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神经科学杂志。2007年1月31日；27(5): 1097–1105.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.3590-06.2007
预防性维修识别码：PMC6673203型
PMID：17267564

内源性脑源性神经营养因子在树突发育突触处触发快速钙瞬变

苏珊·朗格, 瓦伦汀·斯坦因, 托比亚斯·邦霍费尔,和克里斯蒂安·洛曼通讯作者
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）参与功能性神经元网络形成的许多方面。BDNF信号不仅在整个神经元或网络水平上，而且在亚细胞水平上以高度的时间特异性，在全球范围内调节神经元的发育；然而，内在BDNF信号的时空特性基本上是未知的。在这里，我们使用钙成像直接观察发育中海马神经元的内源性BDNF信号。我们发现，用功能阻断型BDNF抗体（αBDNF）或K252-a阻断内源性BDNF信号，可以降低树突中自发快速和局部钙升高的频率。相反，局部应用BDNF可诱发快速和局部的树突状钙瞬变，这需要激活TrkB（原肌球蛋白相关激酶B）受体以及电压门控钠和钙通道。病毒介导的PSD-95:CFP（用青色荧光蛋白标记的突触后密度-95）表达表明，自发的局部钙瞬变经常发生在树突的突触后点。通过阻断内源性BDNF信号传导，突触定位钙瞬变的频率降低，而非突触性钙升高不受影响。此外，局灶性BDNF传递特别在突触后部位诱发局部快速钙升高。总之，我们的结果表明，在发育中的海马神经元中，BDNF依赖性钙信号传导速度很快，并且发生在突触上。BDNF信号的这些时间和空间特征及其相对丰度使得BDNF成为建立特定突触连接和功能性神经元网络的理想信号分子。

关键词：钙信号、发育、BDNF、TrkB、突触后位点、海马

引言

在中枢神经系统中，神经营养素因其支持神经元存活和控制发育过程中分化的能力而广为人知(Bibel and Barde，2000年;Huang和Reichardt，2001年). 除了这些经典的长期影响外，最近的证据还揭示了神经营养素对神经元可塑性的急性影响。特别是，脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体原肌球蛋白相关激酶B（TrkB）通过以活性依赖的方式控制树突和轴突分支，影响皮层回路中的神经元形态(McAllister等人，1995年;Gorski等人，2003年)（参见，McAllister等人，1999年). 此外，BDNF信号可以调节突触强度：它对突触传递产生急性影响(Lohof等人，1993年;Kang和Schuman，1995年;Levine等人，1995年,1998)（有关审查，请参阅Poo，2001年)参与海马长时程增强（LTP）的诱导和维持(Korte等人，1995年,1996;Patterson等人，1996年;Kossel等人，2001年;Kovalchuk等人，2002年)以及稳定突触(胡等，2005).

BDNF不仅在细胞水平上而且在亚细胞水平上影响突触可塑性。例如，相同锥体细胞的顶树突和基底树突对相同的神经营养素的反应不同(McAllister等人，1995年). 此外，已有研究表明，单个细胞释放BDNF可以在相对较短的时间内以距离依赖的方式直接诱导附近神经元的局部树突状生长和分支(Horch和Katz，2002年). 此外，有报道称局部应用BDNF和同时进行突触前激活可在成熟齿状颗粒细胞中介导LTP(Kovalchuk等人，2002年). 已知BDNF的表达和分泌受神经元活动的调节(Balkowiec和Katz，2002年;Gartner和Staiger，2002年)BDNF释放发生在突触，可能发生在突触前或突触后小室或两者(Hartmann等人，2001年;Kohara等人，2001年;Gartner等人，2006年)（有关审查，请参阅Lessmann等人，2003年). 这些发现表明BDNF信号在空间和时间上受到精确调控。

钙作为一种重要的第二信使作用于BDNF下游，并被认为以特定、快速和局部的方式调节其某些效应。例如，已有研究表明，细胞内钙信号传递BDNF在海马突触的增强作用(Kang和Schuman，2000年;Kovalchuk等人，2002年). 此外，已知外源性BDNF的应用会引起细胞内钙浓度的短暂升高，这主要是由于内部储存物中的钙释放所致(Berninger等人，1993年)而且还依赖于细胞外间隙的钙内流(马什和帕尔弗雷，1996年).

尽管对细胞对外源性BDNF的反应有大量的了解，但尚未研究内源性BDNF信号传导如何影响神经元钙反应。因此，我们开始直接观察在海马薄片培养的锥体神经元发育过程中BDNF诱导的内在钙信号。我们询问BDNF是否触发了自发的局部钙事件，并研究了BDNF介导的钙信号机制。我们发现，内源性BDNF信号诱导树突中快速且空间受限的钙升高。BDNF依赖的局部钙瞬变需要激活TrkB受体以及电压敏感性钠和钙通道。此外，我们观察到大多数依赖BDNF的自发局部钙瞬变发生在树突的突触后部位。因此，局灶性脑源性神经营养因子的传递特别在单个突触后位点诱发局部钙升高。总之，我们的数据表明，BDNF在发育中的神经元中触发快速和局部的钙瞬变，这种瞬变优先发生在突触处。

材料和方法

海马切片培养物的制备。

按照Stoppini等人（1991年）的方法制备出生后第0天（P0）到P2天的海马器官型培养物。斩首后，在冰镇Gey’s平衡盐溶液中解剖海马，该溶液含有0.5 ml氰尿酸和0.5 ml葡萄糖，pH值7.2。使用组织切碎器（McIlwain）切下横切片（400μm）。将切片置于Millicell膜插入物（CM；Millipore，Billerica，MA）上，并在37°C、7%CO下与含有25%马血清的DMEM培养基孵育2最多持续3天。

病毒介导的基因转移。

用病毒感染法表达用青色荧光蛋白标记的突触后密度-95（PSD-95:CFP）。PSD-95:CFP公司(Graf等人，2004年)克隆到pSCA载体中(DiCiommo和Bremner，1998年). Semliki森林病毒颗粒是通过以1:2的比例将pSCA–PSD-95:CFP和pHelper转染到人类胚胎肾HEK 293细胞中而产生的。在转染后48小时，收集上清液，进行鉴定，并将其储存在−80°C下。α-糜蛋白酶处理45分钟后激活病毒，并将其注射到CA3区。

CA3锥体细胞的单细胞电穿孔和CA3区域的团注负荷。

记录室的温度控制在35°C，并灌注HBSS，HBSS由以下成分组成（单位：m米)：14.61氯化钙2，4.93氯化镁2，4.07硫酸镁453.33千卡，4.41千赫2人事军官4，4.2氯化钠三，1379.31氯化钠，3.36钠2高性能操作4和55.56d日-葡萄糖。高亲和力钙指示剂俄勒冈州绿BAPTA-1（250μ米，溶于蒸馏水、六钾盐中；Invitrogen，Carlsbad，CA）根据染料电穿孔方法电穿孔成单个神经元(Haas等人，2001年;Rathenberg等人，2003年; Lang等人，2006年）。使用尖端直径为～1μm的贴片吸管和方形电压脉冲（10 V，20 ms持续时间）填充单个神经元。对于弹丸加载(Stosiek等人，2003年)将50μg（一小瓶）Oregon Green 488 BAPTA-1 AM（Invitrogen）溶解在5μl含有10%普鲁尼酸的二甲基亚砜中。超声处理1分钟后，添加50μl培养基，并再次对溶液进行超声处理。用染料溶液填充贴片移液管的尖端，通过将移液管尖端定位在辐射层/腔隙分子层中，并使用Picospritzer（新泽西州费尔菲尔德市通用阀门）施加短压力脉冲，加载培养插入物上海马脑片的CA3区。培养1小时后，将切片用于实验。

成像。

记录是使用Axioplan-2显微镜（德国Oberkochen蔡司）和由MetaMorph软件（宾夕法尼亚州西切斯特Universal Imaging Corporation）控制的冷却CCD相机（VisiCam QE；德国普赫姆Visitron Systems）采集的。由H.Thoenen（德国马丁斯里德-慕尼黑马克斯普朗克神经生物学研究所）提供的蔡司0.95/63×或奥林巴斯光学（日本东京）0.80/40×浸水物镜以0.3–10 Hz的频率获得图像。

BDNF和药物的应用。

使用100μl移液管（最终浓度为200 ng/ml）施用BDNF（PBS中26μl，15μg/ml，含0.1%BSA，以防止与储存和应用器皿结合；由H.Thoenen提供）。在BDNF浴应用期间中断了超融合；对照实验表明，在记录期内，仅中断灌流不会影响钙活性（数据未显示）。或者，BDNF通过微移液管使用Picospritzer（脉冲持续时间为40 ms）通过压力脉冲聚焦于顶端树突。将BDNF应用移液管（尖端直径为～1μm）放置在距枝晶约10～20μm的位置，并在1 min内施加三次脉冲。在对照实验中，对枝晶施加压力，对含有0.1%BSA的PBS或热失活BDNF（95°C下30 min）。

蛋白激酶拮抗剂K-252a（200 n米; Alexis Biochemicals，San Diego，CA）和抗BDNF的功能阻断小鼠单克隆抗体（αBDNF）在浴中使用（4μg/ml，克隆号9，IgG）(Kolbeck等人，1999年;Kossel等人，2001年). 对于α-BDNF实验，将试管硅化1小时，干燥，并进行广泛清洗，以防止抗体粘附到试管表面。此外，将BSA（0.5 mg/ml）添加到抗体溶液中。所有其他药物均在HBSS中稀释，并在浴中使用：1μ米河豚毒素（TTX），5μ米氯化镉（CdCl2), 20 μ米环己酸（CPA）和3μ米SKF 96365盐酸盐[1–2-（4-甲氧基苯基）-2-[3-（4-甲氧基苯基）丙氧基]乙基-1H（H）-咪唑]。20 n时破伤风毒素（TeTX）米在记录之前至少12小时添加到培养基中。

图像分析。

[Ca的变化2+]我由Δ导出F类/F类0，其中F类0是基线荧光，通常是从记录的前20张图像中获取的。整体钙瞬变被定义为在同一焦平面内观察到的细胞所有结构的荧光增加至少10%。局部发生的钙瞬变被定义为荧光局部上升>5%，沿枝晶的空间范围为1–30μm。为了分析BDNF应用实验，放弃了由压力脉冲应用引起的枝晶位移引起的变化。统计分析采用Wilcoxon配对检验。

蛋白质印迹。

P3大鼠海马组织在梯度缓冲液（含0.32米蔗糖和1米米氯化镁2pH7.4），2×样品缓冲液（0.125米Tris pH 6.8、2%十二烷基硫酸钠、20%甘油和0.001%溴酚蓝）、滴滴涕和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，Deisenhofen，德国）。HEK 293细胞作为对照。然后将裂解物的等分试样进行SDS-PAGE（6%丙烯酰胺）并转移到硝化纤维素膜（转移膜；Millipore）上。在4°C的10×Tris缓冲盐水中，在0.05%吐温20和0.5%明胶的封闭缓冲液中培养印迹过夜。封闭后，将硝化纤维素膜与兔抗TrkB抗体（1:50；加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）或兔抗肌动蛋白（1:100；Sigma）在室温下孵育1小时。与二级抗体孵育（1小时，室温，1:10000，过氧化物酶标记的抗兔抗体）后，使用ECL检测试剂盒（德国布伦瑞克Amersham Biosciences）检测抗体的结合。

免疫组织化学。

在病毒感染PSD-95:CFP后，将切片在4°C的多聚甲醛中过夜（4%在0.1磷酸钠缓冲液中）。在磷酸盐缓冲液（PB）中清洗3小时后，将切片预先培养在封闭溶液中（4%Triton X-100、1.5%马血清和0.1%BSA，PB，4°C，过夜），然后在一级抗体中培养[兔抗突触素（Chemicon，Temecula，CA），在4%Triton X-100、1.5%BSA和0.1%PB]中稀释1:500，培养7–10天。冲洗切片（PB中3小时），然后用二级抗体（抗兔FITC，PB中1:50，4℃）孵育2–3天。高分辨率图像的堆叠（体素大小，x–y–z，0.18×0.18×0.25μm）：用共焦显微镜获得CFP感染的树突和抗突触素标记的结构[Leica（Nussloch，Germany）SP2，顺序采集模式，1.25/40×油浸物镜]。使用NIH ImageJ软件对共定位进行量化。当PSD-95:CFP点（“红色”通道）和突触点（“绿色”通道）像素在高倍镜下重叠时，点滴被认为是共定位的x–y和正交(y–z)视图（“黄色”像素）。使用旋转180°的突触堆栈的相反顺序测试共定位的特异性。

结果

内源性BDNF诱导自发局部钙瞬变

在我们的研究中，我们关注出生后第一周树突和轴突进行动态结构重塑并形成新突触体内在器官型切片培养中(Dailey和Smith，1996年;Fiala等人，1998年). 我们观察到[Ca的自发局部升高2+]我用单细胞电穿孔标记的CA3锥体神经元(图1 一个). 这些局部钙瞬变发生的平均频率为73.8±10.8/min和毫米树枝晶。这种钙升高的平均持续时间为680±120 ms，且仅限于枝晶9.0±0.6μm的小范围拉伸。瞬态振幅（测量为ΔF类/F类0)为17.3±0.6%，上升时间为0至4帧100ms（两帧中值）。除了局部钙瞬变外，海马神经元还产生发生在体细胞、树突和轴突中的整体钙瞬变，可能代表网络活动(Garaschuk等人，1998年).

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BDNF抗体或K252-a应用可降低发育中海马神经元树突自发发生局部钙瞬变的频率。一个，电泳的单个CA3锥体神经元（P2+3 d在体外)填满俄勒冈州绿色BAPTA-1。树枝晶扩大部分显示[Ca自发局部增加2+]我，表示为ΔF类/F类0以伪彩色显示。箭头表示用于伪线扫描和跟踪的测量树突段的范围。B类、发育中大鼠海马裂解物中TrkB受体和肌动蛋白的Western blot分析（P2）。海马（HC）中存在全长TrkB和截短TrkB（分子量分别为145和95 kDa），但对照组（HEK 293细胞裂解物）中没有。Actin充当加载控制。C类K252-a浴前、浴中和浴后自发局部钙瞬变频率归一化为基线频率。施用K252-a期间，钙活性显著降低。n个=11个神经元；误差条表示SEM(*第页< 0.05).D类类似地，浴敷αBDNF会导致自发局部钙瞬变的频率显著且可逆地降低。n个=11个神经元(*第页< 0.05).E类，BDNF抗体应用期间，自发整体钙瞬变的频率不变。

我们通过干扰BDNF–TrkB信号通路来研究内源性BDNF在自发局部钙信号传导中的作用。在通过Western blot分析确认发育中的海马体中存在BDNF的主要受体TrkB后(图1 B类)，我们使用K252-a阻断Trk受体（包括TrkB）的酪氨酸磷酸化，或使用功能阻断BDNF抗体灭活内源性BDNF。在200 n浴中米K252-a，我们观察到自发局部钙瞬变的频率显著且可逆地降低（-26.2±9.4%；n个= 11;第页< 0.05) (图1C类). 局部钙瞬变的时空特征没有改变。全球钙瞬变的频率保持稳定。类似地，浴敷BDNF抗体（4μg/ml）显著降低了自发发生局部钙瞬变的频率（−33.8±7.4%；n个= 11;第页< 0.05) (图1 D类). 相反，全局信号的频率没有显著变化（−5.4±28.5%）(图1 E类). 这些结果表明，干扰BDNF–TrkB信号通路可降低自发局部钙信号的频率，表明内源性BDNF通过TrkB受体激活产生细胞内钙信号。

外源性BDNF强烈增加钙瞬变的频率

在抑制BDNF–TrkB信号通路的过程中观察到局部钙瞬变频率降低，这让我们怀疑额外的外源性BDNF是否会增强钙活性。因此，我们将外源性BDNF（最终浓度，200 ng/ml）应用于记录室的浴液中，观察到整体钙瞬变的频率出现了强烈且可逆的增加（+239.4±88.9%；n个= 8;第页< 0.05) (图2 一个,B类). 与全球钙升高相比，外源性BDNF应用期间局部钙瞬变的频率没有显著增加（+41.9±19.9%；n个= 12) (图2C类).

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BDNF浴应用导致整体钙瞬变的频率大幅增加。一个，自发[Ca2+]我用箭头标记的枝晶段的变化在伪线扫描中显示为ΔF类/F类0。在BDNF浴应用之前和期间（在3个不同的时间点）以及清洗之后显示线扫描。B类，自发发生的全球钙瞬变的频率显著(*第页<0.05）在施用BDNF的浴中增加(n个=8个神经元，归一化到基线频率的值）。C类，在BDNF浴应用期间，自发局部钙瞬变的频率没有显著增加(n个=12个神经元）。D类，对照切片中CA3神经元的Bolus负荷显示[Ca2+]我在BDNF浴期间，相关网络活动延迟增加（痕迹对应于左图中包围的神经元）。E类，在TeTX中孵育12小时的切片中的神经元也显示[Ca立即增加2+]我BDNF槽应用，但在其他方面保持沉默。F类，在BDNF浴应用前后对照组和TeTX培养切片中的整体钙瞬变频率（8个切片中的80个神经元；对照切片：前，0.8±0.3；后，4.9±0.8总体钙瞬变/分钟；TeTX培育切片：前0.07±0.02；后，0.17±0.06总体钙瞬变分钟*第页< 0.05).G公司，对照切片和TeTX培养切片（8个切片中的80个神经元）对快速BDNF浴的平均急性钙反应。

全球活动的增加可能是细胞对BDNF的直接反应。或者，BDNF可能调节海马回路的网络活动，导致整体钙活性增加(Sakai等人，1997年). 为了测试整体钙瞬变频率的强烈增加是直接影响还是由网络活动增强引起的，我们使用了团注负荷(Stosiek等人，2003年)俄勒冈州绿色BAPTA-1 AM，以可视化CA3锥体神经元的网络活动。快速应用BDNF后，我们观察到许多神经元的钙瞬变频率持续增加（之前为0.8±0.3；之后为4.9±0.8全局瞬变/min；第页<0.05；n个=8片；80个单元格）(图2D类,F类). 神经元间的钙瞬变高度相关，表明它们反映了网络活动的增加。计算全组细胞的反应平均值表明，BDNF应用也有即时但短暂的钙反应(图2G公司). 当在TeTX中预先孵育（12小时）的切片中重复实验以阻断网络活性时，BDNF仅引发即时钙反应(图2 E类,G公司)，证明我们在应用BDNF后在控制切片中观察到的频率增加是BDNF诱导的网络活动调制的结果。快速使用对照溶液（PBS）既不会导致钙浓度急剧升高，也不会增加钙瞬变的频率（数据未显示）。总之，这些观察结果表明外源性BDNF对CA3神经元有两种影响：它（1）直接触发[Ca2+]我（2）可能通过调节突触功能，导致网络活动增加(沈等，2006;Tyler等人，2006年;Walz等人，2006年).

局部BDNF应用触发快速和局部钙瞬变

为了进一步表征BDNF直接诱发的钙瞬变，我们通过微吸管使用Picospritzer集中应用BDNF来测试其对神经元树突的特异性作用。我们将装有BDNF的移液管放置在距离树突10-20μm的地方(图3一个)并将单个BDNF脉冲（40 ms，200 ng/ml）施加到表现出自发钙活性的神经元树突。在～60%的神经元中，单个BDNF脉冲引起树突状钙升高(图3一个). 我们以10 Hz频率记录了两次，每次持续1分钟，每次采集间隔为3分钟。在这两次记录中，我们对树枝晶施加了总共六个BDNF脉冲。对每个细胞的六个BDNF脉冲的钙反应进行平均，如图3B类。我们可以反复诱发快速（上升时间<100ms）和空间受限的钙瞬变。只有对六种BDNF脉冲中的至少两种有反应的细胞钙升高，并且平均反应>5%ΔF类/F类0进行了分析(n个= 48). 我们进行了对照实验，以验证观察到的钙反应对BDNF应用是特定的：PBS和0.1%BSA都不是单独的(n个=5）或热失活BDNF(n个=10）引发枝晶中的钙瞬变(图3B类，右轨迹）。此外，局部PBS加0.1%BSA的应用并没有引起那些树突中的钙瞬变，这些树突在应用PBS前后对BDNF脉冲作出反应(n个= 3; 数据未显示）。

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树突状钙瞬变可由局灶性BDNF应用引起，依赖于TrkB受体以及电压门控钠和钙通道的激活。一个，一个带有BDNF应用移液管的电穿孔CA3神经元，位于树突（右上角）约20μm处，对单个40 ms BDNF脉冲作出响应，[Ca]局部强烈增加2+]我.B类，左迹线显示了在所示树突状区域施加六个BDNF脉冲后的平均钙反应一个右轨迹显示了另一个神经元对控制溶液（热失活BDNF）的六个脉冲的平均响应。C类，BDNF诱发钙瞬变的药理学：BDNF引起钙瞬变幅度显示为基线百分比。K252-a、TTX和CdCl的镀液应用2显著降低局部应用BDNF引起的钙瞬变振幅(*第页< 0.05). 相反，在CPA、SKF 96365盐酸盐或TeTX培养切片的浴敷过程中，未观察到BDNF诱导的钙瞬变振幅降低。

接下来，我们通过对外源性BDNF引起的钙瞬变进行药理学表征，确定了快速BDNF–TrkB介导的钙信号转导的机制。我们在服药前、服药期间和服药后的1s内测量了BDNF脉冲后钙反应的最大振幅。K252-a（200牛顿米)以及TTX（1μ米)和CdCl2(5 μ米)分别阻断TrkB受体、电压门控钠通道和钙通道，显著降低BDNF脉冲后钙反应的最大振幅(图3C类). 相反，CPA（20μ米)，一种干扰内部存储中钙释放的药剂，也不是SKF 96365盐酸盐（3μ米)，一种非特异性钙进入和瞬时受体电位通道抑制剂(Merritt等人，1990年;Li等人，1999年)，也不是TeTX（20 n米)阻断突触前递质释放，降低了BDNF脉冲后钙反应的振幅。总之，这些药理实验表明，激活TrkB受体和电压门控钠以及钙通道是BDNF诱发钙瞬变所必需的。

BDNF介导的局部钙瞬变发生在突触部位

观察到自发的BDNF依赖性钙瞬变沿枝晶高度定位(图1)导致我们问这些瞬变是否发生在特定的部位，可能是突触。使用病毒感染（Semliki森林病毒）(Ehrengruber等人，1999年)，我们表达了突触后标志物PSD-95:CFP(Graf等人，2004年)海马神经元。PSD-95:CFP标记在胞体中明显，在树突上呈点状。我们通过免疫组织化学染色确定了树突状PSD-95突触前对应物：CFP点。三维高分辨率共焦重建使我们能够通过共定位分析可视化突触结构。在122个假定PDS-95:CFP点状突触中，74%被至少一个阳性突触点状突起所反对，而26%没有显示出明显的共定位(图4 一个). 使用旋转180°的突触堆栈的相反顺序测试共定位的特异性。此处，与突触前突触点共定位的PSD-95簇明显较少（16%共定位，84%非共定位；n个=8个神经元；第页< 0.05). 这表明大多数PSD-95:CFP点确实是突触后位点。

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BDNF介导的局部钙瞬变优先发生在突触部位。一个用抗突触素抗体免疫标记和高分辨率共焦重建（左，红色神经元的最大强度投影，绿色突触素染色的单平面）后，通过病毒介导的基因转移，表达PSD-95:CFP的神经元（以红色显示）。箭头表示PSD-95:CFP和synapsin重叠的突触。高度认可(x–y)和正交(y–z)标记突触的视图（两个视图中的黄色像素）。B类，PSD-95：表达CFP（蓝色）的海马神经元与钙指示剂俄勒冈州绿BAPTA-1（OGB）（绿色）电穿孔。枝晶扩大部分显示PSD-95:CFP点状；点状结构还显示在沿枝晶的CFP/俄勒冈州绿色BAPTA-1像素强度比值图中。树突扩大部分的线扫描显示，在PSD-95:CFP的四个位点自发发生局部钙瞬变（右）。C类，自发局部钙瞬变相对于假定突触部位的分布（来自8个神经元的99个局部钙信号）。大多数瞬变发生在最近的突触处或非常近的突触（平均突触间距17.3±1.9μm与出生后第一周在CA1神经元中观察到的数字一致）(Steward和Falk，1991年).D类，在使用BDNF抗体之前、期间和之后，突触（间隔<2μm）和非突触部位（距离最近的突触>2μm的位置）发生自发局部钙瞬变的频率。在浴浴中应用BDNF抗体期间，突触部位（而非非突触部位）局部钙瞬变的频率显著降低(n个=8个神经元；基线百分比*第页< 0.05).

将钙指示剂电穿孔至PSD-95:CFP表达细胞后，我们能够同时观察到树突和自发钙瞬变的突触后位点。这些转染神经元的细胞形态和自发发生的整体和局部钙瞬变的频率与未感染神经元相似。我们经常在PSD-95:CFP表达部位沿树突观察到自发的局部钙瞬变(图4 B类). 我们沿着树突确定了假定突触和局部钙瞬变的位置，并计算了最近假定突触位点的中心与每个钙瞬变中心之间的距离。几乎一半的局部钙升高发生在假定突触2μm的距离内（8个神经元中99个神经元中的41个）(图4C类)，这与之前的观察结果一致(Lohmann等人，2005年). 可见PSD-95:CFP位点之间的平均距离为17.3±1.9μm，这与从海马CA1组织的电子显微镜研究中可以推断出的数字非常一致(Steward和Falk，1991年). 为了测试BDNF是否在PSD-95位点特异性触发局部钙瞬变，我们再次使用抗BDNF的功能阻断抗体来干扰BDNF–TrkB信号通路。我们观察到，在应用BDNF抗体浴期间，在距假定突触部位<2μm的距离内发生局部钙瞬变的频率显著且可逆地降低到65.9±16.8%(n个= 51) (图4 D类，黑色条）。在基线记录期间表现出钙活性的突触（51个突触中的21个），钙瞬变在大多数情况下被完全阻断（17个），或在αBDNF应用期间被减少（两个）或保持稳定（二个）。我们计算出，内源性BDNF信号在兴奋性突触和突触发生的平均速率为每分钟0.22个瞬变。与突触处钙瞬变频率降低相比，在BDNF抗体应用期间，我们没有发现距离最近突触>2μm处发生的局部瞬变频率发生变化(图4 D类，灰色条）。此外，与基线条件（1.94±0.82全局瞬变/分钟；数据未显示）相比，BDNF抗体应用期间的全局钙升高频率（1.44±0.51全局瞬变/min）没有显著变化。与上述实验一起，这一发现表明内源性BDNF直接触发局部钙瞬变，但不触发整体钙升高，并且这些BDNF–TrkB依赖性局部钙瞬变特异性地发生在突触部位。

局灶性BDNF传递在突触部位诱发的局部钙瞬变

局部应用BDNF证明了BDNF诱发钙反应的树突状机制(图3C类). 此外，我们还发现，自发的局部钙瞬变发生在沿枝晶的PSD-95:CFP位点。因此，我们测试了树突是否只在突触后部位对外源性BDNF产生反应。这些实验使用了具有自发钙活性的神经元。将BDNF填充玻璃移液管的尖端放置在距枝晶PSD-95位置10–20μm处(图5一个，中间）。一个单一的BDNF脉冲在PSD-95:CFP位点准确地诱发了一个强的局部钙瞬变(图5一个，右侧）。相应的线扫描表明，BDNF介导的钙升高正好从树突上的两个PSD-95点开始，并在那里达到荧光变化的最大值(图5一个，底部）。BDNF脉冲的另一个例子，紧接着突触部位的局部钙升高，如所示图5B类在这里，BDNF在PSD-95:CFP点状细胞（蓝色区域）比相邻的非突触树突处诱发更大的信号(图5C类，灰色区域）。平均而言，Δ的振幅F类/F类0BDNF脉冲后的信号在PSD-95:CFP点显著高于相邻的非突触树突状位点(图5D类). 这些发现表明，BDNF的局部、脉冲状递送引起局限于突触部位的局部钙升高。

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BDNF诱发的局部钙瞬变可以在突触部位被诱导。一个，PSD-95：表达CFP的锥体神经元，与俄勒冈州绿BAPTA-1（OGB-1）电穿孔（左）；箭头标记PSD-95：沿顶端树突的CFP点。BDNF脉冲导致钙强烈上升（用Δ表示F类/F类0值）正好位于两个假定突触的位置（右）。底部，行扫描显示由BDNF脉冲（红色箭头）诱导的钙瞬变开始于两个PSD-95:CFP位点，正好在那里显示最高的荧光增加。B类，另一个在PSD-95:CFP站点发生BDNF诱发钙瞬变的例子。C类，BDNF在PSD-95:CFP点状（蓝色迹线）和图中所示的相邻区域（灰色迹线）诱发钙瞬变B类.D类，Δ的最大振幅F类/F类0非突触树突部位和PSD-95处BDNF脉冲后1s内：CFP点(*第页<0.05；n个= 9).

讨论

我们使用钙成像技术直接研究突触形成过程中海马神经元发育过程中固有的BDNF信号。我们的结果有力地证明了BDNF信号在空间和时间上具有高度的特异性；内源性BDNF在发育树突的突触处诱导快速钙瞬变。此外，通过量化BDNF触发的钙瞬变的特征，我们确定了通过快速BDNF信号调节发育过程的限制条件。固有BDNF信号的时间（<1s）和空间（<10μm）特征及其相对丰度（>10/h/突触）使BDNF成为建立特定突触连接和功能性神经元网络的理想信号分子。

固有BDNF信号快速

在发育中的海马脑片中阻断内源性BDNF信号可降低自发快速和局部限制性钙瞬变的频率。相反，局部应用外源性BDNF可引起快速的局部钙瞬变。总之，这些结果表明BDNF是树突发育过程中快速局部钙瞬变的重要介质。

是什么使BDNF信号如此快速？我们研究了BDNF在海马神经元树突发育中触发树突状钙瞬变的机制，发现它们依赖于TrkB的激活和快速开放的离子通道，如电压门控钠通道和钙通道。它们不依赖于内部存储的钙释放。破伤风毒素实验排除了BDNF可能刺激突触前递质释放的可能性，而突触前递质又可能诱导树突状钙瞬变。总之，我们的结果表明BDNF通过TrkB和电压门控电流直接触发树突状钙瞬变。这种机制让人联想到先前描述的外源性BDNF的作用。BDNF能在几毫秒内使培养神经元去极化(Kafitz等人，1999年)需要激活电压依赖性钠通道(Blum等人，2002年)以及通过打开电压门控钙通道实现的快速钙瞬变(Berninger等人，1993年;Kovalchuk等人，2002年). 我们的结果通过证明发育中的海马神经元内在地产生快速BDNF信号来扩展这些发现。BDNF诱发的钙瞬变的开始动力学比我们记录的时间分辨率快100毫秒，这表明它们在几十毫秒或更短的范围内，这符合成熟神经系统峰值时间依赖性可塑性的时间要求(Dan和Poo，2004年). 然而，有证据表明，发育期间活动相关塑性的时间精度要求降低（0.1–1s）(Lee等人，2002年;Kasyanov等人，2004年). 因此，BDNF诱导的钙瞬变的时间特征（上升时间<100 ms，持续时间~700 ms）准确地反映了发育过程中对活动依赖性突触可塑性的时间要求。此外，我们还表明，这种现象在自然条件下发生的频率足以在突触发育中发挥关键作用。

原则上，有两种情况可以解释快速内源性BDNF信号：（1）BDNF在特定部位的快速释放，最有可能在突触（见下文），触发树突中的直接反应；（2） 紧张性BDNF释放建立了BDNF在整个组织中的扩散分布，TrkB受体的随机激活产生快速的树突状钙瞬变。我们的实验支持第一种情况，因为快速和局部应用BDNF会触发钙立即升高(图2G公司,​,3,三,​,5).5). 相反，我们的数据与第二种情况不一致，因为我们发现BDNF的持续和扩散存在并不是直接激活快速钙升高的合适刺激(图2C类,E类). TrkB受体的脱敏可能会阻止长期BDNF暴露期间的持续反应。从这些发现中，我们推断，诱导快速钙瞬变需要在树枝晶附近快速释放BDNF。此外，这些结果支持这样的观点，即内源性BDNF释放和树突状反应都是在时间上非常精确地调节的。

内源性BDNF信号定位于突触

我们观察到BDNF诱发的钙瞬变局限于特定的树突状位点。有趣的是，用PSD-95:CFP标记的假定突触后结构和局部钙瞬变的同步成像显示，BDNF触发的瞬变主要或仅发生在突触。

病毒过度表达突触PSD-95的一个潜在警告是，它可能会影响受感染神经元的健康。此外，如前所示，当它增加突触AMPA受体的数量时，可能会改变信号(Schnell等人，2002年). 突触AMPA受体的增加很可能不会影响TrkB的定位，因为TrkB和AMPA受体或PSD-95之间没有直接的相互作用。此外，我们观察到转染细胞和野生型细胞之间的结构或功能没有差异，表明过度表达不会影响生存能力或信号传导。（1） 转染锥体神经元与未转染神经元的细胞形态无差异。（2） 正常和过度表达神经元中自发发生的整体和局部钙瞬变的频率相似。（3） 突触发生局部钙瞬变的比例与之前使用固定后免疫组织化学而非PSD-95:CFP标记突触的研究中发现的相似(Lohmann等人，2005年). （4） 通过干扰BDNF信号传导而阻断的局部钙瞬变在正常细胞和转染细胞中的比例相似。再加上我们发现大多数PSD-95:CFP点都与突触蛋白阳性结构相对立，这些观察结果证实病毒过度表达的PSD-95:CFP是识别突触后信号的合适标记。

我们发现在内源性BDNF信号传递期间和BDNF局部传递后，BDNF在突触部位诱导钙瞬变。第二个观察结果表明树突对突触处的BDNF特别敏感。最直接的解释是突触中存在TrkB。这与一项免疫电镜研究相吻合，该研究报告TrkB免疫反应主要发生在海马锥体神经元树突内的突触上(Drake等人，1999年). TrkB位于树突的非突触部位，主要局限于细胞膜(Drake等人，1999年)表明功能性受体在突触部位富集(Gomes等人，2006年). TrkB的这种主要突触分布可能是此处观察到的BDNF诱发钙瞬变的局部特异性的基础。

虽然我们的结果表明内源性BDNF在突触附近释放，并直接触发突触后的钙瞬变，但尚不清楚BDNF是来自突触前还是突触后。已获得两种释放模式的证据(Hartmann等人，2001年;Kohara等人，2001年;Lessmann等人，2003年;Gartner等人，2006年). 与释放部位无关，先前已经表明BDNF在局部和全球水平上调节神经元的发育。此处确定的快速BDNF信号的内在形式发生在突触部位，沿着树突仅延伸几微米，远小于突触发育早期兴奋性突触之间的平均距离。这一观察暗示了内在BDNF信号在调节单突触发育中的作用，可能是通过调节突触成熟(图3) (卢瑟福等人，1998年;Itami等人，2003年;Walz等人，2006年). 此外，由于TrkB激活不同的细胞内信号通路，BDNF–TrkB信号通路激活平行通路，以不同方式调节神经元发育的局部和全局以及快速和慢速方面，这是一种有趣的可能性。

我们的结果还表明，BDNF是促进局部树突状钙活性的几个因素之一，因为只有一小部分局部树突形钙瞬变被干扰固有的BDNF信号阻断。我们的结论是，发育中的神经元能够在发育过程中对许多不同的细胞外信号作出反应，并通过产生非常特殊的局部和全局钙瞬变模式来整合这些信号。这种多因素钙瞬变可能调节结构发育和突触形成，最终帮助建立大脑的复杂神经网络。

脚注

我们感谢Ann Marie Craig（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）慷慨赠送PSD-95:CFP，感谢Hans Thoenen和Mark Hübener对本手稿的评论和批判性阅读。我们感谢Nicole Stöhr准备和维护切片培养，感谢Thomas Kleindienst开发用于数据分析的Matlab程序。我们还感谢悉尼剑桥大学提供BDNF抗体。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会