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神经科学杂志。2006年5月10日；26(19): 5256–5264.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.0984-06.2006
预防性维修识别码：项目经理C6674236
PMID：16687518

帕金森氏病脑线粒体复合物I亚单位氧化损伤，功能受损和组装错误

保拉·基尼,1 Jing Xie（音译）,2 罗德里克·卡帕尔迪,2,三和詹姆斯·贝内特1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在散发性帕金森病（PD）患者的多个组织中发现了电子传输链（ETC）中线粒体复合物I催化活性的丧失，这是一些帕金森病模型神经毒素的一种特性。使用针对整个复合物I大组装体的特殊ETC亚单位特异性和复合物I免疫捕获抗体，我们定量了10例PD和12例年龄匹配对照（CTL）样本脑线粒体中ETC蛋白和复合物Ⅰ亚单位的蛋白氧化。我们测量了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）通过络合物I驱动的电子转移速率，并将其与络合物I亚基的氧化水平及其8kDa亚基的减少相关联。PD脑复合体I显示ND6增加11%，其8kDa亚基减少34%，含有47%以上的蛋白羰基，这些羰基定位于线粒体和核基因组编码的催化亚基。我们发现复合体II–V的ETC蛋白水平没有变化。通过将CTL脑线粒体与NADH在鱼藤酮存在下孵育，而不是通过外源性氧化剂，可以复制PD复合物I的氧化损伤模式。通过复合物I的NADH驱动的电子转移速率与复合物I蛋白的氧化状态呈负相关，与PD 8 kDa亚基的减少呈正相关。PD脑线粒体复合体I功能降低似乎是由于其催化亚单位从内部过程氧化而非外部氧化应激所致，并与复合体I组装错误相关。这种复合物I自动氧化可能源于线粒体或核编码亚单位、复合物I组装因子、鱼藤酮样复合物I毒素或某些组合的异常。

关键词：复合物I、帕金森氏症、电子传输链、蛋白质氧化、加氧酶、线粒体

介绍

帕金森氏病（PD）是一种神经退行性疾病，会产生弥漫性蛋白聚集病理学，但黑质多巴胺能神经元会发生相对选择性的死亡，导致詹姆斯·帕金森（James Parkinson）于1817年首次描述的运动异常，并用多巴胺能疗法进行治疗。以常染色体显性或隐性遗传方式传播的罕见家族型帕金森病已被追踪到多个基因的突变。对于某些常染色体形式的帕金森综合征，线粒体功能障碍正在成为发病机制的共同主题(Ved等人，2005年)。

鱼藤酮等神经毒素(Greenamyre等人，2003年；Panov等人，2005年)和MPTP(Przedborski和Vila，2003年；Przedborski等人，2004年)用于创建PD模型，通过抑制复合物I的电子传输链（ETC）发挥作用。复合物I催化活性受损，见于多个PD组织(帕克和斯威德洛，1998年；Shults，2004年)，表明存在系统性ETC损害。PD患者血小板线粒体DNA在神经细胞杂交模型中的表达部分复制了复合物I缺陷(Swerdlow等人，1996年)，增加氧化应激(Swerdlow等人，1996年)并自发产生具有路易体生化和微观特性的蛋白质聚集体(Trimmer等人，2004年). PD杂交中的氧化应激驱动应激相关的细胞信号传导，导致caspase介导的生存率降低(Onyango等人，2005a). 这些cybridge发现表明PD mtDNA在降低复合物I活性、增加氧化应激和自发细胞死亡方面发挥着重要的致病作用。

复合物I是ETC大分子复合物中最大的，由46个亚基组成，其中7个亚基由线粒体DNA编码。其余39个亚单位由核基因编码，导入线粒体，并在复杂的过程中与mtDNA编码的亚单位组装(Antonicka等人，2003年；Ugalde等人，2004年；Vogel等人，2005年). 7个mtDNA编码的亚单位是疏水性的，并被认为与7个核亚单位组装成一个催化活性的“最小基本集合”，物理上位于L型复合物的内膜臂中。线粒体DNA和核DNA编码亚单位中的遗传缺陷或任何损害大分子组装的因素都会损害复合物I的活性。

我们进行了本研究，以了解帕金森病大脑复合体I是如何受损的。我们使用免疫捕获技术分离催化活性ETC复合物以显示复合物I亚单位(Murray等人，2003年). 我们观察到帕金森病脑复合体I受到氧化损伤，损伤最严重的亚单位由最小基本群的成员代表。外源性氧化剂不能完全复制PD脑复合体I的氧化损伤模式，但可以通过在醌还原位点用鱼藤酮阻断来复制，并与通过复合体I电子通量的速率呈负相关。PD脑中的复合体I组装错误或不稳定，其8 kDa亚基的显著缺失反映了这一点。我们的研究结果表明，PD脑复合体I通过目前尚不清楚的机制氧化损伤其自身的催化亚单位，导致其宏观组装不稳定和生物能量功能丧失。

材料和方法

浓缩线粒体部分制剂。

通过改进Lai和Clark的方法制备富集的人脑线粒体部分(Lai和Clark，1978年). 从弗吉尼亚大学脑资源设施获取神经病理学确诊对照组（CTL）和帕金森病（PD）病例的缓慢冷冻皮质带样本，该设施根据机构审查委员会批准的方案收集这些病例。从尸检到使用时，组织保存在−70°C的空气容器中。在冰镇隔离缓冲液（0.15）中切碎2至7 g额叶皮层米KCl，20米米磷酸钾，1 m米EDTA，pH 7.6），使用Dounce均质器（0.05mm间隙）在7体积的隔离缓冲液中均质50次，并在4°下以1300×克将上清液保存在冰上，将颗粒在6体积的隔离缓冲液中均匀化30次，然后在1300×克.将上清液合并并以17000×离心20 min克温度为4°C。P2颗粒用隔离缓冲液清洗并再次离心。对于梯度纯化的线粒体，P2颗粒在10 ml隔离缓冲液中再次悬浮，在玻璃-聚四氟乙烯均质器中使用10次（0.15 mm间隙），在12 ml 10%Ficoll和10 ml 7.5%Ficoll（隔离缓冲液w/v）的梯度上分层，并在85470×克温度为4°C。将最终粒剂重新悬浮在200μl梯度纯化样品或500μl细胞内缓冲液（125 m）中米KCl，20米米HEPES，2米米千赫2人事军官4，5米米氯化镁2，10米米EGTA，pH 7.0），用于线粒体富集组分。蛋白质浓度使用DC蛋白质测定法（Bio-Rad，Hercules，CA）测定。将未用于AmplexRed分析的线粒体部分进行分离，并在21000×克温度为4°C。一个颗粒重新悬浮在线粒体冷冻缓冲液中（50 m米咪唑/HCl，15%甘油，250米米蔗糖，50米米NaCl）并储存在−80°C。剩余的线粒体颗粒和部分粗颗粒重新悬浮在改良的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中[50 m米三盐酸，pH 7.4；1%NP40，0.25%脱氧胆酸钠，150米米氯化钠，1 m米EGTA，1米米原钒酸钠，1 m米氟化钠，1 m米PMSF和1:100蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装I（加州La Jolla Calbiochem）]，超声2分钟，在冰上保持30分钟，每5分钟旋转一次，15000×克将上清液储存在−80°C下10 min，用于随后的SDS-PAGE。

线粒体部分纯度的SDS-PAGE免疫印迹分析。

使用Micro-BCA蛋白质检测试剂盒（皮尔斯，罗克福德，IL）测定线粒体和粗颗粒部分在改良RIPA缓冲液中的蛋白质浓度。将每个样品的蛋白质（50μg）用5%2-巯基乙醇溶解在Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）中，然后煮沸5分钟，并在10-20%Tris-HCl标准凝胶（Bio-Rad）上电泳。SDS-PAGE凝胶在转移缓冲液[25 m米Tris基地，192米米甘氨酸、20%（v/v）乙醇、0.05%（w/v）SDS]和蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上，用Tris缓冲盐水（TBS）和0.05%吐温20（T-TBS）清洗，并在T-TBS中的5%奶粉中封闭1小时。过夜一级抗体孵育使用1:2500小鼠抗-N个-钙粘蛋白（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）、1:250小鼠抗GM 130（BD Biosciences）、0.05μg/ml小鼠抗Hsp 60（热休克蛋白60）（Stressgen，Victoria，British Columbia，Canada）、4μg/ml小鼠抗四肽（Stressgen）、1μg/ml小鼠抗突触融合蛋白13（Stressgen）和1.75μg/ml小鼠抗孔蛋白封闭缓冲液。在室温下额外培养2小时后，在T-TBS中清洗六次斑点，在1:25000驴抗鼠IgG（重+轻）HRP（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）封闭缓冲液中培养1小时，在T-TB中清洗三次，在TBS中洗三次，并在SuperSignal West Dura（Pierce）中培养4分钟。在Bio-Rad Fluor-S多成像仪中检测化学发光5分钟。

线粒体复合物I/氧化磷酸化亚基的SDS-PAGE免疫印迹分析。

将20微克的每个线粒体蛋白样品装入10-20%SDS-PAGE梯度凝胶的微孔中。在1.5小时150V电泳后，将样品转移到CAPS电泳转移缓冲液中[10 m米CAPS（C2632；Sigma，St.Louis，MO），10%甲醇，pH 11]，从凝胶到聚偏二氟乙烯膜（孔径0.45μm；Millipore，Bedford，MA），150 MA，持续2小时。所有初级抗体均购自MitoSciences（Eugene，OR），并稀释至适当浓度，如下所示。使用的二级抗体是山羊抗鼠HRP（Bio-Rad），使用ECL++Western印迹检测系统进行检测（英国GE Healthcare，Little Chalfont，英国）。

复合物I的免疫捕获。

使用Micro-BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce）测定再次悬浮在冷冻缓冲液中的线粒体组分的蛋白质浓度。将5毫克线粒体部分蛋白在缓冲液A中稀释至900μl[50 m米Tris-HCl，pH 7.5，1:100蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装I（钙生物化学），1米米PMSF，pH 7.5]，含100μl 10%正十二烷基β-d日-加入麦芽糖苷，在冰上培养30分钟，21000×离心30分钟克温度为4°C。添加复合物I捕获矩阵（MitoSciences）并在4°C下培养过夜，然后在室温下培养2小时。在3200×离心3分钟后克在4°C的条件下，用缓冲液A将颗粒洗涤两次5 min，然后将颗粒重新悬浮在40μl的1%十二烷基硫酸钠中，并在室温下培养10 min。在3200×离心3分钟后克，4°C，保存上清液，添加5μl洗涤蛋白A/G加琼脂糖（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司），在室温下培养1小时，并像以前一样离心；上清液被保存了下来。使用微型BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce）测定释放的免疫捕获复合物I样品中的蛋白质浓度。

复合物I蛋白羰基的SDS-PAGE免疫印迹分析。

通过将饱和SDS添加到10μg免疫捕获复合物I中，衍生捕获珠释放的免疫捕获复合体I样品，然后添加2,4-二硝基苯肼（DNPH）溶液（OxyBlot Kit），并在室温下培养15分钟。添加中和溶液（OxyBlot Kit）以停止反应；添加2-巯基乙醇，并在10-20%Tris-HCl标准凝胶（Bio-Rad）上对样品进行电泳。将SDS-PAGE凝胶转移到PVDF膜上，并使用抗DNPH的一级抗体如上所述进行开发。使用Bio-Rad Fluor-S MultiImager采集化学发光产生的图像，并使用Quantity One软件（版本4.4.1；Bio-Ra德）进行分析。该软件自动检测谱带，从谱带强度中减去背景值，并根据标准分配分子量（MW）。为了比较保存所有样品所需的两种凝胶的DNPH带强度，在每个凝胶上运行蛋白质-DNPH标准。DNPH-胰蛋白酶抑制剂带的强度（参见图3)作为标准，比较凝胶中CTL和PD线粒体免疫捕获复合物I样品中DNPH免疫染色的强度。

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免疫捕获复合物I样品中的蛋白质羰基水平。来自额叶皮层的相同线粒体制剂用于所有图形。显示了用DNPH、SDS-PAGE、转移和DNPH免疫染色衍生后，从三个CTL（CTL）和六个PD脑的10μg免疫捕获复合物I蛋白样品中获得的免疫印迹。最左边的带（“DNPH”）显示了DNPH蛋白标准物的位置和相对强度。箭头指向DNPH-胰蛋白酶抑制剂带，该带被用作标准，以使所有其他检测到的带正常化。MW标记带未显示。有关详细信息，请参见材料和方法。

质谱分析的样品制备。

对免疫捕获的复合物I样品进行衍生化和电泳，以进行复合物I蛋白羰基分析。将所得凝胶在50%甲醇/7%乙酸中固定1 h，在水中洗涤15 min，并用SYPRO红宝石蛋白凝胶染色剂（Invitrogen、Eugene、OR）染色过夜。将凝胶在10%甲醇/7%乙酸中脱色30分钟，并用水冲洗，然后用手术刀片切除感兴趣的条带。质谱（MS）分析由弗吉尼亚大学W.M.Keck生物医学质谱实验室（主任N.Sherman博士）进行。感兴趣的凝胶带在50%甲醇中脱色2 h，用10 m减少30 min米0.1中的二硫苏糖醇米碳酸氢铵（Ambic），用50 m烷基化30 min米Ambic中的碘乙酰胺。凝胶块在Ambic中用20 ng/μl Promega（威斯康星州麦迪逊）胰蛋白酶消化18 h之前，用SpeedVac（纽约州希克斯维尔市萨凡特）干燥。用50%乙腈/5%甲酸（组合）萃取两次肽，并蒸发至20μl，以便在热电电子（宾夕法尼亚州匹兹堡）上进行液相色谱（LC）-MS分析LTQ-FT混合离子阱（IT）-离子回旋共振（ICR）质谱仪系统，带有Protana纳米喷雾离子源，与内径为8 cm×75μm的Phenomenex（Torrance，CA）Jupiter 10μm C18反相毛细管柱相连。注入一微升肽提取物，用乙腈/0.1从色谱柱中洗脱肽米乙酸梯度以0.3μl/min的流速超过30分钟。纳米喷雾离子源在2.8 kV下运行。消化液的分析方法是获得一个全扫描质谱（ICR，100 K分辨率），然后是10个产物离子光谱（IT）。该分析产生了~1500个产品离子光谱，其丰度超过几个数量级。使用Sequest算法对NR（国家生物技术信息中心）数据库进行数据库搜索，对数据进行分析。最终结果由人工验证。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸驱动的超氧化物生成。

使用检测线粒体过氧化氢的Amplex Red方法的变体测量了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）驱动的电子通量通过络合物I的速率(Starkov和Fiskum，2003年). 96周板中200μl的最终反应体积包含细胞内缓冲液中最终蛋白水平为0.4 mg/ml的脑线粒体（见上文）、超氧化物歧化酶1（SOD-1）（40 U/ml）、HRP（5 U/ml米). 可变添加物包括β-NADH（125μ米),第页-苯甲酸羟汞（60μ米)、辣椒素（20μ米)、鱼藤酮（10μ米)或癸基辅醌（60μ米). 反应混合物在37°下培养四份，在550 nm激发和580 nm发射下每5分钟读取一次读数。计算了前20分钟内Amplex Red的氧化速率。

NADH驱动的复合物I氧化。

将CTL脑样品中的线粒体制剂（18-27 mg蛋白质）置于细胞内缓冲液中，在37度的温度下，在125μ米或1.25米米NADH，60μ米癸基辅醌，无或有第页-苯甲酸羟汞（60μ米)、辣椒素（20μ米)或鱼藤酮（10μ米). 所有培养物均含有蛋白酶抑制剂和PMSF。孵育后，将线粒体丸化、洗涤并溶解，以进行上述复合物I免疫捕获和蛋白质羰基检测。

复合物I催化活性。

鱼藤酮敏感NADH的氧化速率在37°0.1米K-PO公司4缓冲液，pH 7.4，含有辅酶Q1（0.1 m米)，KCN（1米米)、和NaN三（2米米). 通过添加0.25 mg线粒体蛋白和β-NADH（0.3 m米). 在340 nm下的吸光度持续180 s，然后鱼藤酮（1μ米)添加后，反应又进行了180秒。

结果

人额叶皮层线粒体的分离

我们从12个CTL和10个PD死后大脑样品的额叶皮层样品中分离出P2颗粒形式的线粒体。每一个PD额叶皮层样本都由一名工作人员神经病学家进行检查，发现没有其他退化过程，如阿尔茨海默病（弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学B.Miller，个人通信）。死亡年龄无显著差异[PD，75.1±9.2（SD）；CTL，67.8±13.1；第页=0.14]或尸检间隔，直到解剖组织被放入冷冻室[PD，13.1±3.8 h；CTL，11.4±8.2，第页= 0.54]. CTL病例中有6名男性和6名女性。帕金森病患者中有7名男性和3名女性，这与帕金森病的男性优势（～1.5倍）相一致。帕金森病病人的已知临床特征如所示表1; 在大多数情况下，没有用药记录。半纯化线粒体制剂在PD（1.0±0.5 SD）和CTL（1.2±0.4 SD）中孔蛋白（主要是线粒体外膜）和N-钙粘素（主要是质膜）的带密度比率相似(第页=0.3），表明线粒体富集程度相当。我们没有发现PD和CTL线粒体制剂之间的孔蛋白带密度有任何显著差异（数据未显示）。

表1。

帕金森病患者的临床特征

案例性别年龄（岁）采购经理人指数临床病史
166M（M）5214.5严重、快速进展的PD；IDDM；通用报告格式；抑郁
168F类7315.5帕金森病23年hx；抑郁；尸检时皮质斑块不符合AD标准
170M（M）7612.75TURP死亡前11年；直立性低血压；没有证据表明有MSA
171M（M）835.5PD的4年hx；甲状腺功能减退；无声的渴望；邮寄时无AD或MSA证据
172M（M）8410PD 12年hx（dx前6年症状）；抑郁；邮寄时无AD或MSA证据
174F类8213.5抑郁；盘状红斑狼疮
175M（M）7916.5PD的10年hx；可能为慢性淋巴细胞白血病；神经原性膀胱；岗位无广告
182M（M）7715PD的37年hx；强直阵挛性癫痫发作；视觉幻觉；局灶性海绵状空泡
187F类739.5>PD的20年hx
203M（M）7218PD 26年hx；s/p CABG×5；吸烟hx

M、 男性；F、 女性；冠状动脉旁路移植术；CRF，慢性肾功能衰竭；hx，历史；dx，诊断；胰岛素依赖型糖尿病；MSA，多系统萎缩；PMI，尸检间隔（小时）；事后、尸检；经尿道前列腺电切术；s/p，状态栏。

PD额叶皮层线粒体制剂中复合物I催化活性降低

我们通过测量辅酶Q1存在下NADH消耗的鱼藤酮敏感率来测定传统的复合物I催化活性（NADH：泛醌氧化还原酶）。由于线粒体制剂在其他实验中的广泛使用，我们只能在6个CTL中检测复合物I的催化活性，但在所有10个PD样品中检测复合物I的催化活性。去除一个PD异常值样本（该样本是平均CTL值的2.5倍，是其最近PD邻居的2.5倍）后，其余9个PD样本显示总体减少32%第页每毫克线粒体蛋白表达=0.06。我们还有四个CTL和七个PD样品，其中我们能够检测复合物I催化活性和相对孔蛋白水平（通过Western blot），作为线粒体外膜质量的标记。当归一化到孔蛋白带密度时，这些PD样品的复合物I活性降低了30%第页= 0.05.

PD和CTL脑线粒体具有来自复合物II–V的类似蛋白质水平

我们在ETC复合物中使用了针对各种蛋白质的单克隆抗体混合物。Western blot图像的定量带密度测定未显示复合物II–V蛋白质的PD和CTL样品之间的任何差异(图1)。

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CTL和PD脑线粒体ETC亚单位的Western blot。所有图形均使用来自额叶皮层样品的相同线粒体制剂。显示CTL和PD线粒体样本的印迹图像。底部的表格给出了下面SDs的实际平均带密度。第页CTL组和PD组的比较值没有显示出任何显著差异。有关详细信息，请参见材料和方法。CI–CV，复杂I–V。

PD脑线粒体略微增加了ND6蛋白，减少了复合物I的8kDa亚单位

在复合体I亚基的Western blot中，带密度测定显示PD脑线粒体显示小（11%）但显著(第页=0.005）增加20kDa ND6蛋白水平，这是七种mtDNA编码的复合物I蛋白之一(图2). 更令人印象深刻的是减少了33%(第页=0.0004）帕金森病（PD）脑线粒体复合物I的8kDa亚基水平。

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复合物I亚单位CTL和PD线粒体的Western blot。所有图形均使用来自额叶皮层样品的相同线粒体制剂。显示CTL和PD线粒体样品的印迹图像，并如前所述定位复合物I亚基带(Triepels等人，2001年；Murray等人，2003年). 底部的表格给出了实际的平均带密度以及下面的SDs。第页值表明20和8 kDa亚基存在显著差异。有关详细信息，请参见材料和方法。

PD复合物I中的蛋白质羰基增加

我们使用免疫捕获技术从10个PD和12个CTL额叶皮质样品中分离出线粒体中完整的复合物I大组装体。然后用二硝基苯肼（DNPH）衍生从珠子中释放的等量（10μg）免疫捕获复合物I蛋白质，以揭示蛋白质羰基，作为氧化损伤的迹象。然后在SDS-PAGE上分离DNPH衍生蛋白，进行印迹，并用抗DNPH抗体进行免疫定位。这种污点的示例如所示图3.车道总密度的定量分析表明，与CTL样品相比，PD中的总DNPH反应性增加了47%(第页< 0.001). 通过我们的软件，在免疫印迹上的所有样本中都可以一致地识别出12条DNPH条带。对这些单独谱带密度的分析表明，PD/CTL强度的比值在0.95到1.56之间变化。对于五个波段，PD样品中DNPH反应性的增加强度与CTL样品中的差异具有统计学意义。这些波段的数据显示在表2。

表2。

PD脑线粒体复合物I亚基的DNPH反应性

波段MW（～kDa）PD/CTL公司第页价值(t吨测试）发现肽(n个)
1131.20.02未分析
2151.20.08
三161
4181
5211.1
6261.30.04NDUFB5（2）
NDUFB6（8）
NDUFB7（2）
7351.1
8451
9481.20.03ND4（1）
ND5（10）
NDUFS2（8）
NDUFV1（19）
10761.1
11941.60.02NDUFS1（43）
122321.30.02未分析

从PD和CTL脑线粒体制剂中免疫捕获复合物I大组装体，然后用DNPH衍生，电泳并免疫印迹DNPH，如材料和方法中所述。DNPH（+）带通过Quantity One软件（Bio-Rad）定量。在一个单独的凝胶中，与在～26、～48和～94 kDa的DNPH印迹中看到的相应条带被切割出来并通过质谱分析。质谱输出作为补充数据中的单个Excel文件提供（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)。

与DNPH带对应的复合物I亚基的鉴定

为了确定PD脑线粒体氧化损伤增加的条带中存在哪些复合物I亚基，我们用SyproRuby荧光蛋白染色同时用DNPH衍生的复合物I蛋白进行SDS-PAGE凝胶染色，去除三个条带，并通过LC-MS质谱分析。结果显示在表2并表明我们可以鉴定出两个mtDNA编码亚单位（ND4，ND5）和六个核DNA编码子单位（NDUFS1，NDUFS2，NDUFV1，NDUFB5，NDUVB6，NDUFF7）。质谱蛋白质鉴定的详细信息作为补充数据提供（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)。

NADH驱动的超氧化物生成动力学

我们将分离的线粒体暴露于NADH中，以测定在基础条件下和在复合物I内不同点抑制电子转移期间电子通过复合物I的速率(图4). 基本原理是，NADH衍生的电子在几个潜在电子转移点离开络合物I，与环境氧反应形成超氧化物，然后通过内源性SOD-2转化为过氧化氢，并添加外源性SOD-1。在添加的过氧化物酶（HRP）存在下形成的过氧化氢将非荧光AmplexRed染料氧化为荧光形式，然后检测到。因此，SOD-1/HRP/AmplexRed系统可作为任何形成的超氧物的陷阱，并捕获在任何点离开络合物I的电子形成的超氧化物。另一个需要考虑的是，任何形成的过氧化氢也可以被线粒体基质谷胱甘肽过氧化物酶降解。因此，AmplexRed的氧化速率可能显著低于传统络合物I催化分析测定的NADH氧化速率。

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顶部，NADH驱动的AmplexRed氧化实验示例。所示为从人类额叶皮层分离出的0.4 mg/ml线粒体蛋白的孵育典型结果，并在37°下孵育，添加指定的添加剂。左侧是CTL大脑的结果，右侧是PD大脑的结果。底部，电子流经复合体I.线粒体的图；IM、OM、线粒体内外膜；FMN，黄素单核苷酸；N-（x），Fe-S团簇；Q、 辅酶Q改编自Genova等人（2004年）。

典型动力学数据示例如所示图4我们发现，在没有线粒体但存在NADH的情况下，AmplexRed的基本氧化速率为5%或低于存在线粒体和NADH时的氧化速率。氧化AmplexRed的增加速率在最初的30分钟内通常是线性的，并且在最初的20分钟内计算Amplex红色的氧化速率。表2总结了2004年9月至10月进行的两组实验（五个CTL，六个PD）和2005年3月使用不同样本（五个CT，四个PD）的结果。为了使各实验组的Amplex Red氧化速率标准化，将各实验组中的值标准化为每组的平均CTL值。通过这种方法，PD样品的NADH驱动电子通量平均总体减少27%(第页=0.003）仅含NADH，减少24%(第页=0.02）当添加癸基辅醌作为终端电子受体时。

我们研究了在配合物I内不同点抑制电子转移对NADH驱动的AmplexRed氧化速率的影响(表3). 我们使用了Fe-S簇的抑制剂(第页-羟基汞苯甲酸），从Fe-S簇N-2到氧化醌的电子转移的“B型”抑制剂（鱼藤酮），以及醌还原到QH的“C型”抑制剂2以及添加癸基辅醌作为终端电子受体(图4). 我们将这些抑制剂存在时NADH驱动的AmplexRed氧化速率归一化为NADH单独存在时每个样品线粒体观察到的氧化速率的百分比。我们观察到这些抑制剂在PD和CTL样本之间的作用没有差异，但PD脑线粒体对辣椒素的抑制不太敏感。(表3). 请注意，鱼藤酮的添加对NADH驱动的AmplexRed氧化速率的总体影响最小，这表明该分析所测量的现象与传统的复合物I催化分析不同，后者依赖于泛醌为唯一电子受体时的初始NADH氧化速率。AmplexRed氧化速率以H表示2O（运行）2形成于～200至～300 pmol/mg/min之间，与在复合I底物上的大鼠脑线粒体呼吸值非常类似(Starkov和Fiskum，2003年). 然而，由于我们的线粒体是从冰冻的尸检样本中分离出来的，因此不太可能发生任何真正的呼吸（电子传递与氧气消耗耦合）。

表3。

复合物I电子转移抑制剂对NADH驱动的CTL和PD脑线粒体AmplexRed氧化的影响

添加CTL公司PD公司第页价值(t吨测试）
NADH公司100%CTL的73%0.003
NADH+癸基辅醌100%CTL的76%0.02
%仅NADH
NADH+pOH苯甲酸汞80740.53
NADH+辣椒素57710.03
NADH+鱼藤酮88940.62
NADH+癸基辅醌1041070.61
NADH+癸基UB+鱼藤酮1171200.77

在PD和CTL线粒体制剂中，使用AmplexRed检测NADH驱动的ROS生成，如材料和方法中所述。如图所示，在复合物I中添加了各种电子转移抑制剂。癸基UB，癸基辅醌。

我们从SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞分离线粒体，并检测冷冻/解冻对上述抑制剂改变NADH驱动的AmplexRed氧化能力的影响。我们还从一名接受颞叶切除治疗癫痫的患者身上获取了新鲜颞叶皮质标本。我们从这个新鲜的脑组织中分离出线粒体，并将该样本的一部分速冻保存过夜，然后从中分离线粒体。对于从SH-SY5Y细胞和颞叶皮层分离出的线粒体，冷冻/解冻线粒体制剂，或者在线粒体分离之前冷冻脑组织，不会改变NADH驱动的AmplexRed氧化速率，也不会定性地改变抑制剂或添加癸基辅醌刺激的效果。然而，冷冻持续轻微降低了添加的癸基泛醌对NADH驱动的AmplexRed氧化的刺激（未显示）。

复合物I氧化损伤程度与NADH驱动电子流过复合物I速率的关系

我们探索了通过免疫捕获复合物I中蛋白质羰基含量的DNPH分析测定的脑线粒体复合物I氧化损伤水平与线粒体部分测定的NADH驱动的电子流过复合物I的速率之间的关系。结果显示在图5并表明氧化损伤程度与NADH驱动的电子流速率呈负相关。复合物I蛋白氧化程度与死亡或死亡间隔时间的年龄之间没有相关性（数据未显示）。

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NADH驱动的AmplexRed氧化的线粒体速率与复合物I带中的蛋白质羰基水平呈负相关。所示为免疫捕获复合物I中NADH驱动的线粒体AmplexRed氧化速率（表示为%CTL值）与蛋白质羰基光密度（SDS-PAGE凝胶中不同的DNPH带）的关系图。CTL样品为圆形，PD样品为方形；R（右）线性回归拟合值和第页显示了回归拟合的值。

NADH加鱼藤酮氧化络合物I产生PD图案

我们到这一点的结果表明，PD脑复合体I对线粒体和核基因组编码的许多复合体表现出更大的氧化损伤，这些复合体在催化方面很重要，并且这种氧化损伤似乎抑制NADH刺激的电子流过复合体I。然后，我们检验了PD中复合物I氧化损伤升高是由电子转移受损引起的假说。我们在复合物I中不存在或存在各种电子转移抑制剂的情况下，用NADH和癸基辅醌培养CTL脑线粒体，并检查免疫捕获复合物I的氧化损伤模式。如所示图6A类，与125μ孵育米在添加鱼藤酮之前，NADH不会增加免疫捕获复合物I中的DNPH反应性。然后产生一种类似于在PD脑中自发观察到的DNPH反应模式。这一点尤其值得注意的是，在～50 kDa的带中发现含有mtDNA编码的亚单位ND4和ND5，以及两个催化重要的核DNA编码亚单位NDUFS2和NDUFV1。CTL脑线粒体暴露于外源性氧化剂（过氧化氢）并没有完全重现PD脑中观察到的模式(图6A类). 然后，我们用另外两个CTL脑的线粒体制剂重复了这个实验，并将线粒体暴露在10倍高的[NADH]（1.25 m米)在没有鱼藤酮的情况下（车道1和3）或存在鱼藤酮（车道2和4）。这种[NADH]已被证明对牛复合物I的催化亚单位产生氧化损伤(Chen等人，2005年)并引起约50 kDa带的强烈DNPH标记，鱼藤酮没有进一步增加(图6B类). 鱼藤酮孵育增加了两种CTL线粒体制剂免疫捕获复合物I中～26 kDa带的DNPH标记。

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NADH加鱼藤酮增加复合物I亚单位的氧化损伤。将CTL额叶皮质样品中的线粒体与所示成分一起培养75分钟，然后清洗，然后免疫捕获复合物I并分析蛋白质羰基，如材料和方法中所述。A类，[NADH]=125μ米、鱼藤酮（10μ米)在18、21、26、37、50和94 kDa的谱带中，DNPH反应性似乎增加。过氧化氢仅增加了～20kDa波段的DNPH反应性。B类，在其他两种CTL脑线粒体部分中，[NADH]高出10倍1.25 m米（通道1和3），鱼藤酮（10μ米，泳道2和4），但鱼藤酮明显增加了~26kDa带的能量。通道1和通道3来自1.25 m培养的单独CTL脑线粒体制剂米NADH公司。泳道2和4来源于用于产生泳道1和3的CTL线粒体制剂，但在添加10μ米鱼藤酮。

帕金森病脑线粒体中8kDa复合物I亚单位水平降低与复合物I氧化损伤和NADH驱动的AmplexRed氧化率相关

然后，我们探讨了PD和CTL额叶皮层线粒体样品中8kDa亚基水平与复合物I氧化损伤以及NADH AmplexRed氧化速率之间的关系。如所示图7，8kDa复合物I亚基的水平分布在CTL样品中受到限制，并且几乎与PD样品完全分离。此外，8kDa复合物I亚单位的水平与NADH驱动的AmplexRed氧化速率呈正相关，与PD脑线粒体中免疫捕获复合物I的氧化损伤水平呈负相关(图7)。

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PD（方形）和CTL（圆形）脑线粒体中8 kDa复合物I亚基水平与NADH驱动的AmplexRed氧化速率（左）和复合物I（右）中蛋白质羰基水平之间的相关性。R（右）线性回归拟合值和第页显示了回归拟合的值。

讨论

在这项研究中，我们使用了来自PD和CTL额叶皮质样本的线粒体制剂，以检测复合物I蛋白组成、电子传递功能和氧化状态。我们发现证据表明，在PD大脑中，复合物I的氧化损伤大约是CTL的一半，这反映在蛋白质羰基含量增加上，并且这种增加的氧化局限于包含由核基因组和线粒体基因组编码的催化亚基的几个条带。值得注意的是，我们的数据并没有准确定义哪些复合物I催化亚单位具有氧化损伤。这将需要对每个亚单位进行详细的蛋白质组分析，以确定氧化修饰的氨基酸。相反，我们的有限分析提供了一份可能被活性氧损伤的复合体I亚基列表，有趣的是，我们在含有增加的蛋白羰基的带中识别的所有复合体I子基都属于最小基本系综，这是一组14个疏水蛋白，被认为构成复合体I的催化核心。此外，我们没有免疫捕获其他ETC复合物，因此我们还不知道我们在PD复合物I中观察到的蛋白质羰基含量增加的模式是否仅限于复合物I。

PD脑内复合物I的亚单位带氧化模式，尤其是涉及～26和～50 kDa亚单位的亚单位，通过线粒体暴露于外源性氧化剂（过氧化氢）而无法再现但可以通过使用NADH驱动电子通过络合物I并用鱼藤酮阻止电子从Fe-S簇N-2转移到氧化醌而复制，但不能通过阻止络合物I内其他点的电子转移来复制。这表明，我们在帕金森病患者大脑中观察到的复合物I氧化模式是由内部ROS产生，而不是由复合物I外部产生的氧化剂产生。

复合物I被认为是电子传输链中产生超氧物的主要来源(Kudin等人，2004年；Lambert和Brand，2004年)和NADH与纯化牛NADH脱氢酶孵育形成的超氧物已被证明在FMN结合位点氧化修饰51 kDa亚基，导致电子传递速率降低(Chen等人，2005年). 我们尚未确定帕金森病脑线粒体复合体I中被氧化损伤的～50kDa亚基中的特定残基，但我们的初步结果表明可能会发生类似的过程，更详细的蛋白质氧化质谱分析将有价值。

免疫捕获复合物I的氧化损伤水平与NADH驱动的电子通过复合物I转移的速率呈负相关，表明似乎发生在催化亚单位上的氧化损伤具有功能相关性。虽然我们的结果没有确定与复合物I氧化损伤及其内部电子传递功能受损相关的事件顺序，但一个合理的解释是，催化核心功能受损会引发内部ROS生成，导致氧化损伤和催化核心的更多受损，在前馈范式中。如果正确的话，这种范式需要理解初始催化损伤的起源。如果在PD杂交细胞中存在类似的复合物I氧化损伤的发现，那么基于mtDNA的遗传很可能涉及缺陷的ND4或ND5亚单位，我们确定其为氧化损伤的潜在候选。在这方面，ND5的N末端区域的簇状突变可以前瞻性地预测来自PD患者的脑样本的身份(帕克和帕克斯，2005年)。

我们还观察到PD脑线粒体中复合物I的8kDa亚基显著缺失，以至于PD和CTL群体几乎完全分离，并且只与一个PD样本重叠。CTL脑线粒体中8kDa亚单位的水平紧密聚集在一起，而PD人群中8kDA亚单位的变化较大，与NADH驱动的AmplexRed氧化率呈正相关，与复合物I亚单位氧化水平呈负相关。在一项对复杂I缺陷个体的成纤维细胞线粒体的研究中，主要基于核复杂I基因的突变，8kDa亚基的水平降低最多(Triepels等人，2001年)这意味着它是复杂I装配错误的最敏感标记之一。有趣的是确定是否在帕金森病患者的可接触外周组织（例如血小板、白细胞）中可以证明类似的8kDa复合物I亚单位丢失模式，如果是，与其他成人神经退行性疾病相比，这一发现是否对PD具有特异性，以及在PD的进化过程中，8 kDa亚基的减少在什么时候变得明显。

总之，我们对迄今为止所报道的PD脑复合体I的组成和功能进行了最详细的分析。我们对进行线粒体分离所需数量的等分克组织的要求排除了使用黑质样本的可能性，我们的研究结果表明，PD是一种全脑线粒体疾病，其中复杂I功能障碍可能起重要的致病作用。帕金森病患者脑内复合物I蛋白氧化增加的原因尚待确定，尤其是其是否主要来源于核或线粒体复合物I基因的遗传突变，或环境类鱼藤酮毒素，或某些组合。此外，还不清楚是什么“起源”事件导致了这些复杂的I改变。基于聚伞花序中PD mtDNA表达产生的多种异常(Swerdlow等人，1996年；Gu等人，1998年；Trimmer等人，2004年；Onyango等人，2005a,b条)很容易推测，在多年的临床症状后，我们在脑样本中观察到的催化线粒体复合物I基因突变正在驱动ROS生成、氧化损伤和复合物I组装错误。这类事件是否也发生在PD黑质中，以及与其他脑区相比发生率如何，也是未来需要解决的一个重要问题。

脚注

这项研究得到了美国国家卫生研究院NS39788 Morris Udall Parkinson’s Disease Research Center of Excellence的支持。我们感谢Nick Sherman博士在质谱蛋白质分析方面的帮助。

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