分化和DNA结合抑制剂（Ids）在皮层器官发育过程中调节Math1和毛细胞形成

耳蜗祖细胞的转染

上述表达数据强烈表明Ids在Math1和毛细胞分化的调节中具有抑制作用。为了验证这一假设，我们开发了一种基于电穿孔的方案，在确定单个细胞命运之前转染耳蜗前感觉祖细胞。作为初始对照，从E13动物建立耳蜗外植体，并用pCLIG-EGFP接口表达质粒。6天后在体外，外植体固定并用抗EGFP标记以鉴定转染细胞，抗肌球蛋白VIIa标记以鉴定毛细胞(图4). 如前所述(郑和高，2000)，大多数转染细胞位于靠近发育中的感觉上皮的大上皮嵴（GER）细胞中(图4A类，箭头）。然而，在感觉上皮内也观察到大量转染细胞(图4A类，箭头）。此外，对单个转染细胞的仔细检查表明，根据肌球蛋白VIIa的形态和表达，许多细胞已发展为毛细胞(图4B、 C类，箭头）。为了确定类似转染细胞是否也能发育成支持细胞，用pCLIG-EGFP接口矢量，然后用特定于支持细胞类型的标记进行标记，包括Prox1(Bermingham-McDonogh等人，2005年) (图4D类)，Jagged1(Zine等人，2000年)，和p75^NTR公司(von Barthold等人，1991年). 对每个标记物阳性的转染细胞进行了鉴定。(图4E、 F类和数据未显示）。

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图4。

耳蜗外植体培养中祖细胞的转染。A类，在E13用EGFP表达质粒电穿孔的外植体培养物的低放大视图，并保持在体外6天。感觉上皮（SE）内的毛细胞被抗肌球蛋白VIIa（红色）标记，表达EGFP的转染细胞为绿色。EGFP阳性细胞（绿色）出现在GER（箭头）和SE（箭头）中。B类，感觉上皮的高度放大视图EGFP公司-转染的外植体。单行内毛细胞（IHC）和四行外毛细胞（OHC）对肌球蛋白VIIa（红色）呈阳性。单个转染细胞（绿色）已发展为外毛细胞（箭头所示）。箭头表示平面Z轴-中的节C类.C类，共焦Z轴-沿中箭头所示平面的堆叠横截面B类，显示转染细胞中的毛细胞形态（绿色）。D类，Prox1是Corti器官中支持细胞的标记。共焦Z轴-P0小鼠耳蜗的堆叠。Prox1的表达用红色表示。丝状肌动蛋白用绿色的生殖激素标记。Prox1的支持细胞核（箭头）为正（红色），而Prox1则为负（星号）。E类，转染了EGFP公司四个转染细胞（绿色，箭头）对Prox1也呈阳性。一个额外的细胞（箭头）也被转染，但似乎位于上皮内更管腔的位置，Prox1不阳性。这个细胞可能已经发展成为毛细胞。蓝色箭头表示平面Z轴-中的节F类.F类，共焦Z轴-通过中蓝色箭头所示平面的堆叠横截面E类单个转染的Prox1阳性细胞（箭头）具有与支持细胞一致的形态，包括延伸至管腔表面的顶端投影（箭头）。G公司，过度表达数学1诱导感觉上皮中毛细胞的发育。几乎所有的祖细胞都转染了数学1（绿色，箭头）为肌球蛋白VIIa阳性（红色），表明它们已发育为毛细胞。H（H），数学1-转染后的细胞也形成了静纤毛束。共焦Z轴-通过一组转染的祖细胞（绿色）堆叠横截面。每个毛细胞上的立体纤毛束（箭头所示）是通过对丝状肌动蛋白（红色）进行阴茎肽标记来显示的。比例尺：A类250微米；B类，20微米；C类，10微米；D类，20微米；E类，20微米；F类，20微米；G公司，20微米；H（H），10微米。

为了确定转染程序是否在细胞命运的确定中产生任何偏差，对转染细胞的命运进行量化。如前所述，Corti器官的分化始于从耳蜗螺旋底部延伸到顶部的梯度(鲁贝尔，1978年). 因此，在电穿孔时，位于耳蜗顶部的细胞比位于耳蜗底部的细胞成熟度低，这使得位于耳蜗顶部的细胞影响细胞命运的可能性更大。因此，细胞计数仅限于位于每个外植体50%感觉上皮顶端的细胞。对来自七个不同外植体的总共83个细胞的细胞命运进行了测定(表1和补充表1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 对于七个外植体，转染细胞的总体平均约50%pCLIG-EGFP接口发育成毛细胞(表1). 然而，对83个单独转染细胞的命运进行的检查表明，无论其所在的外植体是什么，其转染率略高，为～54%（补充表1，见网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 通过这两种分析方法，这些结果表明大约一半的祖细胞转染了pCLIG-EGFP接口发育成毛细胞。这些数据与Corti器官内毛细胞和支持细胞的大致相等数量相一致，并表明转染有pCLIG-EFGP接口表达质粒似乎不偏向于感觉上皮内的特定细胞命运。

耳蜗祖细胞中Math1的过度表达诱导毛细胞的命运

先前的结果表明数学1出生后大鼠耳蜗移植物GER内的细胞导致异位毛细胞的形成(郑和高，2000). 然而，该研究的作者未能成功转染感觉上皮内的细胞。根据这些结果和Math1对毛细胞形成的已知影响(伯明翰等人，1999年;Woods等人，2004年)，我们选择在耳蜗祖细胞中过度表达Math1，以证实基于电穿孔的转染技术足以影响感觉上皮细胞的命运。正如预期的那样，祖细胞转染了pCLIG-数学1基于抗EGFP和毛细胞特异性抗体抗肌球蛋白VIIa的双重标记，表达质粒持续发展为毛细胞(图4G公司)或指骨肽来识别位于每个毛细胞腔表面的富含肌动蛋白的静纤毛束(图4H（H）). 对位于感觉上皮内的细胞的细胞命运进行量化表明，100%(n个=100）转染细胞pCLIG-数学1分化为毛细胞(表1和补充表1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).

Id过度表达抑制毛细胞形成

为了确定与Math1相比，Id蛋白的转染是否会对细胞命运产生相反的影响，用pCLIG-Id3表达质粒。因为Id1、Id2、和识别码3耳蜗内部基本相同，只有一个Id，识别码3，用于转染。Id3的选择基于Id1和Id3在神经发育中的重要性(Lyden等人，1999年)事实上，它对E47的结合亲和力低于Id1(Langlands等人，1997年). 因此，Id3的过度表达似乎不太可能产生非特异性效应。大多数细胞转染了识别码3肌球蛋白VIIa标记质粒为阴性(图5A类)这些细胞也没有用指骨苷标记确定的静纤毛束（数据未显示）。此外识别码3-转染的细胞与支持细胞一致，包括管腔突起的延伸，这些突起似乎在相邻的毛细胞之间交叉(图5A–C). 同样与支持细胞命运一致的是识别码3-转染细胞通常位于基底膜附近。

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图5。

的过度表达识别码3抑制毛细胞分化，但不阻止感觉上皮中支持细胞的发育。A类，转染Id3的外植体中的感觉上皮（绿色；表示为Id3-EGFP）。内外毛细胞用肌球蛋白VIIa（红色）标记。存在两个转染细胞（箭头）。每个细胞的肌球蛋白VIIa为阴性，其形态与支持细胞一致。B类，共焦Z轴-两个Id3-转染细胞的堆叠横截面A类每个细胞都有一个位于基底膜附近的细胞体（星号）和一个管腔突起（箭头）。C类，共焦Z轴-转染细胞的堆栈视图识别码3（绿色）。同一图像中的毛细胞被标记为红色的肌球蛋白VIIa。注意细胞体的基底位置（星号）和管腔投影（箭头）。D类，用支持细胞标记Jagged1（Jag1；红色）标记的外植体中感觉上皮的表面视图。毛细胞显示为黑色圆圈（星号），而交叉指状的支持细胞为红色。E类，与中的图像相同D类，有三个识别码3-转染细胞用绿色表示（箭头）。请注意，每个转染细胞对Jag1也呈阳性。F类，共焦Z轴-转染细胞的堆栈横截面识别码3（绿色）。请注意，大细胞体位于基底膜附近，细延伸部分向管腔表面突出。此外，一个毛细胞（星号）位于该支持细胞的顶端突起附近，表明这是一个Deiter细胞。G公司外植体中感觉上皮的表面视图，外植体上标记有支持细胞标记Prox1（红色）。一张单人床识别码3-转染细胞如图所示（绿色）。该细胞的细胞核对Prox1呈阳性，使其呈现黄色（箭头所示）。该细胞还延伸出管腔投影。箭头指示的是Z轴-堆叠在H（H）.H（H），共焦Z轴-电池的堆栈横截面G公司图示管腔投影。注意黄色细胞核（箭头）表示Prox1的表达。根据这个细胞的形状和位置，它很可能是一个第三轮Deiter细胞。我，单个识别码3-对p75也呈阳性的转染细胞（绿色）^NTR公司（红色）。该细胞位于一排内柱细胞中，这些内柱细胞都表达p75^NTR公司在它们的内腔表面，产生一条p75的条纹^NTR公司表达式（箭头）。J型，共焦Z轴-与中相同单元的堆栈横截面我该细胞的形态与柱状细胞一致。比例尺：A类，20微米；B–E类，10微米；F类，5微米；G公司，10微米；H–J型，5微米。

转染效果的量化识别码3在总共9个单独的外植体中，只有～6%的转染细胞发育为毛细胞(表1和补充表1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 这一结果表明，祖细胞命运的测定发生了重大变化，表明Id下调在祖细胞作为毛细胞的规范中起着重要作用。

虽然识别码3-转染的细胞与支持细胞的命运一致，也可能这些细胞被阻滞在祖细胞阶段。因此，为了确定这些细胞是否已发展为支持细胞，将识别码3用抗EGFP和支持细胞特异性标记物双重标记，包括抗Jagged1、抗Prox1或抗p75^NTR公司.识别码3-转染细胞在感觉上皮内表达Jag1、Prox1和p75^NTR公司(图5D–J型)证明这些细胞已经发展成为支持细胞。这些结果表明，尽管毛细胞的发育需要Ids的下调，但Ids显然不会抑制支持细胞的形成。

Ids可以作为二进制细胞命运选择的关键调节器

大量研究结果表明，毛细胞和支持细胞是由内耳内的一个共同祖细胞发育而来的(Kelley等人，1995年;Fekete等人，1998年;Lang和Fekete，2001年). 这些结果表明，耳蜗中许多祖细胞的最终细胞命运选择之一是毛细胞和支持细胞之间的二元选择。同样，胸腺中的自然杀伤（NK）细胞和T细胞（T）也是由一种常见的双功能祖细胞发育而来的（有关综述，请参阅Pear等人，2004年). Ids，特别是Id2，在T/NK前体必须转化为T细胞或NK谱系细胞的分叉点上发挥作用(Morrow等人，1999年;Ikawa等人，2001年). bHLH转录因子的活性是T系分化所必需的；然而，Id2的表达有效地抑制了bHLH的活性，从而导致了NK的命运。在识别码2突变体，NK细胞大大减少，而Ids的过度表达导致NK细胞的承诺增加(Heemskerk等人，1997年;Ikawa等人，2001年). 这里的结果表明，Ids在毛细胞和支持细胞之间的选择中起着类似的作用。

在毛细胞和支持细胞之间的选择中，应考虑Ids的两个可能角色。首先，Ids可能通过抑制Math1/E蛋白异二聚体间接参与毛细胞的结合。这一建议得到以下事实的支持：在包括肌发生和神经发生在内的不同发育事件中，Ids通过bHLH转录因子的功能失活抑制分化(Benezra等人，1990年;1993年1月和1月;Lee，1997年;Martinsen和Bronner-Fraser，1998年). 然而，Ids也可能在诱导支持细胞命运中发挥直接作用。如果是这样，Ids的表达应足以直接诱导支持细胞的命运。先前的结果表明，GER内的细胞可以被诱导发育为支持细胞(Woods等人，2004年). 在这些研究过程中，在耳蜗外植体的GER中生成了数百个Id3转染细胞，但这些细胞均未表达任何测试的支持细胞标记物（数据未显示）。因此，这些结果表明Ids通过抑制Math1间接调节细胞命运。

身份证件基因调控

调节身份证件耳蜗中的基因尚不清楚。特别是，尚不清楚身份证件在中被下调数学1-阳性细胞。一些研究表明识别码受细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cdk2）负调控(Hara等人，1997年). 此外，有报道称Cdk2参与Corti器官的发育(Malgrange等人，2003年). 因此，Cdk2可能会调节识别码在耳蜗里。此外，以前的数据表明Id1–Id3被泛素-蛋白酶体途径降解(Bounpeng等人，1999年). 其他研究表明Hes1能够隔离Id2，防止二聚化(Jogi等人，2002年). 然而，Hes1不太可能负调控Id表达，因为Hes1仅在Corti器官发育期间的支持细胞中表达。有趣的是，已经确定了用于标识1和识别码3（简称Id1L（待定1L）和Id3L（识别3L）). 这些拼接变体是标识1和识别码3功能(Springhorn等人，1994年;迪德等人，1996年). 因此，耳蜗中Id调节的一种可能机制是在发育中的毛细胞中从Id1/Id3的表达切换到Id1L/Id3L。对Id剪接变异体表达的时空模式的研究可以为这一可能的机制提供有价值的数据。

Id功能丢失

这里展示的结果解决了Ids过度表达的影响。然而，研究Id功能丧失对耳蜗发育的影响将是有益的。已为生成目标删除Id1、Id2、和识别码3(Yan等人，1997年;Lyden等人，1999年;Yokota等人，1999年)据报道，单个空突变体几乎没有异常，也没有与听力缺陷相关的异常。然而，单一基因失活的相对微妙影响身份证件基因几乎可以肯定是通过功能冗余进行补偿的结果。这一假设得到了以下研究结果的支持：第1页/第3页大约在E12死亡的双突变胚胎(Lyden等人，1999年). 因为Id1、Id2、和识别码3它们在耳蜗内以类似的模式表达，似乎有必要产生一个三重突变，以观察Id功能丧失对耳朵的全部影响。

为了克服功能冗余的局限性，我们使用Id-binding伙伴I类bHLH、E47作为显性阴性，抑制未分化前感觉细胞中的Id1、Id2和Id3。Vinals等人(2004)证明E47的过度表达可以隔离Id蛋白，从而抑制Id功能。然而，E47的过度表达对祖细胞命运没有任何明显影响。这一结果表明，E47的绝对数量，因此Math1/E47异二聚体在这一过程中没有限制，而是单个细胞内Math1/E47与Id/E47异二聚体的比率指示祖细胞成为毛细胞（Math1/E蛋白比率高于Id/E蛋白比率）或支持细胞（Id/E-蛋白比率高于Math1/E-蛋白比率）。这些发现还表明，Ids在毛细胞和支持细胞发育中的作用可能超出了对Math1/E蛋白异二聚体形成的直接抑制。

有趣的是，以前的结果表明，Id同源物的下调大外毛类(电磁兼容性)对无调性的(原子能机构)，的果蝇数学1同系物和光感受器发育果蝇属(Brown等人，1995年). 然而，同样的研究表明电磁兼容性和多毛的，一个果蝇属同系物HES公司基因，允许阿托光感受器的上调和随后的早期分化。这一结果表明，单独抑制Id可能不足以影响细胞命运。相反，如下文所述，可能需要同时抑制Id和Notch才能看到功能表型的丧失。