神经科学杂志。2006年5月10日;26(19): 5265–5275.
Vangl2和Fz3的不对称定位表明哺乳动物平面细胞极性的新机制
,1,2 ,三 ,4 ,5 ,4 ,6 ,7 ,7 ,7 ,8,9 ,9 ,5 ,三和1
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院耳聋和其他沟通障碍研究所发育神经科学科,20892,2Equipe Avenir 2“神经科学发展”,法国波尔多塞德克斯国家圣母院马根迪神经科学研究所,33077,三马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院耳聋和其他沟通障碍国家研究所神经化学实验室,邮编:20892,4解剖和神经生物学系5密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院耳鼻喉科,邮编63110,6英国伦敦大学学院耳朵研究所听觉研究中心,伦敦大学学院,英国伦敦WC1X 8EE,7国家癌症研究所小鼠癌症遗传学项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克21702和8早期发育,哺乳动物遗传学单位,9英国牛津郡哈韦尔医学研究委员会OX11 0RD
通信地址:Mireille Montcouquiol,Equipe Avenir 2“神经科学发展”,F.Magendie des Neurosciences,Institute National de la Santéet de la Recherche Médicale,33077 Bordeaux Cedex,France。电子邮件:rf.mresni.xuedrob@loiuquoctnom 2005年11月1日收到;2006年3月22日修订;2006年3月25日接受。
版权©2006年神经科学学会0270-6474/06/265265-11$15.00/0 介绍
脊椎动物系统中平面细胞极性(PCP)最明显的例子之一是哺乳动物耳蜗的感觉上皮[也称为Corti器官(OC)]。OC作为一条狭窄的细胞条存在,沿着蜗管的螺旋基底至顶端轴延伸。OC本身包括多种细胞类型,包括内部和外部机械感觉毛细胞(分别为IHC和OHC)和非感觉支持细胞(SC),包括内部指骨细胞(IPh)、内部和外部支柱细胞(分别是IP和OP)以及Deiters细胞(参见A类). 所有细胞类型都排列成一排,沿着耳蜗螺旋的长度延伸。每个HC包含一束修饰的微绒毛,称为静纤毛,从其管腔表面伸出。单个静纤毛以特定的模式排列,使得每个静纤毛束的形状类似于“)”。对于每个毛细胞,束的顶点位于远端边缘(请参见A类). 这些均匀定向束的存在说明了OC中PCP的高度存在,并使该系统成为研究脊椎动物PCP调节机制的理想选择。
Vangl2位于Corti器官中,呈不对称分布。A类,哺乳动物耳蜗OC表面视图示意图。显示了近端到远端和基底到顶端的轴。OC由一行IHC和三行OHC(O1–O3)组成,沿基顶轴延伸。单个毛细胞由特定类型的支持细胞分隔,包括位于IHC之间的IPh细胞、位于OHC和OP之间的Deiters细胞(D1–D3)、位于OHC1和IP中的OHC之间的OHC,这在IHC和OHC1行之间形成了一个空间。最后,IHC的近端边缘与一排边界细胞(BC)接触。每个HC在其腔表面有一个静纤毛束(红色)。每个束的方向应确保其中心顶点位于最靠近上皮远端边缘的位置。B类,亲和纯化的Vangl2抗体可识别HEK293裂解液中的~65 kDa条带,该裂解液转染了未标记的Vangl 2构建物(通道1)、耳蜗(通道2)和大脑(通道3)。C类,D类,E18.5处大鼠耳蜗尖转OC的Lumenal表面。Vangl2(绿色)与β-连环蛋白(红色)在OC中所有上皮细胞类型的膜上共定位。Vangl2在IPh细胞(箭头)和IHC(星号)中存在一些不对称定位。相反,Vangl2在未分化的外毛细胞区域(括号)中分布均匀。电子,F类在同一E18.5大鼠耳蜗较成熟的基底翻中,Vangl2的不对称性在IPh细胞(箭头)中更为明显,但在IHC近侧(星号)和支柱细胞(白色箭头)中也很明显和第二排OHC(黄色箭头)。G公司在P1,在大鼠耳蜗的基底弯,在毛细胞的近端边缘和支持细胞(箭头)的远端边缘之间的连接处有Vangl2的积聚。所有细胞的侧面以及毛细胞的远侧边缘和支持细胞的近侧边缘均明显缺乏Vangl2蛋白。H(H),我,IHC地区的高度重视(H(H))和OHC区域(我)P1大鼠耳蜗单焦平面。β-连环蛋白标记表明Vangl2在支持细胞和毛细胞(箭头)之间以及两个支持细胞(星号)之间的确切连接处积聚。J型,在P0时,小鼠耳蜗基底弯也存在类似的Vangl2(绿色)不对称分布。K(K)P0小鼠耳蜗的冷冻切片显示Vangl2(绿色箭头)在OHC(O1-O3)中的顶端定位,以及在IP中的更广泛定位(星号)。L(左),现场用探针杂交Vangl2号机组显示E18.5小鼠OC中HCs和SCs中mRNA(紫色)的表达。IP中较深的紫色(星号)可能是由于相对较高的Vangl2号机组在这些细胞中表达。M(M),N-钙粘蛋白(红色)特异性标记IHC膜,显示P2大鼠耳蜗IHC近侧(箭头)和远端(箭头)与Vangl2(绿色)共定位。N个,抗β1/β2-微管蛋白抗体(红色)标记所有支持细胞的腔表面,表明Vangl2(绿色)在HCs(星号)和支持细胞的交界处共定位(箭头)。比例尺:C类(用于C–F类),G公司,J型,N个(用于M(M),N个),10微米;H(H)(用于H(H),我),K(K)(用于K(K),L(左)),5微米。
尽管在理解无脊椎动物系统中PCP发展的分子和生物化学基础方面取得了重大进展,但脊椎动物系统尚未取得类似进展,主要是由于缺乏合适的PCP突变体。最近的结果发现了一组影响HC静纤毛束方向的哺乳动物PCP突变体,包括Vangl2号机组(像梵高一样)紧急停堆1(涂鸦),塞尔斯1(钙粘蛋白EGF LAG七通路G型受体)和蛋白酪氨酸激酶-7(PTK-7型) (Curtin等人,2003年;Montcouquiol等人,2003年;Lu等人,2004年). 据报道,在直径1/2(分离)双突变体(Wang等人,2005年),但这些动物的总体破坏水平似乎较轻,并且可能因Dvl的功能冗余和额外作用而变得复杂。鉴于PCP的功能Vangl2号机组和塞尔斯1似乎一直维持在脊椎动物和无脊椎动物之间,紧急停堆1和PTK-7型显然是新的脊椎动物PCP基因,在PCP中没有作用果蝇属(Montcouquiol等人,2003年;Lu等人,2004年). 综上所述,这些结果和我们的数据表明,尽管在产生PCP的分子途径方面存在整体功能保守性,但脊椎动物和无脊椎动物之间可能存在显著差异。在这项研究中,我们试图通过分析Vangl2在哺乳动物耳蜗中产生PCP期间的定位来确定脊椎动物中介导PCP的细胞相互作用。
结果
Vangl2在哺乳动物内耳不对称定位
Vangl2号机组是第一个在哺乳动物内耳中被鉴定为PCP基因的基因(Montcouquiol等人,2003年)和中的PCP缺陷Vangl2号机组突变体比目前发现的任何其他单个PCP突变体更严重(Curtin等人,2003年;Lu等人,2004年). 因此,我们提出了一种针对Vangl2假定的细胞内N-末端结构域的肽抗体。该抗体与转染了Vangl2号机组以及耳蜗和大脑提取物(B类). 哺乳动物Vangl2的氨基酸序列预测其分子量为59.7 kDa,Vangl 2蛋白在7–20%梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上以65 kDa的表观分子量迁移。当在包括COS1、MDCK和NRK(数据未显示)在内的各种细胞系中表达时,抗体还识别了GFP标记的Vangl2蛋白版本。
耳蜗内极化的最初迹象可以在上皮细胞的近端(内毛细胞)区域观察到(C–F类)大约在E18.5开始。此时点拍摄的共焦图像显示,Vangl2在感觉上皮和非感觉上皮的大多数细胞中是膜相关的(C–F类)(补充图1A类,C类,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 在大多数细胞类型的细胞质中也观察到点状染色。在感觉上皮内,Vangl2在最不成熟区域的分布分析(C类,D类)显示IPh细胞在细胞近端(箭头)和远端(箭头)边缘的不对称表达。此时点(括号),在上皮的非极化外毛细胞区域未观察到明显的蛋白质不对称积累。在同一时间点耳蜗分化程度较高的区域,Vangl2在IPh细胞中的不对称定位(电子,F类,箭头)(补充图1B类,D类,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料)更加激烈。此外,Vangl2的不对称定位现已延伸至相邻的细胞,即内外柱细胞(白色箭头)。IHCs(星号)也显示Vangl2在其近端不对称堆积。相反,Vangl2在远侧边缘(与柱细胞接触的边缘)的积聚可以忽略不计。最后,在第一排和第二排发育中的外毛细胞上也观察到Vangl2的一些不对称定位(电子,F类,黄色箭头)。正如观察到的内毛细胞一样,Vangl2在毛细胞中的积累仅限于近端边缘。
随着PCP在OC内的持续发展,Vangl2在单个毛细胞和支持细胞内的不对称定位加剧。在大鼠P1时,我们观察到Vangl2在发育中的毛细胞的近端边缘和相邻支持细胞的远端边缘之间的连接处强烈表达(G公司)(补充图1电子,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 单平面共焦分析表明,每个OHC(O1、O2、O3)接触四个或五个SC,一个或两个位于其近端边缘(取决于位置),一个位于其两侧,一个在其远端边缘(H(H),我). 然而,Vangl2仅在每个OHC的近端边界聚集。这些聚集点与极化平面直接相关,表明活动过程必须将Vangl2限制在这些结上。在P0小鼠耳蜗中观察到类似的Vangl2定位模式(J型). 在横截面上,Vangl2的积累明显局限于OHCs的管腔区域(K(K),箭头)。相反,在IPs中观察到Vangl2从管腔表面延伸至-6.5μm的基底延伸(相比之下,毛细胞的基底延伸仅为1.2μm)(K(K),星号)。此外,就地E18.5小鼠耳蜗上的杂交表明Vangl2号机组在毛细胞和支持细胞中表达(L(左)),在柱状细胞中表达水平较高(L(左),星号)。
在超出极化初级阶段的时间点,Vangl2蛋白在大多数细胞类型中的表达似乎可以忽略不计(补充图2,可在网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 然而,我们能够在柱细胞的管腔表面检测到一些Vangl2蛋白(补充图2A类,B类,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料)以及在P7耳蜗顶端的外毛细胞的近侧。对更成熟区域的分析表明,Vangl2的表达不会持续到出生后早期的感觉区域(补充图2C类,D类,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料)
Vanlg2在OC的毛细胞和支持细胞中不对称定位
Vangl2明显不对称地定位于毛细胞和支持细胞之间的边界,但由于细胞边界是通过检测肌动蛋白或β-连环蛋白来确定的,这两种蛋白都存在于毛细胞及支持细胞中,因此无法确定Vangl 2是否不对称地定位在HCs、SC、,或两者兼而有之。因此,Vangl2与细胞类型特异性标记共定位,以确定Vangl1的分布是否随细胞类型而变化。N-钙粘蛋白已被证明能染色内毛细胞的膜,但不能染色OC中任何其他细胞类型的膜(Simonneau等人,2003年). N-钙粘蛋白和Vangl2共同定位于内部毛细胞的膜,两者都位于远端(M(M),箭头)(补充图3A类)和近似值(M(M),箭头)(补充图3A类,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料). 接下来,Vangl2与β1/β2-微管蛋白共定位,该蛋白在OC的SCs中强烈表达(Hallworth等人,2000年). 染色显示Vangl2在不同SC类型的远端边缘不对称积聚,表明Vangl1在两个HCs中不对称定位(N个,星号)(补充图3B类,网址为网址:www.jneurosci.org作为补充材料)和SC(N个,箭头)。
Vangl2在毛细胞和支持细胞中不对称定位,并调节前庭系统中的PCP
除了耳蜗外,内耳还包含前庭感觉上皮,调节平衡感和加速度感。检测线性加速度的椭圆囊和球囊,以及检测头部旋转的三个壶腹嵴,也包含机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞。然而,与耳蜗相反,这些上皮中的毛细胞排列成大的感觉斑(A类). 为了证实这些上皮细胞中的PCP也受到Vangl2的调节,我们分析了一种环尾突变杂合动物(称为Vangl2号机组磅/+) (B类)和三个Vangl2号机组磅/磅E18.5处的纯合子(C类). 利用不对称定位的激毛细胞的位置确定每个静纤毛束的方向(Montcouquiol等人,2003年) (B类,C类、箭头和红色假彩色)。之所以选择胞囊,是因为与更弯曲的嵴相比,这种感觉上皮往往是扁平的,更容易研究(A类). 胞果包含两组具有相反极化平面的毛细胞。有一个反转区,称为条纹,位于上皮远端边缘约25%处(A类,白色虚线)。静纤毛束方向图,沿着一条沿着内侧轴延伸到椭圆囊中部的线(A类,红色虚线)Vangl2号机组磅/+这只动物展示了两个相反方向的毛细胞群和极性反转区(D类,黑色三角形)。相比之下Vangl2号机组磅/磅一位室友清楚地显示出束定向的显著破坏(D类,红色方块)。事实上,对通过整个椭圆囊观察到的所有取向的分析表明,束取向可能是随机分布的。为了确定Vangl2是否同样定位于前庭感觉上皮,Vangl1定位于发育中的毛细胞和支持细胞。正如预期的那样,Vangl2在发育中的毛细胞的近端边缘和支持细胞的远端边缘发现,其模式与耳蜗中观察到的模式类似(电子).
Vangl2的非对称定位丢失Vangl2号机组磅/磅突变体
环尾鼠携带点突变Vangl2号机组其在氨基酸位置646处引起丝氨酸到天冬酰胺的转变(称为Vangl2号机组磅) (Kibar等人,2001年;默多克等人,2001年). 开始检查Vangl2号机组磅突变,Vangl2在耳蜗中的定位Vangl2号机组磅/磅已确定。令人惊讶的是,在这些动物耳蜗内的任何细胞类型中均未检测到Vangl2蛋白(A类,B类). 以前的研究表明就地杂交和Northern印迹Vangl2号机组mRNA存在于Vang12磅/磅小鼠,并且突变不会影响酵母中蛋白质的稳定性(Kibar等人,2001年;默多克等人,2001年;Torban等人,2004年). 为了证实不存在Vangl2蛋白,我们使用从大脑中提取的蛋白质来比较WT和Vangl2号机组磅/磅。如所示C类,Vangl2在从Vangl2号机组磅/磅大脑。这一结果表明翻译后Vangl2号机组磅导致有效的空变异Vangl2号机组为了证实这一假设,HEK293细胞被4或2μgVangl2-GFP公司或Vangl2号机组Lp公司-GFP公司和一个空的DsRed向量。如果两种蛋白的表达水平相似,那么在两种转染中DsRed的水平应该相等,而Vang的水平磅-GFP应低于Vangl2-GFP。如所示C类(底部),DsRed的水平在这两种情况下都是相等的,而Vangl2的水平磅与Vangl2相比,似乎有所减少。
Vangl2不在万格尔磅/磅老鼠。A类,B类,E18.5 WT的OC管腔表面(A类)和Vangl2号机组磅/磅(B类)室友。细胞边界用指骨苷标记(红色),Vangl2表达为绿色。Vangl2表达在耳蜗中完全缺失Vangl2号机组磅/磅室友。C类,Top,野生型(+/+,第1行)、杂合型(Lp/+,第2行)和纯合型(Lp/Lp,第3行)的脑裂解物万格尔磅(Lp)小鼠进行免疫印迹分析。Vangl2蛋白在WT和杂合子的大脑中表达,但在纯合子的脑中不表达,这表明突变体中的蛋白降解。C类、Bottom、HEK293细胞与不同水平的GFP-Vangl2号机组(WT)或GFP-Vangl2号机组磅(Lp)和空DsRed向量。用抗GFP抗体进行的免疫印迹显示Vangl2的表达水平磅比Vangl2弱,而样品中存在相同数量的转染蛋白,如DsRed水平所示。D类,电子,Vangl2靶向转染MDCK细胞的膜,在两个转染细胞之间的连接处有较强的积聚(箭头所示)。F类,G公司相比之下,Vangl2Lp公司构建物不再以细胞膜为靶点(箭头所示),而是积聚在细胞的细胞质中。H–K型,E14.5大鼠耳蜗的Lumenal表面,用Vangl2电穿孔(H(H),我)或Vangl2磅(J型,K(K))并维持7天在体外(DIV)。Vangl2(绿色)强烈表达并靶向细胞膜磅积聚在细胞的胞浆中,表达水平较低。比例尺:B类(用于A类,B类),10微米;G公司(用于D–G型),K(K)(用于H–K型),20微米。
我们的数据表明Vangl2磅可能没有靶向或固定在膜上,因此,也可能没有降解靶向。我们在上皮性MDCK细胞中测试了这一假设。当Vangl2-GFP公司将融合构建物转染到MDCK细胞中,蛋白按预期靶向细胞膜(D类,电子),在两个转染细胞之间的连接处有大量蛋白质积累(电子,箭头)。相反,Vangl2磅-当GFP融合蛋白在同一细胞系中表达时,它不再以膜为靶点,相反,它似乎积聚在细胞的细胞质中(F类,G公司). 这些数据表明,464位的丝氨酸对膜靶向和/或锚定很重要,并且在没有这种信号的情况下,蛋白质被降解。
要确定Vangl2号机组磅突变对Vangl2在耳蜗中的定位有类似的影响,Vangl2-GFP公司和Vangl2号机组磅-GFP公司载体于E14.5转染大鼠耳蜗,该时间点与HC和SC的发生相关。正如预期的那样,Vangl2-GFP蛋白定位于HCs和SC的膜上(H(H),我). 相反,Vangl2磅-在膜上没有观察到GFP蛋白,而是留在细胞质中(J型,K(K)). 转染细胞中缺乏不对称蛋白定位Vangl2-GFP公司这可能是由CMV启动子产生的强表达和随后的蛋白质积累饱和了控制不对称性的调节机制的结果。
Scrb1与Vangl2发生物理相互作用,并需要用于Vangl1的不对称膜靶向
紧急停堆1最近被证明在耳蜗中起PCP基因的作用,并在遗传水平上与Vangl2号机组(Montcouquiol等人,2003年). Scrb1的免疫定位显示在OC内的所有细胞类型中表达(A类). 此外,该蛋白定位于HCs和SC的基底外侧膜(B类),如前所述(Navarro等人,2005年). 在MDCK细胞中,内源性Scrb1在细胞膜上强烈表达,当其过度表达时,Vangl2被靶向(Navarro等人,2005年;秦等,2005). 因此,研究了Scrb1和Vangl2之间的潜在直接相互作用。首先,使用Vangl2的一部分C末端部分(包括PDZ结合域)作为诱饵的酵母双杂交筛选,从小鼠E17胚胎文库中分离出Scrb1(数据未显示)。为了确认PDZ结合域的需求,通过细胞转染进行Vangl2和Scrb1的联合免疫沉淀。HEK293细胞与Vangl2-GFP公司和紧急停堆1,我们使用抗GFP抗体共同免疫沉淀Scrb1(C类,车道5)。Vangl2强烈减少了这种相互作用磅(C类,车道6),并在Vangl2(Vangl 2)上没有PDZ绑定域的情况下废除Δ4) (C类,车道7)。在没有Vangl2-GFP的情况下,抗-GFP抗体无法免疫沉淀Scrb1,这表明Vangl2在哺乳动物细胞中与Scrb1特异性相互作用。非免疫性IgG没有免疫沉淀Vangl2或Scrb1(数据未显示)。
Scrb1和Vangl2物理上相互作用,而Scrb1是Vangl1不对称所必需的。A类P1小鼠耳蜗的Lumenal表面标记有抗Scrb1抗体(绿色),表明该蛋白在OC中所有细胞的膜上广泛表达。B类,共焦Z-P1小鼠耳蜗的堆栈横截面标记为A类顶部表示合并的图像,中间和底部表示单独的指骨样蛋白(红色)和Scrb1(绿色)通道。Scrb1沿着IHCs和OHCs(编号)以及IP(星号)的整个基底外侧膜分布。C类,Scrb1与Vangl2的免疫沉淀。用Scrb1和GFP-Vangl2或GFP-Vangel2转染HEK293细胞磅用抗GFP抗体免疫沉淀蛋白。然后用我们的抗Scrb1抗体探测细胞膜。带的存在表明Vangl2和Vangl3磅可以与Scrb1(通道5、6)相互作用,但在Vangl2(Vangl2中)的C末端去除PDZ结合域Δ4)防止这种相互作用(车道7)。第2列中的带代表HEK293细胞中内源性表达的Scrb1。D类哺乳动物Scrb1的结构,在N末端附近有一个LRR,一个连接区,在C末端有四个PDZ结构域。在整个结构下面是GST下拉分析中使用的GST结构的图形列表电子.电子,GST下拉表明Vangl2可以与PDZ2、PDZ3或PDZ4以及来自Scrb1的PDZ结构域的其他组合相互作用,与PDZ2和PDZ3的相互作用最强。相反,Vangl2不与LRR或链接器域交互。丝氨酸S464上Vangl2的突变导致Scrb1结合的强烈减少,Vangl 2的最后四个氨基酸(VanglΔ4)完全禁止此绑定。F类,Vangl2和Scrb1在HEK293细胞中的免疫定位。HEK293细胞转染紧急停堆1(红色)和绿色荧光蛋白-Vangl2用抗GFP和抗Scrb1抗体对(绿色)构建物和蛋白质进行免疫细胞化学处理。当这两种蛋白质在细胞中共存时,它们会强烈地共定位。比例尺,10μm。
Scrb1包含一个N端LRR和四个PDZ域,它们位于C端,由链接器区域分隔(D类). 为了绘制Scrb1与Vangl2的相互作用域,对单个PDZ以及PDZ1–PDZ2和PDZ3–PDZ4组合进行了分析,以确定其独立结合GFP标记的Vangl1的能力(D类). 除了第一个PDZ域(PDZ1)之外,Scrb1的所有PDZ域,以及PDZ1–PDZ2或PDZ3–PDZ4的组合都能够绑定Vangl2(电子). PDZ2和PDZ3与Vangl2的亲和力最强。包含Scrb1的N端部分的构造(仅包括LRR、带链接器的LRR或仅GST)无法绑定到Vangl2。当我们移除Vangl2(Vangl2中)的PDZ结合域时Δ4),与Scrb1的交互丢失(电子). 最后,HEK293细胞与两种基因的表达载体共转染紧急停堆1和Vangl2号机组显示了蛋白质的共定位(F类).
Scrb1和Vangl2之间的物理相互作用表明Scrb1在靶向Vangl2。因此,研究了Vangl2在耳蜗中的不对称定位紧急停堆1循环工具(Crc)/Crc纯合子。这个紧急停堆1Crc公司突变是一种截断突变,导致最后两个PDZ结构域PDZ3和PDZ4的丢失。尽管紧急停堆1,Vangl2仍然存在于耳蜗HCs和SCs的膜上紧急停堆1Crc/Crc公司纯合子(A类,B类). 然而,Vangl2的不对称分布被严重破坏(B类). 对Vangl2在上皮管腔-基底轴特定点的分布的分析表明,位于外毛细胞第2行和第3行的HC和SC中的蛋白质不对称分布几乎完全破坏,但IPh和柱状细胞中的不对称分布保持不变(C–F类,箭头)。Vangl2不对称性的丧失,特别是在第二排和第三排OHC中,与该区域更明显的PCP缺陷密切相关紧急停堆1Crc/Crc公司耳蜗(Montcouquiol等人,2003年).
Vangl2不对称性缺失紧急停堆1Crc/Crc公司和塞尔斯1呼喊/呼喊突变体。A类,B类E18.5 WT OC的Lumenal表面(A类)和紧急停堆1Crc/Crc公司室友。与WT相比(A类),Vangl2(绿色)不对称性在耳蜗中消失紧急停堆1Crc/Crc公司突变体(B类),但蛋白质仍以膜为靶点。C–F类,与中的图像相同B类但只有绿色通道,在四个不同的焦平面上,从腔表面开始,在每帧中向组织推进0.62μm。与OHC相比,在内腔表面附近的IPh细胞和柱状细胞中可以观察到Vangl2的持续不对称定位(如箭头所示C类),但在较深的焦平面上,所有细胞中都存在几乎均匀的蛋白质分布(D–F型).G–J型E18.5 WT OC的Lumenal表面(G公司,H(H))和塞尔斯1呼喊/呼喊室友(我,J型). Vangl2单独如图所示H(H)和J型与WT相比,膜上的Vangl2(绿色)总体减少,蛋白质在OC中均匀分布塞尔斯1呼喊/呼喊动物。比例尺:A类(用于A类,B类),我(用于G–J型),10微米。
Vangl2的不对称定位需要Celsr1
塞尔斯1,核心PCP基因的脊椎动物同源物火烈鸟是哺乳动物耳蜗中PCP所必需的,并且在鸡耳蜗PCP发育过程中不对称地定位于近端和远端膜(Davies等人,2005年). Celsr1在Vangl2不对称定位中的作用是通过分析来自塞尔斯1碰撞(Crsh)/Crsh突变体。尽管Vangl2仍以HCs和SC的膜为目标塞尔斯1呼喊/呼喊突变体,不对称性几乎完全丧失,膜上Vangl2蛋白的整体水平下降(G–J),表明Celsr1是Vangl2招募和不对称定位所必需的。
Fz3以类似于Vangl2的模式不对称定位
Fz蛋白被证明是PCP信号级联的上游受体(阿德勒和李,2001年;斯特拉特,2003)、和传真3/6双突变体耳蜗有PCP缺陷(Wang等人,2006年). 因此,我们使用市售的抗Fz3抗体来确定其在耳蜗中的定位。Fz3在同一发育时间点以类似于Vangl2的模式不对称地定位于毛细胞的近端边缘(A类,B类). 此外,横截面分析表明Fz3也局限于每个毛细胞的顶端区域(C–E类). 由于这两种抗体都是在兔子体内产生的,因此由于次级抗体水平的交叉反应,不可能确认共定位,但结果强烈表明这一可能性。为了确定Vangl2的定位是否在Fz3不对称性的产生中起作用,我们检测了Fz3在耳蜗中的表达Vangl2号机组磅/磅纯合子。在这些突变体中,我们观察到Fz3在膜上的完全缺失,这表明Vangl2在Fz3靶向或维持膜中的作用(F–I型). 测试了通过Scrb1的交互,但Fz3没有与Scrb1交互(数据未显示)。基于这些结果,通过免疫沉淀法测定Vangl2和Fz3之间的潜在直接相互作用。正如预期的那样,在转染了未标记Vangl2和Fz3-GFP的HEK293细胞中,Vangl2-Fz3之间存在直接相互作用(J型). 观察到的两条谱带很可能来自Fz3的单体和二聚体形式。
Fz3通过与Vangl2的相互作用不对称地定位在OC中。A类,B类,Fz3(绿色)在P1大鼠耳蜗中不对称分布,其模式类似于Vangl2。C–E类,Z-堆栈共焦横截面标记为inA类,在P1大鼠耳蜗中。Fz3(绿色)定位于两个OHC(O2,O3)的顶端区域和IP(星号)。F–I型,与WT相比(F类,G公司),Fz3(绿色)不对称性在E18.5耳蜗中丢失Vangl2号机组磅/磅老鼠(H(H),我). 事实上,细胞膜上似乎完全没有Fz3。J型,转染的HEK293细胞(通道4)裂解液中的Vangl2免疫沉淀与Fz3。印迹显示存在两条带,对应于Fz3的单体和二聚体形式。比例尺:B类(用于A类,B类),H(H)(用于F–I型),10微米。
讨论
Vangl2在哺乳动物耳蜗内HC的极化中起着关键作用。这里的结果表明,Vangl2在细胞-细胞边界的不对称定位提供了重要的指导性相互作用,指导上皮内单个细胞的整体极化。总的来说,我们的数据表明PCP信号级联的某些方面保持不变,但结果也表明脊椎动物和无脊椎动物之间的PCP信号串联存在重大差异。特别是,尽管这里给出的结果表明Fz3是不对称局域的,如果蝇属在耳蜗中,Fz3和Vangl2相互作用并局限于细胞的同一区域。这些结果与果蝇属vang/斜视(stbm)和fz特地位于单个细胞的对侧的翅膀(阿德勒,2002;斯特拉特,2002年).
哺乳动物耳蜗中PCP需要Vangl2的不对称定位
在果蝇属在最初对称的顶端定位后,特定的PCP蛋白沿着翅膀的近轴或眼睛的背腹轴在各自的边界上不对称富集(Uemura和Shimada,2003年;范托和麦克尼尔,2004年). 特别是,vang/stbm局限于发育中的翼细胞的近端(). 虽然已经提出了几个模型来解释这种不对称的重要性,但具体的细胞效应仍不清楚(Klein和Mlodzik,2005年). Vangl2在发育毛细胞中的定位与果蝇属翅膀,在每个细胞的近端边界具有有限的积累。此外,这种不对称性的发生时间早于细胞极化的最初迹象,即发育中的激肽细胞从每个发育中的毛细胞的管腔表面中心向外围边缘离心迁移(Montcouquiol等人,2003年). 这种迁移的方向是非随机的,由Vangl2根据HC位置部分或全部进行调节。根据这些结果,这一过程中的一个关键步骤似乎是将Vangl2限制在每个毛细胞的近端,这表明这种限制直接或间接地为随后的离心迁移建立了方向向量。
Vangl2/vang、Fz3/fz和Scribble1在飞翼、眼睛和哺乳动物耳蜗中的不对称定位。A类,B类,本地化法兹和万格在中果蝇属翅膀和眼睛。A类,在野生型翅膀中,每一个细胞顶端表面的远端顶点会形成毛发并指向远端。据信,富含肌动蛋白的头发是在以下部位积累和激活的法兹(绿色)在远端。万格(橙色)将定位在相对侧(近端)。如果没有法兹或万格另一种蛋白质的不对称性消失,毛发将在细胞中心形成,指向错误的方向。B类在一只野生型眼睛中,八个被称为ommatidia的光感受器(R1–R8)簇在根据赤道旋转之前发生极化。在这里法兹在R3侧和的万格在相反的R4侧需要适当的旋转,因此PCP。C类Corti的P0哺乳动物器官的Lumenal视图。每个毛细胞上的静纤毛束(红色)位于远侧边缘。我们的数据显示,Vangl2和Fz3定位于IHC和OHC(O1-O3)的静睫状束形成位置(近侧)的对面。Vangl2和Fz3的积累对应于支持细胞和毛细胞之间的接触区,对于外部毛细胞来说尤其强烈。我们的数据表明,事实上,Vangl2和Fz3位于这两种细胞的膜上。IPh细胞以及IPs和Ops似乎在近端和远端都表达Vangl2和Fz3,而Deiters细胞(D1–D3)似乎只有远端表达。Scrb1在每种细胞类型中表达。
这一假设得到了以下观察结果的有力支持,即在这两种情况下,Vangl2不对称性都会消失塞尔斯1呼啸/呼啸和紧急停堆1Crc/Crc公司突变体。特别是,在紧急停堆1Crc/Crc公司突变体,Vangl2的不对称性在位于第2行和第3行的OHC中消失,而Vangl 2的不对称分布在IHC行和第一行OHC的支持细胞中保持。OHC第2行和第3行中Vangl2不对称性的丧失与紧急停堆1Crc/Crc公司,也限于OHC第2行和第3行(Montcouquiol等人,2003年). 同样,Vangl2不对称性在塞尔斯1呼喊/呼喊这与PCP的更大程度中断相关(Curtin等人,2003年). 最后,比较Vangl2不对称缺失突变中PCP缺陷的严重程度(紧急停堆1Crc/Crc公司或塞尔斯1呼喊/呼喊)与Vangl2蛋白完全缺失的突变相比(Vangl公司磅/磅)表明膜定位的Vangl2保留了一些产生极化信号的能力,即使在没有不对称定位的情况下,因为PCP的整体破坏在Vangl2号机组磅/磅突变体。
不对称定位需要Vangl2和Scrb1之间的相互作用
这里的结果也证明了Scrb1在蛋白质不对称生成中的新作用。对不同缺失结构的分析表明,Scrb1的最后三个PDZ域直接与Vangl2的C末端PDZ结合域相互作用,这种相互作用是Vangl2中不对称定位所必需的。有趣的是,在紧急停堆1Crc/Crc公司突变体,尽管PDZ3和PDZ4丢失。然而,由于PDZ2也与Vangl2相互作用,因此可能紧急停堆1Crc公司仍然保留一些功能。
果蝇属在顶端-基底极性形成期间,scrb限制了蛋白质在顶端细胞室的定位,但这里的结果表明哺乳动物Scrb1也可以将蛋白质靶向或维持在膜的特定区域。平面极性和顶底极性可能是伴随的过程,共享分子和分子级联。最近的一篇论文表明果蝇属PALS-1相关紧密连接蛋白,一种来自顶端边缘区连接的蛋白,以及fz1果蝇属眼睛,表明顶端-基底极性和平面极性所必需的分子可以相互作用(Djiane等人,2005年). 另一篇最近的论文分析了三叶虫(tri)/stbm(Vangl2的斑马鱼等位基因)和scrb1的相互作用(Wada等人,2005年). 作者认为,这两种蛋白质可以形成一种功能复合物,其中可能需要tri/stbm将scrb1定位到它们锚定和发挥作用的膜的特定位点。在我们的研究中,Vangl2不对称性的破坏紧急停堆1crc/crc突变体表明,Scrb1可能是靶向或维持Vangl2到细胞膜特定区域所必需的。Scrb1的C末端尾部存在四个PDZ结构域,这强烈表明存在一个大分子复合物,涉及一个或多个额外的蛋白质。这些蛋白可以与Scrb1协同作用,控制Vangl2的不对称定位。在未来,识别这些分子及其潜在作用将非常重要。
Fz3非对称定位,与Vangl2相互作用
此处显示的结果以及Wang等人(2006),确定Fz3和Fz6是哺乳动物耳蜗中PCP的关键调节因子。如前所述,Fz3和Fz6与果蝇属fz,调节PCP的fz,以及删除Fz3公司和Fz6公司导致内耳PCP缺陷(Wang等人,2006年). 然而,Fz3在发育中的毛细胞近端边缘的位置以及这种不对称性对Vangl2的依赖性与果蝇属此外,Vangl2和Fz3之间的物理相互作用的证明表明,在没有Vangl 2的情况下,Fz3不对称性的丧失是这种物理相互作用中断的结果,而不是细胞极化全面中断的次要影响。先前的一篇论文表明,MAGI-3(膜相关鸟嘌呤环化酶,具有反向定位-3)可以作为Fz4和Vangl2的支架蛋白,调节c-Jun N末端蛋白激酶级联。然而,尽管作者确定了MAGI-3与Fz4或Fz7之间的直接相互作用,但MAGI-3和Fz3或Fz6之间以及Fz4和Vangl2之间没有相互作用(Yao等人,2004年).
Fz3(可能还有Fz6)与Vangl2共定位并直接相互作用的观察表明,脊椎动物和无脊椎动物之间调节PCP的分子机制发生了根本性变化。此外,这一观察结果与最近的证据不一致,即Dvl2定位于发育中毛细胞的远端膜(Wang等人,2005年),除非毛细胞远端存在其他Fz受体。然而,Dvl2结果是使用转基因动物获得的,而不是内源性蛋白的定位,因此可能需要进一步研究。
总之,本文的结果证明了Vangl2蛋白不对称定位在哺乳动物耳蜗内PCP生成中的关键作用。我们还发现了Fz3、Vangl2和Scrb1之间的新相互作用以及蛋白质复合物的存在。将这些复合物靶向发育中的耳朵内的特定边界可能会产生一个方向向量,该向量将指示结构内每个细胞的后续极化。这些数据表明,尽管PCP信号的许多方面都与无脊椎动物保持一致,但就极化信号的实际产生方式以及该信号如何协调哺乳动物特定细胞的实际极化而言,在细胞水平上发生了重大变化。