLa细胞导致EphB2水平更快下降，在治疗60分钟后几乎完全耗尽（图7克，小时;n个 = 三；60分钟控制^shRNAeB2与60分钟HD-PTP^shRNAeB2，第页 = 0.0005). 这些结果表明，HD-PTP是防止活化EphB2降解所必需的。

接下来，我们在溶酶体阻滞剂NH存在的情况下重复这些分析₄Cl，以确定该系统中的EphB2是否被溶酶体降解。Fc-治疗对照^shRNA电池，NH₄Cl处理显著增加了CHX处理60分钟后观察到的EphB2的量（图第7页，第j页;n个 = 4;第页 = 0.0416). 事实上，Fc或eB2治疗60分钟CHX和NH后的EphB2水平₄氯处理与时间零点时的水平没有显著差异（图第7页，第j页;n个 = 4;第页 = 0.2173），表明EphB2的基础降解是溶酶体依赖性的。HD-PTP中^shRNAHeLa细胞，即在基础条件下，尤其是在ephrin-B2刺激条件下，EphB2加速耗竭，也被NH消除₄Cl处理（图7公里，升;n个 = 4; 60分钟Fc vs 60分钟NH₄氯Fc，第页 = 0.0051; 60分钟eB2 vs 60分钟NH₄Cl eB2，第页 = 0.0005). 总之，这些实验表明，HD-PTP的丢失对表面受体的水平有不同的影响：与其他受体酪氨酸激酶的影响相比²⁴，HD-PTP缺失加速EphB2溶酶体降解，特别是在配体刺激激活后，这表明HD-PTP的功能是保护EphB2-信号不被终止。

BioID和MS数据分析

BioID实验按照其他地方的描述进行，并进行了修改⁷⁷简单地说，对照组和EphB2-OE Flp-In T-REx HEK293细胞（Invitrogen）（所有细胞系均可在补充表中找到^第3章)在15 cm平板（Corning）中培养，并用1µg/mL四环素（Sigma-Aldrich）处理18 h。第二天，去除培养基，并在无血清培养基中培养细胞6 h，培养基中存在50µM生物素（Simma-Aldrich）和预聚配体（Fc或eB2-Fc，1.5μg/mL，R&D Systems）或培养基。在生物素和配体处理6小时后，取出培养基，从平板上刮下细胞，用15 mL试管中的冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次，并将细胞颗粒储存在−80°C下。在1.5 mL放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中溶解细胞，并向每个样品中添加1µL苯并酶（MilliporeSigma）以降解核酸。以30%振幅对裂解液进行30秒（s）的超声处理，每次10秒，中间休息2秒。然后在4°C下以最大速度离心裂解液30分钟。将70µL预先清洗的链霉亲和素珠（GE Healthcare）与剩余的裂解物在4°C下孵育3小时。样品在4°C下以2000 rpm转速旋转1分钟，并去除上清液。将珠粒重新悬浮在1.5mL RIPA缓冲液中，并用RIPA缓冲液洗涤3次。然后将小球重新悬浮在1 mL 50 mM碳酸氢铵（ABC，Bio-Basic）中，用ABC洗涤3次，并重新悬浮在100µL ABC中。添加1µg胰蛋白酶（Sigma-Aldrich），并在37°C下摇晃样品16 h。第二天，将样品消化2 h，并在室温下以2000 rpm转速旋转1 min。将珠在100µL水中清洗2次，并与收集的上清液结合。将甲酸（Sigma-Aldrich）添加到上清液中，最终浓度为5%。样品在室温下以最大速度旋转10分钟，在30°C下干燥3小时（SpeedVac）。将色氨酸肽重新悬浮在15µL 5%甲酸中，并储存在−80°C下。

在IRCM蛋白质组学核心设施中，通过高压液相色谱（HPLC）和Orbitrap Velos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）对肽进行分析。如其他地方所述，进行肽搜索、蛋白质鉴定和质谱（MS）数据分析⁷⁷使用ProHits分析BioID-MS数据⁷⁸简而言之，使用Proteowizard将RAW文件转换为.mzXML⁷⁹.Human RefSeq版本57和ProHits中集成的iProphet工具⁸⁰用于肽搜索和鉴定。ProHits中生成的INTeractome（SAINT）文件输入的显著性分析通过ProHits-viz进行分析³²生成点图并计算WD核。

蛋白质网络分析、聚类和功能注释

通过Cytoscape生成蛋白质网络和聚类分析³⁴如其他地方所述⁸¹，进行了修改。将SAINT中分析的BioID-MS数据导入Cytoscape。对SAINT中识别的猎物进行审查后的UniProtKB条目被提交到“输入搜索条件”文本框中，现有的蛋白质相互作用数据从IntAct数据库导入⁸²。通过执行联合合并，BioID和公共网络被合并。自循环和重复边被删除。MCL集群³⁵用于可视化蛋白质复合物和簇。使用基因本体（GO）术语进行功能注释。利用g:Profiler分析已知的猎物蛋白质的生物过程或分子功能³³。在g:Profiler和−log上的Query字段中提交了SAINT中分析的猎物的已审核UniProtKB条目₁₀已更正个（共个）第页这些值用于GO富集和KEGG分析。

生物化学

对于共免疫沉淀测定，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）在10cm培养皿中用HD-PTP-HA表达质粒转染对照和EphB2 OE HEK293细胞，一天后用补充有0.05%胎牛血清（Gibco）、1%青霉素/链霉素（100X，Gibco）和1µg/mL四环素（Sigma-Aldrich）在37°C和5%CO条件下放置18小时₂.控制^shRNA和HD-PTP^shRNAHeLa细胞（所有细胞系可在补充表中找到^第3章)用2 mM磷酸钙转染EphB2-FLAG表达质粒（由Matthew Dalva博士赠送），转染48小时后刺激。在37°C下，用预先聚集的配体（在室温下用抗Fc抗体聚集30分钟）刺激15分钟（Fc和eB2，1.5微克/毫升）或5分钟（Fc和eB2，1.0微克/毫克）。用PBS清洗后，用1 M MgCl溶解细胞₂，2 M Tris-HCl pH 7.5，3 M NaCl，1%CHAPS（生物碱性），0.5 M氟化钠，100 mM原钒酸钠和cOmplete蛋白酶抑制剂（25X，罗氏）。将裂解液在4°C下以14000 rpm转速旋转15 min，然后转移上清液，并用抗FLAG珠（Sigma Aldrich）在4°C下旋转3 h，用裂解缓冲液（同上）洗涤3次，并用6X Laemmli缓冲液（1:5）变性。

对于其他生化分析，将对照细胞和EphB2-HeLa细胞与补充有0.05%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1µg/mL四环素的DMEM在37°C和5%CO的条件下培养18小时₂。PBS洗涤后，用1M Tris-HCl（pH 8.0）、5M NaCl、1%NP-40（Abcam）、phosTOP（Sigma-Aldrich）和cOmplete蛋白酶抑制剂裂解细胞。将裂解物在4°C下以12000rpm旋转5分钟，并用6X莱姆利缓冲液（1:5）变性。样品在6–10%Bio-Tris聚丙烯酰胺凝胶上运行。用甲醇（Sigma-Aldrich）活化膜（PVDF；Bio-Rad Laboratories）2分钟，并在室温下将1%BSA（Bio-Basic）、0.05%吐温（Sigma Aldrich抗FLAG-HRP（1%牛血清白蛋白，室温下45分钟）、抗链霉亲和素HRP（1%BSA，室温下30分钟°C）和抗HD-PTP（0.05%吐温PBS，隔夜4°C）。所有抗体的信息可在补充表中找到^{S1（第一阶段）}使用ECL（GE Healthcare）激活膜，并使用薄膜（GE Hearthcare。使用ImageJ（NIH）测量免疫印迹带的信号强度和面积。

细胞培养

通过使用Lipofectamine 3000将Flp-In T-REx HEK293和Flp-In T-REx HeLa细胞转染FLAG或EphB2-BirA*-FLAG表达质粒，生成对照和EphB2-OE HEK293-和HeLa电池。用潮霉素（200μg/mL，Invitrogen）筛选转染细胞15–16天。控制^shRNA和HD-PTP^shRNAHeLa细胞由空pLKO1或HD-PTP shRNA pLKO（Sigma-Aldrich）的病毒感染产生。感染后，用嘌呤霉素（1μg/mL，Gibco）筛选细胞5-7天，并进行western blot以评估敲除效率。

HeLa细胞塌陷试验

对照组和EphB2-HeLa细胞以20000个细胞/盖玻片（VWR）接种。24小时后，在37°C和5%CO的条件下，将细胞在补充有0.05%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1µg/mL四环素的DMEM中培养18小时₂并在第二天使用预集群eB2或Fc进行刺激。控制^shRNA和HD-PTP^shRNAHeLa细胞在补充有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和嘌呤霉素（1μg/mL）的DMEM中培养，培养温度为37°C，CO浓度为5%₂使用Lipofectamine 3000将这些细胞转染在6孔板（Sarstedt）中，以20000个细胞/盖玻片接种，并在转染后48小时和接种后24小时进行刺激。

小鸡在ovo中电穿孔和CRISPR指南

如前所述，在HH st.18/19进行鸡脊髓表达质粒电穿孔⁴⁸.针对HD-PTP设计了三种引导RNA五倍子使用CHOPCHOP的基因组序列⁸³并使用NCBI BLAST工具验证其特异性⁸⁴pX330质粒（从Addgene获得#42230）通过将T2A-EGFP盒下游和框架内亚克隆到Cas9进行修饰，产生pX3361。合成导向RNA寡核苷酸（Synthego），并在pX3361质粒中分别克隆。指导RNA序列可根据要求提供。在生长锥塌陷实验中，胚胎用含有三种含指导的pX3361质粒各1.5μg/μL的DNA混合物电穿孔。对于体内LMC轴突导向实验中，胚胎用含有3种导向pX3361质粒各1μg/μL和2μg/e[Isl1]：：绿色荧光蛋白质粒。

现场mRNA定位与免疫组织化学

现场如前所述进行mRNA检测和免疫荧光⁴⁹或使用标准方法。可根据要求提供探测序列。

对于LMC生长锥的非渗透性分析，组织暴露于配体15分钟并置于冰上，通过用含有2%BSA（最终，组织上1%）的PBS替换一半培养基并在4°C下培养，执行5分钟的封闭步骤。然后将一半培养基替换为运动神经元培养基（神经基底培养基（Gibco），补充B-27（1:50，Gibco°C（所有抗体详情见补充表^{S1（第一阶段）}). 然后用1/5 30%蔗糖（Bio-Basic）和4/5 4%PFA（Sigma-Aldrich）的混合物在4°C下固定组织15分钟。在用PBS进行三次洗涤后，在4°C下添加次级抗体（最终，PBS中1000分之一）1小时。最后，使用PBS进行三次快速清洗，然后在Mowiol（Sigma Aldrich）中进行安装。对于渗透性对照，固定发生在配体孵育后和一级抗体染色前，在添加Triton X-100（0.3%，Sigma-Aldrich）的培养基中添加一级抗体，在添加了Triton X-100%（0.3%）的PBS中添加二级抗体。否则，所有浓度、培养时间和温度都是相同的。

量化用HD-PTP CRISPR或对照构建物电穿孔的生长锥中可用的表面ephrin-B2受体数量（图6e、f)我们从电穿孔胚胎中培养鸡LMC生长锥，并在固定前将重组ephrin-B2-Fc（之前未与抗Fc抗体聚集）浸泡2分钟。然后，我们进行了抗Fc抗体染色，以检测结合的ephrin-B2-Fc。这是唯一一个我们没有预先聚集重组ephrin-B2的实验。

对于HeLa细胞的非渗透性分析，细胞暴露于配体5分钟，并立即置于冰上。在4分钟时，用含有2%BSA（最终，组织上1%）的PBS替换一半培养基，持续5分钟，从而进行封堵°C，然后将一半培养基替换为补充有0.05%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM，并将含有EphB2（千分之一）和EEA1（500分之一）初级抗体的培养基作为对照，并在4°C下培养30分钟。像生长锥一样进行二次染色。

内化分析

HeLa细胞或分离的LMC运动神经元在盖玻片上培养。在配体刺激之前，将培养基更换为含有初级抗体（1:1000抗EphB2）的培养基，并在4°C下培养组织1 h。用温热介质清洗盖玻片两次，并在37°C下用预先聚集的Fc或ephrin-B2-Fc处理盖玻片（HeLa细胞为10分钟，神经元为20分钟）。配体孵育后，移除所有培养基，并在室温下用酸洗溶液（1 M NaCl，0.5 M乙酸，pH值2.2-2.7（Sigma-Aldrich））替换6分钟。细胞和神经元用4%PFA固定，并用HD-PTP和二级抗体染色，以显示内部EphB2。

运动神经元培养

采集HH st.25鸡胚，解剖分离脊髓运动柱。用0.25%胰蛋白酶（生命科技）在钙中分离组织²⁺/镁²⁺汉克斯溶液（Invitrogen）被1M MgSO钝化₄（Invitrogen）和12500 U/mL DNAse（沃辛顿工业公司）。细胞在室温下以1000 rpm转速旋转5分钟，然后在补充有1%胎牛血清、0.01%谷氨酰胺（Invitrogen）和0.01%青霉素/链霉素的神经基底细胞培养基中重新悬浮，然后滴定。将20000个细胞接种到层粘连蛋白涂层（20μg/mL；Invitrogen）盖玻片，并在37°C下与5%CO孵育₂接种后一天，用预先聚集的eB2或Fc刺激细胞。

显微镜和图像定量

使用ZEN 2010在蔡司LSM 700共焦显微镜上拍摄高倍图像。使用LasX在徕卡DFC 488光学显微镜上拍摄低倍照片。现场杂交图像是在徕卡DM 4000光学显微镜上使用OsteoMeasure拍摄的。使用ImageJ（NIH）和先前描述的方法对四肢节段的轴突投射、信号平均强度、细胞面积、运动神经元数量进行量化⁵⁵.

聚合酶链反应

用100μg/mL蛋白酶K（Thermo Fisher）在55°C的SDS缓冲液（100 mM Tris pH 8.5，5 mM EDTA，200 mM NaCl，0.2%SDS）中消化小鸡HH st.25脊髓3 h。用异丙醇沉淀提取的DNA，用70%乙醇洗涤，并在ddH中重新悬浮₂O.PCR扩增对照组或HD-PTP中的HD-PTP基因组位点^CRISPR公司-使用Qiagen Master Mix和以下引物进行组织电穿孔：正向外部引物（tttggggcagacacatct），反向外部引物。用1μL先前的PCR反应产物、Qiagen Master Mix和以下引物进行嵌套PCR：正向内侧引物（agaaaggcacctgctccca）、反向内侧引物（ttccagtcacgcagctg）。电泳后，PCR产物在1%琼脂糖凝胶上显示。

脉冲追逐

控制^shRNA和HD-PTP^shRNA使用Lipofectamine 3000将HeLa细胞与EphB2-FLAG表达质粒（来自Matthew Dalva博士的礼物）转染在10厘米的培养皿中（如上）。24小时后，将80000个细胞接种到24孔板中，24小时后用预先聚集的eB2或Fc刺激。用10μg/mL环己酰亚胺和1μg/mL预聚集配体（Fc或eB2，1.0μg/mL）对细胞进行脉冲处理。在不同时间点采集样本，并通过免疫印迹法分析EphB2总蛋白量。溶酶体抑制，10 mM NH₄将Cl添加到环己酰亚胺和配体混合物中。

作者感谢E.Olafson、J.Cardin和M.Liang的技术协助，L.Delorme的秘书协助，以及N.Bisson对手稿早期版本的批判性评论。D.M.是墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）国际博士奖学金的获得者，获得了麦吉尔大学神经科学综合项目的资助，目前由瑞士政府优秀博士后奖学金（#2018.0483）资助。H.B.获得了魁北克省圣é研究基金会（FRQS）颁发的博士培训奖（#33603）。G.D.获得了FRQS的博士后培训奖。这项工作得到了加拿大卫生研究院（PJT-152966给A.P，MOP-97758和MOP-77556给A.Kania）、加拿大癌症学会研究所（705376给A.P.）、NSERC（RGPIN-2016-04808给J.F.C.）、加拿大脑组织、加拿大创新基金会和W.Garfield Weston基金会给A.Kania的资助。J.F.C.在乳腺癌研究中担任TRANSAT主席。A.Kania和J.F.C.还获得了FRSQ Chercheur-boursier高级职业奖的支持。