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神经科学杂志。2007年5月9日；27(19): 5224–5235.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.5169-06.2007
PMCID公司：项目经理C6672363
PMID：17494709

兴奋性GABA作用对皮层神经元形态成熟至关重要在体内

劳拉·坎塞达,* 休伯特·菲梅利,* 陈楷雯,和穆明普尔通讯作者
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

GABA对胚胎和新生儿皮层神经元具有兴奋作用，但体内这种GABA激发的功能基本上是未知的。使用子宫内电穿孔，我们通过提前表达Cl消除了GABA在大鼠心室前体细胞亚群和从这些前体细胞衍生的皮层神经元中的兴奋作用−转运体KCC2，GABA诱导电流的逆转电位和GABA后静息膜电位的变化证实了这一点A类受体阻断。我们发现，来自转染祖细胞的神经元向体感皮层第II/III层的径向迁移未受到显著影响，但其形态成熟度受到明显损害。此外，降低皮层神经元的神经元兴奋性体内通过过度表达向内激活的K+降低静息膜电位的通道模拟了早期KCC2表达的影响。因此，早期GABA兴奋引起的膜去极化对新生儿皮层神经元的形态学成熟至关重要体内.

关键词：KCC2，开发，径向迁移，K红外2.1,子宫内电穿孔，革兰菌素穿孔贴片

介绍

GABA是成年哺乳动物大脑中的主要抑制性神经递质，通过激活离子型和代谢型GABA受体发挥作用。然而，GABA在胚胎和新生儿大脑中产生兴奋作用(Ben-Ari，2002年).体外研究表明，早期GABA的作用可能有助于营养功能，包括细胞增殖、神经元迁移和神经突起生长(Represa和Ben-Ari，2005年)，但是体内这些功能的证据尚不明确。GABA的早期兴奋作用归因于细胞内高Cl−浓度（[Cl−]我)，设置Cl的反转电位−电流(E类氯)通过GABAA类受体的水平高于静息电位。神经元特异性钾的发育上调+-氯离子−协同转运蛋白KCC2降低[Cl−]我(Rivera等人，1999年;DeFazio等人，2000年)在出生后的时期，导致超极化转变E类氯以及GABA作用从兴奋到抑制的转换。在胚胎和新生神经元中，GABA诱导的膜去极化可能产生动作电位，激活电压依赖性钙2+通道，促进NMDA受体的开放，导致细胞内钙升高2+大量钙的浓缩和活化2+-开发过程中的依赖过程。

新生的皮层神经元在到达大脑中的最终目的地之前会经历广泛的迁移。在啮齿动物中，谷氨酸能神经元在发育皮层的脑室区（VZ）和脑室下区（SVZ）产生，并在放射状胶质细胞的引导下向发育皮层板（CP）迁移，从而形成皮层特有的分层结构(克里格斯坦，2005年). 在皮层切片的培养中，GABA受体的激活影响未成熟皮层神经元的运动和迁移(欧文斯和克里格斯坦，2002年); 激活GABAC类和GABAB类受体分别促进VZ和中间区（IZ）的迁移，而GABAA类当细胞到达CP时，受体激活提供停止信号(Behar等人，1996年,1998,2000,2001). GABA对迁移的一些影响需要膜去极化和Ca2+标高(Behar等人，1996年,1998)，与GABA在发育中的神经元中的兴奋作用一致。除了对迁移的影响外，神经突起的生长也受到GABA的影响A类各种系统中的受体激活(Barbin等人，1993年;Marty等人，1996年;Maric等人，2001年;Tapia等人，2001年;Borodinsky等人，2003年)，这种作用可以通过促进GABA合成或激活L型钙的试剂复制2+通道(Maric等人，2001年;Tapia等人，2001年;Borodinsky等人，2003年). 有趣的是，神经突起的生长也可能被速尿拮抗，速尿抑制氯离子−运输工具(Maric等人，2001年)再次表明GABA的参与A类受体活化与钙2+高程。

尽管有文件记录在体外兴奋性GABA的作用，GABA兴奋在早期皮质发育中的作用体内目前尚不清楚。GABA能系统关键基因基因缺失的小鼠大脑发育无明显缺陷(Asada等人，1997年;Ji等人，1999年;Heinen等人，2003年)尽管尚未对这些小鼠的皮层神经元进行详细的形态学检查。在本研究中，我们使用了子宫内电穿孔，通过移动神经元的E类氯通过KCC2的早期表达，确定在体外兴奋性GABA的作用也存在体内在其自然环境中的皮层神经元。我们发现，消除兴奋性GABA作用会严重损害皮层神经元的形态成熟体内对其径向迁移没有显著影响。

材料和方法

子宫内电穿孔。

定时妊娠的Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories，Wilmington，MA）在胚胎第17天（E17）至E18阶段用异氟醚麻醉（诱导期为3.5%，手术期为2.5%），并通过剖腹手术暴露子宫角。使用30.5 ga针头（BD Biosciences，San Jose，CA）通过子宫壁将含有感兴趣的表达载体（2 mg/ml）和染料Fast Green（0.3 mg/ml；密苏里州圣路易斯市西格玛市）的盐水溶液（1-2μl）注射到胚胎的一个侧脑室中。每个胚胎的头部用镊子型圆形电极（直径为1厘米；522型；哈佛仪器，马萨诸塞州霍利斯顿）穿过子宫壁，用方波电穿孔发生器（ECM 830型；哈佛设备）传递五个电脉冲（振幅，50伏；持续时间，50毫秒；间隔，100毫秒）。然后将子宫角放回腹腔，缝合子宫壁和皮肤，让胚胎继续正常发育。用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）构建体电穿孔的对照胚胎和用KCC2/EGFP或K电穿孔的胚胎红外/从同一窝幼崽中获得EGFP构建物（定义见下文，表达载体），并分别在左心室和右心室进行注射，以便稍后进行鉴定。K系列红外/EGFP构建物与表达YFP（黄色荧光蛋白）的载体共电穿孔。在一组对照实验中，表达番茄的载体（定义见下文，表达载体）与EGFP或KCC2/EGFP共同转染。所有动物实验方案均由加州大学伯克利分校动物护理和使用委员会批准。

表达式向量。

将编码KCC2的cDNA克隆到pCAG-IRES-EGFP中（中国上海神经科学研究所张欣赠送）。pCAG-Kir2.1-IRES-EGFP载体是C.Wang（中国上海神经科学研究所）的礼物，pCAG-IRES-tdTomato是通过在pCAG-ERES-EGFP构建物中用tdTomato（加利福尼亚大学圣地亚哥分校R.Tsien的礼物）替代EGFP而创建的。表达载体pCAG-IRES-EGFP、pCAG-KCC2-IRES、pCAG-Kir2.1-IRES-EGFP和pCAG-INES-tdTomato随后分别命名为“EGFP”、“KCC2/EGFP”、“Kir2.1/EGFP，”和“Tomato”。这些结构体含有一个改良的鸡β-肌动蛋白启动子和一个巨细胞病毒即时早期增强子，该增强子具有高持久性体内表达感兴趣的蛋白和EGFP。大鼠KCC2 cDNA已在前面描述(Fiumelli等人，2005年). 作为对照，我们使用QuikChange XL定点突变试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）生成了功能丧失突变株C568A-KCC2。先前已经证明，这种保守的半胱氨酸（大鼠体内为568）的相同替代物在等张和低张条件下，当表达于爪蟾卵母细胞(Reynolds等人，2004年).

免疫染色。

围生期（E18–P1）大脑直接固定在4%多聚甲醛/PBS中。出生后（≥P2）大脑通过4%多聚醛/PBS的经心灌注进行固定。大脑在体感皮层水平用振动棒（型号3000；位于密苏里州圣路易斯的振动棒）进行冠状切片，切片（70μm）作为游离切片进行免疫染色。样品在0.3%Triton X-100/PBS中渗透，并在含有5%NGS和0.1%BSA的PBS中封闭。一级抗体（兔抗KCC2，1:200；鼠抗GFP，1:500；鼠抗神经元核（NeuN），1:500；Millipore，Billerica，MA）在块溶液中培养。使用荧光共轭二级抗体检测免疫染色[Alexa 488和Alexa 568（Invitrogen，San Diego，CA）；Cy5（花青素5），2μg/ml（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）]。在一些实验中，用Neurotrace Nissl 640/660（Invitrogen）对大脑切片进行复染。最后，将样品安装在Vectashield（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories），并用共焦显微镜进行检查。对于在P14进行的迁移实验，通过共焦显微镜直接获得EGFP荧光信号（无GFP免疫染色）。

共焦图像采集。

为了分析E21–P6的迁移，在配备10×干物镜[数字孔径（NA），0.3]的共焦激光扫描显微镜（DM IRBE；Leica Microsystems，Bannockburn，IL）上采集GFP免疫染色和Nissl染色复染切片的图像。共焦图像（30微米厚z（z）-获得每只实验动物的两整片切片，以及Z轴-将一系列共焦图像投影为二维（2-D）表示。为了分析P14处的皮层组织，在配备10×干物镜（NA，0.3）的共焦激光扫描显微镜上获取仅对NeuN进行免疫染色的切片图像（无GFP免疫染色）。采集每只实验动物的整个切片的共焦图像（单个焦平面），调整图像的对比度以增强细胞体的荧光，同时衰减来自神经元过程的信号以促进细胞计数。为了进行形态计量分析，在配备20×油浸物镜（NA，0.7）的共焦激光扫描显微镜上获取GFP免疫染色切片的图像。共焦图像（50微米厚z（z）-获得每只动物的三个代表性场：一个位于切片高密度转染细胞区域的场和两个位于低密度转染神经元区域的场。Z轴-将一系列共聚焦图像投影到二维图像中，并用NeuronJ软件追踪和量化轴突(Meijering等人，2004年) (http://rsb.info.nih.gov/ij/). 计算每个神经元的总轴突长度和分支数。仅使用具有低密度转染神经元的场来量化轴突长度和数量。每窝动物的所有切片都是在一次训练中随机采集的，以尽量减少激光输出波动和荧光降解引起的误差。图像采集和数据分析以盲法进行。

电生理学。

用EGFP、KCC2/EGFP或K电穿孔大鼠（P0–P15）制备冠状皮质切片红外/EGFP，如前所述(Fiumelli等人，2005年). 对体感皮层VZ或II/III层神经元进行全细胞穿孔补片记录。利用垂直荧光显微镜（E600 FN；日本东京尼康）通过EGFP荧光鉴定来自电穿孔祖细胞的神经元。玻璃微移液管（电阻为3–5 MΩ）顶部填充150 M的内部溶液米KCl或CsCl和10 m米HEPES（～300 mOsm，pH 7.3），并用含有40μg/μl禾本科菌素A（Sigma）的相同溶液进行背面填充。在使用两性霉素B的实验中，移液管顶部填充了一种内部溶液，其中包括（单位：m米)154 K-葡萄糖酸盐，9氯化钠，1氯化镁2，1 HEPES和0.2 EGTA，然后用含有两性霉素B（200μg/ml；EMD Biosciences，La Jolla，CA）的相同内溶液进行背面填充。所含外槽溶液（单位：m米)124氯化钠、2.8氯化钾、2硫酸镁4，1.25 NaH2人事军官4，2氯化钙2，26氯化钠三、和12d日-葡萄糖（～310 mOsm，pH 7.4），用95%的氧进行氧化2和5%CO2，用于在22°C下连续灌注切片（1.5 ml/min）。在一些实验中，TTX（1μ米; 西格玛）和氯化镧三(30 μ米; 将Sigma）添加到细胞外溶液中以阻断电压门控钠+和钙2+电流。使用补丁灯放大器进行记录（Axopatch multicamp 700A；Molecular Devices，Union City，CA）；数据以10kHz采样，以5kHz过滤，并用pClamp 8.0软件（Molecular Devices）进行分析。这个E类氯通过测量饱和GABA（1 m米; 20毫秒；Sigma）应用于细胞体，用微型移液管连接到电动门控压力阀（微螺旋体），使用革兰菌素在电流灯模式下穿孔贴片记录。对于每个实验，E类氯每隔1分钟进行三次测量。在某些情况下，以1分钟的间隔进行两次重复，其中膜电位电流被箝位在两个不同的电位。要确定E类氯在P4–P15动物中，我们在电压灯模式下进行了禾谷镰刀菌素穿孔贴片记录。保持电位以10mV的增量变化，并测量对外源性GABA脉冲（100μ米; 20–50毫秒；间隔15s）在体部附近涂抹。采用线性回归法计算GABA诱导电流电压依赖性的最佳拟合线，该线与横坐标的内插截距取为E类氯值。对于每个实验，E类氯每隔3分钟进行三次测量。如果在实验过程中串联电阻变化大于15%，或者如果穿孔斑块自发破裂为全细胞结构，如E类氯分别在电流或电压灯模式下记录的～0 mV或大去极化电流。为了表征补体内源性GABA诱导的电流，我们在禾本科菌素内溶液中用CsCl取代KCl，并记录膜电流[V（V）c（c）（箝位电压），−60 mV；镀液添加150μ前后以2 kHz]过滤米荷包牡丹碱（西格玛）。为了量化峰值数量，在电压灯模式下建立全细胞构型后，在电流灯模式下记录细胞。向细胞注入去极化阶跃电流（增量为4 pA；持续时间为300 ms）。为了生成“输入-输出曲线”，每个电流注入步骤的平均尖峰数是从一式三份的每个实验中获得的。在没有电流注入的情况下测量静息膜电位。

统计分析。

使用t吨测试或方差分析事后（post-hoc）比较。对于非正态分布的数据集，使用非参数Kruskal–Wallis单向方差分析检验。所有结果均表示为平均值±SEM。

结果

新生皮层神经元中早熟KCC2的表达体内

在发育中的大鼠新皮质中，出生后KCC2的表达导致GABA作用在出生后第二周结束时从兴奋转换为抑制(Owens等人，1996年;Clayton等人，1998年). 在未成熟培养的神经元中，我们发现KCC2过度表达发生了改变E类氯朝向更多负值，并防止GABA诱导的Ca2+标高(Fiumelli等人，2005年). 在本研究中，我们旨在早期终止GABA兴奋体内KCC2在新生皮层神经元亚群中的过早表达。我们将编码KCC2和EGFP的双顺反子结构或EGFP结构注入E17–E18大鼠胚胎的侧脑室，并通过子宫内电穿孔(Saito和Nakatsuji，2001年). 允许正常胚胎发育后体内，对P0–P1大鼠的脑切片进行KCC2和GFP的免疫染色。转染KCC2/EGFP或仅转染EGFP的大鼠在某些神经元中可检测到EGFP高水平表达(图1一,b条). 强KCC2染色，与EGFP荧光共定位(图1b条)，存在于KCC2/EGFP转染的皮质的CP和VZ中，表明内源性KCC2在P0处以非常低的水平表达，并且子宫内电穿孔使KCC2在VZ祖细胞亚群和这些细胞衍生的皮层神经元中过早表达(图1b条).

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VZ细胞中KCC2的过早表达导致E类氯.一、转染P0大鼠体感皮层冠状面共聚焦图像子宫内用EGFP或KCC2/EGFP构建电穿孔，并对GFP和KCC2进行免疫染色。KCC2和EGFP在分布于发育中皮层的神经元亚群中表达。白色虚线标记了发育中皮层不同区域之间的边界。比例尺，100μm。b条，CP（顶部两个面板）和VZ/SVZ（底部两个面板一注意KCC2和EGFP在KCC2/EGFP转染神经元中的共定位。比例尺，50μm。c（c），的切片记录配置示意图E类氯P0处的测量值。d日，吹气饱和GABA浓度在P0和P1大鼠体感皮层急性切片的VZ细胞体上引发膜电压反应的示例，这些体感皮层被KCC2/EGFP（红色）或EGFP（绿色）转染。来自相同切片的未转染细胞作为对照（灰色）。在两种不同电位下进行两次膜电位电流钳制重复，间隔1分钟。校准：500 ms，10 mV。e（电子）,E类氯GABA吹气法估计P0和P1未转染对照神经元（灰色）或仅转染EGFP的神经元（绿色）或KCC2/EGFP的神经元（红色）的值。每个数据点（开放符号）代表一个神经元的结果，平均值（±SEM）显示在右侧。KCC2/EGFP转染细胞的数据与未转染（对照）或EGFP转染细胞有显著差异(第页<0.001，单因素方差分析；第页< 0.05,事后（post-hoc）Holm-Sidak方法）。

早期KCC2表达消除GABA兴奋

通过估计KCC2早期表达在消除GABA兴奋中的有效性E类氯用革兰菌素穿孔贴片记录(Kyrozis和Reichling，1995年)在E18用KCC2/EGFP或EGFP构建物电穿孔的P0-P1大鼠急性皮质切片VZ细胞中(图1c（c）). 革兰菌素形成膜孔，可渗透单价阳离子和小的不带电分子，但不能渗透氯−从而留下[Cl−]我未受干扰，允许对E类氯因为增殖的VZ细胞通过间隙结电耦合(LoTurco等人，1995年)因此，我们估计很难实现电压钳位E类氯在VZ电池中使用电流钳(Owens等人，1996年)通过测量GABA饱和剂量（1 m）产生的峰值去极化或超极化米; 20毫秒）。TTX（1μ米)和La3+(30 μ米)用于阻断Na+和钙+电流和Cs+（150米米)存在于阻止K的微电极内溶液中+频道。在这些条件下，GABA脉冲诱导的峰值膜电位值代表对E类氯(Owens等人，1996年). 如中的录制示例所示图1d日我们发现，GABA脉冲诱导未转染对照细胞和仅表达EGFP的细胞膜电位去极化至约−35 mV，而相同的GABA脉冲则诱导KCC2/EGFP表达细胞超极化至约-70 mV。所有记录的总结表明，KCC2过早表达导致E类氯从对照细胞中的−34.9±2.3 mV到KCC2细胞中的–67.9±1.9 mV(图1e（电子）)，接近正常发育期间获得的值（有关比较，请参见图5c（c）)与静息膜电位（−54.7±1.4 mV；n个= 5; KCC2细胞），与GABA作用从兴奋到抑制的转换一致。

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在P14观察到兴奋性GABA对树突形态的影响。一，通过转染P14大鼠体感皮层冠状切片的共焦图像子宫内用EGFP或KCC2/EGFP构建电穿孔，并对GFP和KCC2进行免疫染色。比例尺，200μm。b条，示例I–V型用KCC2/EGFP（红色，2次重复间隔3分钟）或EGFP（绿色）转染P14大鼠体感皮层急性切片中第II/III层神经元胞体上的GABA吹气引起的膜电流反应的关系。插图，不同保持电位下GABA诱导电流的样本迹线。校准：100 ms，100 pA。c（c）,E类氯通过GABA吹气测定未转染（灰色）或仅转染EGFP（绿色）或KCC2/EGFP（红色）的P14和P15神经元的值，与图4c（c）KCC2/EGFP细胞的数据与对照细胞或EGFP细胞的数据无显著差异(第页>0.001，单因素方差分析）。d日代表性GFP免疫染色显示P14体感皮层第II/III层冠状切片中EGFP表达神经元密度高的区域，这些区域转染了EGFP、KCC2/EGFP或mtKCC2/EGFP。比例尺，100μm。e（电子），来自转染EGFP或KCC2/EGFP的大鼠皮层切片的低密度EGFP表达细胞区域P14处单个神经元共焦图像的二维投影示例。比例尺，100μm。（f），追踪用EGFP或KCC2/EGFP转染的P14皮层的II/III层中20个随机采样的神经元的树突轴的2-D投影。比例尺，100μm。克转染EGFP或KCC2/EGFP后，P14处皮层神经元的树突总长度和分支数。数据表示平均值±SEM。对于这两个参数，KCC2/EGFP转染细胞的值与EGFP-和mtKCC2/EGFP-转染细胞不同(第页<0.001，Kruskal–Wallis单向方差分析；第页< 0.05,事后（post-hoc）Dunn方法），但EGFP和mtKCC2/EGFP细胞之间没有发现差异(第页> 0.05). 括号中的数字是指所分析的细胞/大鼠总数。

神经元迁移不受GABA兴奋消除的影响体内

在E18至P6期间，首次对新生皮层神经元的径向迁移研究了早期KCC2表达对皮层发育的功能影响。电穿孔后第19天，在体感皮层冠状片中几乎只在VZ和SVZ中发现EGFP标记的细胞(图2一). 到E21时，EGFP细胞似乎在从VZ到CP的皮层中扩散(图2一). 在出生后的头几天，EGFP细胞到达CP的百分比逐渐增加，基本上所有荧光细胞都在P6前驻留在第II/III层(图2一). 在所有被检测的年龄段，我们发现表达KCC2/EGFP或仅表达EGFP的细胞的分布和总数没有显著差异(图2b条). 我们注意到，正如E类氯上述对P0–P1皮层VZ细胞的测量，KCC2/EGFP转染细胞在其径向迁移过程中不太可能经历任何GABA兴奋。

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KCC2的过早表达并不影响神经元的迁移。一，大鼠体感皮层冠状面不同日的典型共焦图像子宫内EGFP或KCC2/EGFP结构的电穿孔（E17）。切片进行GFP免疫染色（绿色），并用Nissl荧光染色（蓝色）进行复染。白色虚线标记了发育中皮层不同区域之间的边界。比例尺，200μm。b条量化位于VZ、IZ或CP（标记为一)在不同的发育年龄，以同一节段荧光细胞总数的百分比表示。数据代表平均值±SEM。KCC2/EGFP细胞数据与所有年龄段仅观察到的EGFP细胞数据无显著差异(第页>0.001，单因素方差分析）。括号中的数字是指处理的大鼠总数。

为了更详细地研究兴奋性GABA在皮层精细分层中是否重要，我们在P14对动物进行了检查，当时可以清楚地辨别出体感皮层的特征性六层结构(图3一,b条). 如所示图3一，我们在P14的皮质层中未发现KCC2/EGFP或EGFP神经元的分布有任何显著差异。为了量化到达不同皮层层的细胞数量，对体感皮层的切片进行神经元标记NeuN的免疫染色，并沿着皮层厚度对NeuN阳性和表达EGFP的细胞进行计数(图3b条,d日). 我们发现KCC2/EGFP表达神经元的分布与EGFP表达细胞的分布相似(图3b–d段). NeuN染色显示，不同层神经元密度变化的归一化进一步表明，第II/III层KCC2/EGFP和EGFP表达神经元选择性但相似的聚集(图3e（电子）). 因此，过早地从GABA能兴奋转换为抑制并不影响来自E17或E18转染的祖细胞的皮质神经元亚群的径向迁移和皮质分布。

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KCC2的过早表达不影响皮层分层。一，通过转染的大鼠P14体感皮层冠状切片的共焦图像子宫内用KCC2/EGFP或EGFP电穿孔。对切片进行神经元标记NeuN（蓝色）染色，以突出皮质层。比例尺，200μm。b条，转染EGFP的P14大鼠典型切片的EGFP荧光和NeuN免疫荧光的代表性图像。c（c）、EGFP数量+EGFP和KCC2/EGFP转基因动物皮质深度相关的细胞（50μm容器中）。NeuN的数量+细胞是通过对KCC2/EGFP和EGFP动物的切片进行平均获得的，因为它们没有显著差异(第页>0.001，双向方差分析）。d日，转染KCC2/EGFP的P14大鼠典型切片的代表性图像b条.e（电子）、EGFP积累+不同皮层中的细胞，如EGFP的比例所示+和NeuN+每个50μm bin处的细胞（来自c（c）)沿着皮质轴。括号中的数字表示所分析的大鼠总数。

GABA兴奋对皮层神经元的形态成熟至关重要体内

然后，当对照动物内源性KCC2表达水平仍然较低，但神经元已完成径向迁移并开始表现出复杂的树突树枝状结构时，我们研究了KCC2/EGFP表达神经元在P4–P6的形态是否受到影响(图4一). 的测量E类氯在电压灯条件下，通过检测GABA诱导的细胞体电流-电压关系，对KCC2/EGFP-和EGFP-表达神经元以及II/III层中未转染细胞进行检测。我们发现，与对照细胞相比，KCC2/EGFP表达导致更多阴性E类氯（KCC2-过表达细胞中为−72.1±2.3 mV；对照神经元为−52.1±2.2 mV）(图4b条,c（c）). 因为平均静息电位为−64.7±1.0 mV(n个=21）在KCC2/EGFP细胞和−60.0±1.5 mV(n个=33）在对照细胞中，GABA作用对对照细胞是兴奋的，对KCC2/EGFP转染的神经元是抑制的。此外，尽管早期KCC2表达对皮质神经元的径向迁移没有显著影响，但这些神经元到达第II/III层后的形态成熟受到很大影响。与仅表达EGFP的对照细胞相比，在P6，表达KCC2-的细胞显示出较少且较短的树突状突起，其中很少投射到第I层(图4d日). 典型神经元的投影图像(图4e（电子）)和重建神经元的样本(图4（f）)与仅表达EGFP的细胞相比，KCC2/EGFP表达细胞的总轴突长度和分支数均显著减少(图4克).

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GABA激发对形态成熟至关重要。一、转染P4大鼠体感皮层冠状切片的共焦图像子宫内电穿孔或KCC2/EGFP构建，并对GFP和KCC2进行免疫染色。比例尺，200μm。b条，示例I–V型用KCC2/EGFP（红色，2次重复间隔3分钟）或EGFP（绿色）转染P4–P6大鼠体感皮层急性切片中第II/III层神经元胞体上的GABA吹气引起的膜电流反应的关系。插图，不同保持电位下GABA诱导电流的样本迹线。校准：100 ms，100 pA。c（c）,E类氯通过GABA吹气测定未转染（灰色）或仅转染EGFP（绿色）或KCC2/EGFP（红色）的P4-P6神经元的值。数据点表示单个神经元（开放菱形）的结果，平均值（±SEM）显示在右侧。KCC2/EGFP转染细胞的数据与未转染（对照）或EGFP转染细胞显著不同(第页<0.001，单因素方差分析；第页< 0.05,事后（post-hoc）Holm-Sidak方法）。d日代表性的GFP免疫染色显示，转染EGFP和KCC2/EGFP的P6体感皮层第II/III层冠状切片中EGFP表达神经元密度较高的区域。比例尺，100μm。e（电子），通过转染EGFP或KCC2/EGFP的大鼠皮层切片，在EGFP表达细胞密度低的区域，P6处单个神经元共焦图像的二维投影示例。比例尺，100μm。（f），追踪用EGFP或KCC2/EGFP转染的P6皮层的II/III层中20个随机采样的神经元的树突轴的2-D投影。比例尺，100μm。克、转染EGFP或KCC2/EGFP的P6皮质神经元的树突状总长度和分支数。数据表示平均值±SEM。对于这两个参数，KCC2/EGFP转染细胞的值与EGFP转染细胞不同(第页<0.001，Kruskal–Wallis单因素方差分析；第页< 0.05,事后（post-hoc）邓恩方法）。括号中的数字是指所分析的细胞/大鼠总数。

当GABA完成从兴奋到抑制的转换时，我们还检测了P14处KCC2/EGFP表达神经元的形态学(Owens等人，1996年)早熟KCC2表达的影响可能已经积累。我们发现在P14，内源性KCC2表达高于P6动物（比较图4一,​,55一)尽管EGFP表达细胞的水平仍然低于KCC2/EGFP表达细胞。有趣的是E类氯在对照P14动物中发现的结果与KCC2/EGFP过度表达细胞中获得的结果没有显著差异(图5b条,c（c）)这表明KCC2的过度表达导致了E类氯在这些神经元中。如所示图5d日，在P14发现的KCC2/EGFP过度表达细胞的形态学损伤比在P6发现的更为明显（有关比较，请参见图4d日). 典型转染神经元的投影图像(图5e（电子）)和重建神经元的样本(图5（f）)与仅表达EGFP的细胞相比，在P14时，KCC2/EGFP表达细胞的总轴突长度和分支数均显著减少(图5克). 因此，在发生内源性KCC2高表达后，P14动物中由于KCC2过早表达而导致皮层神经元形态成熟受到破坏。

上述明显的形态学损伤不是由于使用双顺反子结构导致KCC2在EGFP上游表达，这种情况可能导致EGFP表达效率降低，与仅表达EGFP的细胞相比，KCC2/EGFP表达细胞的树突状突起分辨率较差。通过将携带红色荧光蛋白（番茄）序列的质粒与KCC2/EGFP或EGFP共转染，排除了这种可能性。对于同时表达番茄和KCC2/EGFP或EGFP的细胞，我们发现绿色和红色荧光显示的神经元形态是相同的（补充图S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。因此，KCC2/EGFP转染神经元的形态学损伤不能归因于KCC2/EGFP结构的EGFP表达不良。

测试KCC2/EGFP表达细胞中观察到的形态学效应是否由特定的Cl引起−KCC2的转运功能，我们使用一种突变形式的KCC2（mtKCC2）进行了实验，这种KCC2在Cl中有缺陷−转运蛋白活性（见材料和方法），因此在预防GABA诱导的钙2+转染的年轻皮层神经元的升高在体外（补充图S2，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。我们发现mtKCC2的过度表达没有导致P14处皮层神经元的形态学损伤(图5d日,克). 因此，在KCC2-转染神经元中观察到的形态学效应可归因于氯离子的改变−消除GABA兴奋的转运体活性。

年轻的皮层神经元处于GABA兴奋状态

GABA的张力激活A类受体在幼年动物的许多脑区都很明显(Owens等人，1996年;Farrant和Nusser，2005年). 在我们的实验条件下，我们发现对GABA合成酶谷氨酸脱羧酶65（GAD65）和GAD67阳性的细胞和过程在所有年龄段的大脑皮层中都大量存在（补充图S3，见网址：www.jneurosci.org作为补充材料），与之前的研究结果一致(兰黛等人，1986年;Marin-Padilla，1998年;Lavdas等人，1999年). 使用革兰菌素穿孔贴片记录法，我们测量了浴液中荷包牡丹碱对未转染（对照）和KCC2/EGFP表达神经元作用前后的膜电流(V（V）c（c），−60 mV）。如所示图6一,b条，用荷包牡丹碱（150μ米)导致对照神经元的基线膜电流向外偏移，显示这些脑片中存在由内源性分泌的GABA引起的强直去极化电流。这与皮质发育的这一阶段的兴奋性GABA作用相一致。相反，我们发现在同一切片中，荷包牡丹碱处理导致KCC2/EGFP表达神经元的膜电流向内移动，这与KCC2过早表达导致内源性强直GABA作用从兴奋（去极化）转变为抑制（超极化）一致。此外，我们发现对照细胞（EGFP转染细胞和非转染细胞；-60.0±1.5 mV；n个=33）比KCC2/EGFP转染细胞（−64.7±1.0 mV；n个= 21; 学生的t吨测试，第页<0.05），证实这些神经元上存在强直GABA作用。

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测量大脑皮层神经元的强直GABA作用。一示例记录显示，应用荷包牡丹碱（bar）在控制皮层细胞中产生稳定的外向电流（顶部迹线），但在KCC2/EGFP表达细胞中产生恒定的内向电流（底部迹线）。在体感皮层第II/III层神经元的P4–P6处进行记录。校准：5 s，10 pA。b条，关于应用荷包牡丹碱后发现的强直GABA诱导电流的所有数据摘要。开放符号代表单个病例，直方图代表平均值±SEM。两组数据有显著差异(第页< 0.001,t吨测试）。c（c），应用荷包牡丹碱（Bicu）前后，未转染对照皮质细胞（灰色）或KCC2/EGFP表达细胞（黑色）对分级（4 pA步）去极化电流（底部）的响应中膜电位变化的记录示例。校准：200 ms，20 mV。d日，输入-输出曲线，描述应用荷包牡丹碱之前（实线）和之后（虚线）在未转染的对照细胞和KCC2/EGFP表达细胞中由梯度去极化电流引发的动作电位数量。应用荷包牡丹碱后，这两组细胞分别出现显著的向右和向左移动(第页<0.05，Wilcoxon符号秩检验）。在P5和P6进行记录。n个指记录的单元格总数。

强直性GABA引起的小稳态兴奋/抑制膜电流A类受体激活足以影响这些年轻皮层神经元的动作电位启动。在应用荷包牡丹碱前后，我们测量了非转染（对照）和KCC2/EGFP表达细胞对去极化电流分级阶跃（“输入”）的反应，这些细胞（P5–P6）的动作电位（“输出”）的数量(图6c（c）). 在相同的注入电流范围内，对照细胞比表达KCC2/EGFP的细胞激发更多的动作电位(第页<0.0001，单向重复测量方差分析；第页< 0.05,事后（post-hoc）Holm-Sidak方法）。荷包牡丹碱处理降低了对照细胞的放电，但增加了KCC2/EGFP表达细胞的放电（分别由输入-输出曲线的向右偏移和向左偏移表示）(图6d日). 此外，在较年轻的神经元（P4）中，它们对去极化电流的激发更具抵抗力，并且最多只能激发一个动作电位，我们发现荷包牡丹碱治疗后，在对照神经元中，动作电位的电流阈值变得更高，而在KCC2过度表达的神经元中则更低（数据未显示）。总之，这些结果都支持这样一种观点，即在P4–P6控制皮层细胞中，GABA的紧张作用是兴奋性的，并且这些细胞中KCC2的过早表达将GABA的作用转化为抑制作用。

K（K）红外2.1表达足以损害皮层神经元的形态成熟

如果GABA对形态成熟的影响是由神经元兴奋引起的，那么在早期发育过程中减少兴奋会损害皮层神经元的形态成熟。为了验证这一假设，我们过度表达了内向整流器K+通道K红外2.1在新生皮层神经元中，通过超极化膜电位降低神经元兴奋性的操作(Hartman等人，2006年). 在E18用编码K的结构体电穿孔大鼠胚胎红外用两性霉素穿孔贴片记录法在P8动物急性切片中记录EGFP和转染神经元。我们发现K的过度表达红外导致膜电位（−76.9±1.8 mV；n个=15）显著高于相同切片的对照神经元（−59.4±1.2 mV；n个= 11). 此外，K红外-转染细胞对分级去极化电流的反应表现出较少的棘波(图7一)输入-输出曲线显著向右移动(图7b条). 重要的是，与仅表达EGFP的皮层细胞相比，K红外-转染细胞在P14表现出形态成熟缺陷，突起长度和分支数明显减少(图7d–f日)以及未能到达第一层的短树枝状过程(图7c（c）). K中发现的这些缺陷红外-表达神经元表明，减少膜去极化足以损害这些发育中的皮层神经元的形态成熟。

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K（K）红外2.1过度表达降低了神经元放电并损害了形态成熟。一，显示未转染对照细胞（灰色）和K细胞对电流注入（底部）分级步骤（4 pA）的膜电压响应的示例记录红外/EGFP-表达细胞（黑色）。校准：200 ms，20 mV。b条，未转染对照细胞和K的输入-输出曲线红外/EGFP-表达细胞。发现两组细胞之间存在显著差异(第页<0.0001，单向重复测量方差分析；第页< 0.05,事后（post-hoc）Holm-Sidak方法）。在P8进行记录。括号中的数字表示记录的单元格总数。c–f，实验数据与图4，除了神经元转染了K红外/EGFP代替KCC2/EGFP。（f），两组之间的两个参数均存在显著差异(第页<0.001，Kruskal–Wallis单因素方差分析；第页< 0.05,事后（post-hoc）邓恩方法）。

讨论

本研究的结果为兴奋性GABA在皮层早期发育中的作用提供了新的线索体内我们发现，在围产期发育过程中，通过过早表达KCC2来消除GABA的兴奋作用，会损害皮层神经元的形态成熟，而不会影响它们向体感皮层II/III层的径向迁移。急性切片中皮层神经元的电生理记录显示，内源性分泌的GABA存在强直兴奋，KCC2转染使强直GABA作用从兴奋转变为抑制。此外，通过过度表达K降低神经元的兴奋性红外2.1体内部分模拟了早期KCC2表达对形态成熟的影响。总之，这些发现表明GABA信号引起的去极化对新生皮层神经元的形态成熟至关重要体内.

KCC2或K的过度表达红外通过使用子宫内电穿孔。这项技术使我们能够在发育早期的相当长一段时间内，在发育中的皮层神经元中过度表达蛋白质体内，有三个显著特征：第一，我们只在E17–E18转染胚胎，使其早期发育不受干扰。其次，转染仅针对少数VZ祖细胞，这些祖细胞产生了第II/III层皮质细胞亚群（转染区神经元总数的～7%）(图3c（c）)从而可以在其自然环境中检查转染的神经元。第三，因为子宫内VZ细胞的电穿孔最终导致谷氨酸能细胞（锥体和棘状星状细胞）的转染，而不是GABA能细胞(Hatanaka等人，2004年)，我们正在检测兴奋性GABA对发育中的谷氨酸能神经元的作用，推测这不会影响皮层中内源性GABA的浓度。

从爬行动物到灵长类，许多物种的大脑发育中的各个区域都观察到兴奋性GABA能活动，这表明这是大脑发育中进化上保守的特征(Ben-Ari，2002年). 然而，尽管有许多在体外研究表明GABA在调节发育中神经元的增殖、迁移和形态分化方面的营养功能，但很少有体内证实这些观察结果的证据。令人惊讶的是，编码GABA信号蛋白的基因缺失的小鼠在大脑发育中没有明显缺陷。例如，编码GABA合成酶GAD基因的靶向缺失小鼠(Asada等人，1997年;Kash等人，1997年)或对于α1或β三GABA亚基A类受体(Homanics等人，1997年;Heinen等人，2003年)尽管GABA能传递发生改变，但皮层形态没有明显异常。缺乏体内小鼠的GABA效应可能归因于基因敲除小鼠的代偿机制或物种特异性效应。事实上，平行在体外同一组小鼠和大鼠皮层培养的研究(Behar等人，1999年,2000,2001)提示谷氨酸而不是GABA对小鼠皮层神经元的迁移更重要，但对大鼠皮层神经元的迁移不重要。我们的体内对大鼠大脑的研究允许与在体外此前曾报道过大鼠研究。

尽管GABA系统基因敲除的小鼠大脑结构没有明显异常，但尚未对神经元进行详细的形态学检查。事实上，最近的研究揭示了一些细微的缺陷，例如腹内内侧核变大，α1和β三敲除小鼠(Dellovade等人，2001年;Heinen等人，2003年)分别是。此外，GAD65基因敲除小鼠的新生颗粒细胞成熟延迟(Overstreet-Wadiche等人，2006年). 在GABA能系统突变小鼠中发现的出乎意料的轻微表型可能归因于用其他递质（如甘氨酸、牛磺酸和谷氨酸）代替GABA来代替兴奋作用的发育补偿(LoTurco等人，1995年;Flint等人，1998年). 通过目前的转染方法可以避免这种补偿，该方法仅在有限的围产期消除早期GABA兴奋。此外，通过甘氨酸和牛磺酸的潜在代偿作用不会有效，因为这两种氨基酸都会激活Cl−通道(Hussy等人，1997年)其作用可能与GABA能活性一样，受到KCC2表达的影响。

安体内兴奋性GABA在成年大鼠的海马和齿状回中起着重要作用，神经发生在出生前就开始了，并一直持续到成年(Ming和Song，2005年). 的确，体内最近已获得证据表明，GABA在成人大脑这些区域新生成神经元的发育中具有营养功能，其方式类似于早期发育大脑中神经元的发育，在谷氨酸能输入之前存在兴奋性GABA作用(Ming和Song，2005年;Overstreet等人，2005年;Song等人，2005年;Overstreet-Wadiche和Westbrook，2006年). 这些体内研究表明，兴奋性GABA参与成年新生海马颗粒细胞的神经发生、分化、形态成熟和突触形成(Deisserth等人，2004年;Tozuka等人，2005年;Ge等人，2006年). 特别是，通过减少Na的表达将GABA能激发转化为抑制+-K（K）+-氯离子−共同转运蛋白NKCC1阻碍成年海马新生成颗粒细胞的树突状细胞发育(Ge等人，2006年). 尽管我们对KCC2表达的干扰导致了更明显的形态学效应，但我们对新生儿皮层GABA兴奋的形态学效应的发现与成人海马的后一发现一致。因此，尽管发育中的皮层和成年海马体的环境存在巨大差异，GABA的兴奋似乎对所有年龄段的神经元形态发生都至关重要。最近发现KCC2过度表达在ovo中减少雏鸡外周神经系统脉络膜神经元的神经支配(刘等人，2006)也与树突发育缺陷相一致。

对多种制剂进行的研究表明，GABA能信号在大脑中很早就存在并发挥作用。在发育中的中枢神经系统的生发区，GABA作为自分泌/旁分泌兴奋信号，根据神经祖细胞的分化阶段，促进或抑制细胞增殖(LoTurco等人，1995年;Haydar等人，2000年;Liu等人，2005年). 在本研究中，我们没有观察到增殖区或皮层中表达EGFP或KCC2/EGFP的神经元数量之间的差异。特别是在E19，当几乎所有细胞都位于VZ/SVZ中时(图2)EGFP动物每节转染细胞总数为343±64，KCC2/EGFP胚胎为300±76。此外，在P6，当几乎所有细胞都到达CP时(图2)对照组EGFP动物每节转染细胞总数为139±77，KCC2/EGFP胚胎为193±48。因此，GABA刺激可能在调节皮质祖细胞增殖中不起重要作用。然而，我们注意到，由于心室内注射载体的数量以及电穿孔过程中电极的放置发生了变化，因此很难在每个胚胎中持续转染相同数量的细胞。因此，本方法可能不是检测EGFP和KCC2/EGFP表达细胞增殖差异的最佳方法。

GABA作为一种兴奋性营养信号，在皮质片或分离细胞培养物中促进或抑制围生期神经元的迁移，这取决于细胞的固有特性和细胞环境(Behar等人，1996年,1998,2000,2001). 然而，体内使用遗传模型的研究未能证实兴奋性GABA在神经元迁移中的作用。例如，在GAD65/67双敲除小鼠（其大脑皮层中GABA水平仅为正常水平的0.02%）中，大脑皮层的大小或分层模式没有明显缺陷(Ji等人，1999年). 在目前的工作中，我们直接表明消除GABA和其他激活Cl的递质的兴奋作用−传导性（如甘氨酸和牛磺酸）不影响发育中皮层神经元亚群的迁移体内值得注意的是，我们没有发现E21转染EGFP或KCC2/EGFP的迁移细胞的形态有任何显著差异。然而，由于我们在E17–E18处电穿孔神经前体细胞，这一过程只会导致体感皮层第II/III层锥体神经元的过度表达，因此我们不能排除兴奋性GABA对E17–E18之前或之后出生的神经元迁移的潜在影响(Hatanaka等人，2004年)或在不同的位置（例如神经节隆起）(Lopez-Bendito等人，2006年). 此外，因为KCC2的过早表达会影响Cl−梯度，因此仅修改作用于Cl的传送器的活性−-依赖电导，我们不能排除GABA通过代谢型GABA影响神经元迁移的可能性B类受体信号。

除了GABA的阶段性激活A类在突触传递过程中的受体，最近的研究揭示了强直GABA作用的存在，其特征是缓慢的时间过程和GABA的长时间激活A类通道(Farrant和Nusser，2005年). 产生滋补作用的GABA的来源是什么？许多发育中的神经祖细胞在分化的不同阶段产生和释放GABA(Verney，2003年). 对大鼠胚胎的免疫组织化学研究表明，早在突触发生之前就存在含有GABA的过程和细胞(兰黛等人，1986年;Marin-Padilla，1998年). 随着更多中间神经元迁移到皮层，GABA阳性细胞数量增加(Lavdas等人，1999年)通过E16扩散到皮层(Lauder等人，1986年). 有趣的是，发育中的神经组织富含GABA(贝尼特斯·迪亚兹等人，2003年)，可以通过未成熟的血脑屏障循环提供(Engelhardt，2003年)以及通过不成熟的摄取机制对分泌的GABA进行低效清除(Demarque等人，2002年). 我们的结果显示GAD65/67染色阳性的细胞和过程的丰度与现有文献一致。

持续存在内源性分泌的GABA可能为突触形成前的营养功能提供强直兴奋性驱动(欧文斯和克里格斯坦，2002年). 在这里，我们表明，发育中皮层中的内源性GABA通过激活GABA而对发育中皮层神经元进行张力去极化A类受体。当阶段性兴奋活动不起作用时，紧张性GABA诱导的兴奋可能在发育中的皮层中构成主要的去极化驱动，并可能产生巨大的去极化电位，在发育中神经组织中传播(Ben-Ari，2002年). GABA对皮层神经元形态成熟的影响似乎主要存在于促进动作电位放电的去极化中，因为神经元形态成熟受到K的过度表达的损害红外，由于静息膜电位更负，从而降低了放电速度。值得注意的是，K红外-表达细胞数量少于KCC2/EGFP表达神经元(图5克,​,77（f）). 我们将此归因于KCC2表达，通过改变E类氯至低于细胞静息电位的值，完全消除GABA介导的兴奋并将兴奋转化为抑制，而K红外表达仅通过超极化膜电位降低细胞的兴奋性，从而仅降低而不是消除GABA介导的兴奋性。

在这项研究中，我们发现皮层神经元在早期发育过程中适当的形态成熟体内关键取决于GABA的兴奋作用。因为树突状成熟对建立突触接触至关重要，而突触成熟也受神经元活动的调节(Hartman等人，2006年;沈等，2006)，确定早期发育过程中的兴奋性GABA作用是否也影响突触成熟和回路形成将很有意义体内与成年海马中新生颗粒细胞相似(Ge等人，2006年;Hartman等人，2006年). 这种早期的兴奋性GABA动作可能对成熟大脑神经回路的形成和功能产生巨大影响。最后，我们的数据表明，在早期发育过程中影响兴奋性GABA作用的药物或侮辱可能对大脑皮层的结构和功能发育产生深刻的致畸后果，可能导致诸如胎儿酒精综合征、孤独症、儿童精神分裂症、，以及其他与GABA能系统有关的早发性疾病。

脚注

这项工作得到了国家卫生研究院拨款NS36999的支持。H.F.得到了瑞士国家科学基金会的部分资助。我们感谢神经科学研究所（中国上海）的Y.-x.Diing和x.-b.Yuan向我们介绍子宫内电穿孔，C.Mouri和J.Jou提供数据分析帮助，M.Shelley提供手术帮助。

工具书类

  • Asada H、Kawamura Y、Maruyama K、Kume H、Ding RG、Kanbara N、Kuzume H、Sanbo M、Yagi T、Obata K。在缺乏谷氨酸脱羧酶67-kDa亚型的小鼠中，腭裂和大脑γ-氨基丁酸减少。美国国家科学院程序。1997;94:6496–6499. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Barbin G，Pollard H，Gaiarsa JL，Ben Ari Y.GABAA受体参与培养海马神经元的生长。神经科学快报。1993;152:150–154.[公共医学][谷歌学者]
  • Behar TN、Li YX、Tran HT、Ma W、Dunlap V、Scott C、Barker JL。GABA通过钙依赖机制刺激胚胎皮层神经元的趋化性和趋化性。神经科学杂志。1996;16:1808–1818. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Behar TN、Schaffner AE、Scott CA、O'Connell C、Barker JL。皮质板和心室区细胞对GABA作为迁移刺激的不同反应。神经科学杂志。1998;18:6378–6387. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Behar TN、Scott CA、Greene CL、Wen X、Smith SV、Maric D、Liu QY、Colton CA、Barker JL。作用于NMDA受体的谷氨酸刺激胚胎皮层神经元迁移。神经科学杂志。1999;19:4449–4461. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Behar TN、Schaffner AE、Scott CA、Greene CL、Barker JL。GABA受体拮抗剂调节胚胎大鼠皮层切片培养中有丝分裂后细胞的迁移。大脑皮层。2000;10:899–909.[公共医学][谷歌学者]
  • Behar TN、Smith SV、Kennedy RT、McKenzie JM、Maric I、Barker JL。GABA（B）受体介导迁移胚胎皮层细胞的运动信号。大脑皮层。2001;11:744–753.[公共医学][谷歌学者]
  • Ben-Ari Y.GABA在发育过程中的兴奋作用：后天培养的本质。Nat Rev神经科学。2002;三:728–739.[公共医学][谷歌学者]
  • Benitez-Diaz P、Miranda-Contreras L、Mendoza-Briceno RV、Pena-Contreras Z、Palacios-Pru E.小鼠顶叶皮层氨基酸神经递质的出生前和出生后含量。神经科学开发。2003;25:366–374.[公共医学][谷歌学者]
  • Borodinsky LN、O’Leary D、Neale JH、Vicini S、Coso OA、Fiszman ML。GABA诱导的小脑颗粒细胞突起生长是通过GABA（A）受体激活、钙内流以及CaMKII和erk1/2通路介导的。神经化学杂志。2003;84:1411–1420.[公共医学][谷歌学者]
  • Clayton GH，Owens GC，Wolff JS，Smith RL。大鼠新皮质中阳离子-Cl-协同转运蛋白表达的个体发生。大脑研究开发大脑研究。1998;109:281–292.[公共医学][谷歌学者]
  • DeFazio RA、Keros S、Quick MW、Hablitz JJ。钾偶联氯离子共转运控制大鼠新皮质锥体神经元的细胞内氯离子。神经科学杂志。2000;20:8069–8076. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Deisseroth K、Singla S、Toda H、Monje M、Palmer TD、Malenka RC。成人神经干/祖细胞中的兴奋-神经发生耦合。神经元。2004;42:535–552.[公共医学][谷歌学者]
  • Dellovade TL、Davis AM、Ferguson C、Sieghart W、Homanics GE、Tobet SA。GABA影响下丘脑腹内侧核的发育。神经生物学杂志。2001;49:264–276.[公共医学][谷歌学者]
  • Demarque M、Represa A、Becq H、Khalilov I、Ben Ari Y、Aniksztejn L.突触形成前通过Ca2+和SNARE诱导的GABA和谷氨酸依赖性释放实现细胞间旁分泌通讯。神经元。2002;36:1051–1061.[公共医学][谷歌学者]
  • Engelhardt B.血脑屏障的发展。细胞组织研究。2003;314:119–129.[公共医学][谷歌学者]
  • Farrant M，Nusser Z。关于抑制主题的变体：GABA（A）受体的时相和紧张激活。Nat Rev神经科学。2005;6:215–229.[公共医学][谷歌学者]
  • Fiumelli H，Cancedda L，Poo MM。通过突触后Ca2+依赖性调节KCC2功能，通过活动调节GABA能传递。神经元。2005;48:773–786.[公共医学][谷歌学者]
  • Flint AC，Liu X，Kriegstein AR。新皮质发育早期的非突触甘氨酸受体激活。神经元。1998;20:43–53.[公共医学][谷歌学者]
  • Ge S、Goh EL、Sailor KA、Kitabatake Y、Ming GL、Song H。GABA调节成人大脑中新生神经元的突触整合。自然。2006;439:589–593. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hartman KN，Pal SK，Burrone J，Murthy VN。海马神经元抑制性突触传递的活性依赖性调节。自然神经科学。2006;9:642–649.[公共医学][谷歌学者]
  • Hatanaka Y、Hisanaga S、Heizmann CW、Murakami F.来自皮层脑室区的早期和晚期神经元的独特迁移行为。《计算机神经学杂志》。2004;479:1–14.[公共医学][谷歌学者]
  • Haydar TF，Wang F，Schwartz ML，Rakic P.新皮质心室和心室下区增殖的差异调节。神经科学杂志。2000;20:5764–5774. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Heinen K、Baker RE、Spijker S、Rosahl T、van Pelt J、Brussaard AB。GABAA受体α1亚单位敲除小鼠树突状棘成熟受损。神经科学。2003;122:699–705.[公共医学][谷歌学者]
  • Homanics GE、Delorey TM、Firestone LL、Quinlan JJ、Handforth A、Harrison NL、Krasowski MD、Rick CE、Korpi ER、Makela R、Brilliant MH、Hagiwara N、Ferguson C、Snyder K、Olsen RW。缺乏γ-氨基丁酸A型受体β3亚基的小鼠出现癫痫、腭裂和过敏行为。美国国家科学院程序。1997;94:4143–4148. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hussy N，Deleuze C，Pantaloni A，Desarmenien MG，Moos F.牛磺酸对大鼠视上大细胞神经元甘氨酸受体的兴奋作用：渗透调节中的可能作用。生理学杂志。1997;502:609–621. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ji F，Kanbara N，Obata K.GABA和缺乏谷氨酸脱羧酶两种亚型的胎鼠和新生鼠脑组织发生。神经科学研究。1999;33:187–194.[公共医学][谷歌学者]
  • Kash SF、Johnson RS、Tecott LH、Noebels JL、Mayfield RD、Hanahan D、Baekkeskov S.谷氨酸脱羧酶65-kDa亚型缺陷小鼠癫痫。美国国家科学院程序。1997;94:14060–14065. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kriegstein AR。构建电路：发育中新皮质的神经发生和迁移。癫痫。2005;46（补充7）：15–21。[公共医学][谷歌学者]
  • Kyrozis A，Reichling数据库。用禾本科菌素进行穿孔斑贴记录可避免细胞内氯化物浓度的人为变化。神经科学方法杂志。1995;57:27–35.[公共医学][谷歌学者]
  • Lauder JM、Han VK、Henderson P、Verdoorn T、Towle AC。大鼠脑中GABA能系统的出生前个体发育：免疫细胞化学研究。神经科学。1986;19:465–493.[公共医学][谷歌学者]
  • Lavdas AA、Grigoriou M、Pachnis V、Parnavelas JG。内侧神经节隆起在发育中的大脑皮层中产生大量早期神经元。神经科学杂志。1999;19:7881–7888. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Liu X，Wang Q，Haydar TF，Bordey A.出生后脑室下区的非突触GABA信号控制GFAP表达祖细胞的增殖。自然神经科学。2005;8:1179–1187. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Liu Z，Neff RA，Berg DK.烟碱和GABA能信号传导的顺序相互作用指导神经元发育。科学。2006;314:1610–1613.[公共医学][谷歌学者]
  • Lopez-Bendito G、Cautinat A、Sanchez JA、Bielle F、Flames N、Garratt AN、Talmage DA、Role LW、Charnay P、Marin O、Garel S。切向神经元迁移控制轴突导向：神经调节蛋白-1在丘脑皮层轴突导航中的作用。单元格。2006;125:127–142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • LoTurco JJ、Owens DF、Heath MJ、Davis MB、Kriegstein AR。GABA和谷氨酸使皮层祖细胞去极化并抑制DNA合成。神经元。1995;15:1287–1298.[公共医学][谷歌学者]
  • Maric D、Liu QY、Maric I、Chaudry S、Chang YH、Smith SV、Sieghart W、Fritschy JM、Barker JL。GABA表达主导胚胎大鼠新皮质的神经元谱系进展，并通过GABA促进神经突起生长A类自身受体/Cl−频道。神经科学杂志。2001;21:2343–2360. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Marin-Padilla M.Cajal-Retzius细胞和新皮质的发育。《神经科学趋势》。1998;21:64–71.[公共医学][谷歌学者]
  • Marty S、Berninger B、Carroll P、Thoenen H.GABA能刺激通过调节脑源性神经营养因子调节海马中间神经元的表型。神经元。1996;16:565–570.[公共医学][谷歌学者]
  • Meijering E、Jacob M、Sarria JC、Steiner P、Hirling H、Unser M。荧光显微镜图像中神经突追踪和分析工具的设计和验证。细胞计量学A。2004;58:167–176.[公共医学][谷歌学者]
  • Ming GL，Song H.哺乳动物中枢神经系统的成年神经发生。《神经科学年鉴》。2005;28:223–250.[公共医学][谷歌学者]
  • Overstreet WL，Bromberg DA，Bensen AL，Westbrook GL.齿状回新生神经元的GABA能信号。神经生理学杂志。2005;94:4528–4532.[公共医学][谷歌学者]
  • Overstreet-Wadge LS，Westbrook GL.成年颗粒细胞的功能成熟。希波坎普斯。2006;16:208–215.[公共医学][谷歌学者]
  • Overstreet-Wadge LS，Bensen AL，Westbrook GL。齿状回成年颗粒细胞发育延迟。神经科学杂志。2006;26:2326–2334. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Owens DF，Kriegstein AR。GABA是否比突触抑制更重要？Nat Rev神经科学。2002;三:715–727.[公共医学][谷歌学者]
  • Owens DF、Boyce LH、Davis MB、Kriegstein AR。通过革兰菌素穿孔贴片记录和钙成像证明胚胎和新生儿皮质切片中的兴奋性GABA反应。神经科学杂志。1996;16:6414–6423. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Represa A，Ben-Ari Y.GABA对神经元发育的营养作用。《神经科学趋势》。2005;28:278–283.[公共医学][谷歌学者]
  • Reynolds A，Mercado A，Mount DB，Drapeau P.氯化钾联合转运蛋白2在斑马鱼胚胎中的表达。Soc神经科学文摘。2004;30:401–13. [谷歌学者]
  • Rivera C、Voipio J、Payne JA、Ruusuvuori E、Lahtinen H、Lamsa K、Pirvola U、Saarma M、Kaila K。K+/Cl-共转运体KCC2在神经元成熟过程中使GABA超极化。自然。1999;397:251–255.[公共医学][谷歌学者]
  • Saito T，Nakatsuji N.使用体内电穿孔将有效的基因转移到胚胎小鼠大脑中。开发生物。2001;240:237–246.[公共医学][谷歌学者]
  • 沈伟，吴斌，张泽，窦毅，饶志瑞，陈义瑞，段S.突触前cdc42信号介导的活性诱导突触快速成熟。神经元。2006;50:401–414.[公共医学][谷歌学者]
  • Song H，Kempermann G，Overstreet WL，Zhao C，Schinder AF，Bischofberger J.成年哺乳动物大脑中的新神经元：突触发生和功能整合。神经科学杂志。2005;25:10366–10368. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tapia JC、Mentis GZ、Navarrete R、Nualart F、Figueroa E、Sanchez A、Aguayo LG。发育中脊髓神经元中甘氨酸和GABA（A）受体的早期表达。对神经突起生长的影响。神经科学。2001;108:493–506.[公共医学][谷歌学者]
  • Tozuka Y、Fukuda S、Namba T、Seki T、Hisatsune T。GABA能量激发促进成年海马祖细胞的神经元分化。神经元。2005;47:803–815.[公共医学][谷歌学者]
  • Verney C.人类端脑早期发育中单胺类和GABA的表型表达，短暂或非短暂。神经病学杂志。2003;26:283–292.[公共医学][谷歌学者]
文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会