星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的转录组数据库：了解大脑发育和功能的新资源

CNS细胞类型的基因表达谱

从纯化的细胞类型制备的总RNA用于生成标记的cRNA，使用带有poly（a）引物的两步线性扩增协议扩增mRNA的3′端。将标记的cRNA与Affymetrix Mouse 430 2.0阵列杂交，该阵列包含与mRNA转录物3′端互补的寡核苷酸探针集（3′阵列）；每个阵列包含45037个寡核苷酸探针组，代表20832个独特的基因。此外，使用随机引物扩增所有RNA，通过一步线性扩增协议生成标记cDNA。将标记cDNA与Affymetrix Mouse Exon 1.0 ST阵列杂交，寡核苷酸探针组与整个mRNA分子（外显子阵列）的区域互补，代表定义了转录水平探针选择和表达指数的17213个基因(Xing等人，2006年). 我们使用MAS 5.0算法对3′-阵列生成的数据进行了主要分析，以生成表达式值和缺席/在场（A/P）调用，并使用dChip、SAM和Bioconductor软件进行统计分析和聚类。

对代表同一纯化细胞类型和发育阶段的生物复制品的样本进行分组，然后我们创建了至少在一个细胞群中一致表达的探针集主列表（见材料和方法）。这些20932个探针组代表了12416个独特的基因，这些基因在至少一种CNS细胞类型中显著表达。所有20932个表达探针组的表达式值主数据表见补充表S3（可从网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。我们的统计分析和聚类是根据这个筛选出的表达基因列表进行的。

纯化细胞类型样本的无监督分层聚类显示，星形胶质细胞、神经元和OL各有不同的基因表达模式。中的树状图图2显示了代表星形胶质细胞、神经元和OL的三个主要分支。在每种细胞类型中，样本根据其发育阶段进行聚类。聚类显示生物复制之间具有高度的重复性，并且在一种细胞类型内具有很强的相似性。细胞类型之间的相似性与星形胶质细胞、神经元和OL之间的巨大差异形成对比。有趣的是，星形胶质细胞和OLs的成对比较之间的相关性并不比这两种细胞类型与神经元的成对相关性强。考虑到这些成熟CNS细胞类型中每一种的高度专业化功能，它们的基因表达谱差异很大，并且每一种都代表一种同样独特的细胞类型，这是意料之中的事。

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图2。

纯化CNS细胞类型的树状图和样本聚类。来自不同发育阶段的高纯度CNS细胞类型样本的层次聚类显示出三个不同的聚类，分别代表星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。不同样本之间基因表达的相似性由树状图每个分支上的垂直距离表示。生物复制在样本中显示出最高程度的相关性，以短的垂直距离为代表。在每个细胞群体中，成熟和成熟样本（Astros P7、Astros P17、OLs、Myelin OLs）之间的基因表达比未成熟和成熟样品（Astro P1、Astro P7、OPCs、OLs）间的基因表达相关性更高。色条和样本标签描述了每种样本类型（绿色，星形胶质细胞；黄色，神经元；橙色-红色，OL谱系细胞；P，出生后的一天，用不同的色度表示；g，大脑皮层灰质星形胶质细胞，n，剩余内皮细胞耗尽的神经元样本）。

所有12416个表达基因的无监督分层基因聚类生成的热图显示了基因水平上的细胞型基因表达模式（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。几乎所有的基因都显示出星形胶质细胞、神经元和OLs之间的细胞类型聚类，许多基因也根据细胞的发育阶段进行聚类。这些基因簇在所有细胞类型中分布均匀，进一步证实了我们的发现，星形胶质细胞和OL之间的相似性并不比它们与神经元之间的相似。长期以来，星形胶质细胞和OL被归类为“胶质细胞”，以表明它们可能具有共同的特征和功能。虽然我们的数据没有解决星形胶质细胞和OL的共同谱系问题，但这些数据表明成熟星形胶质细胞与OL并不共享大量共同的“胶质”基因，并表明，分子定义的胶质细胞类型的概念在很大程度上是误导性的，因为所有三种成熟细胞类型都因其表达的基因而异。

神经细胞类型特异性基因的鉴定和验证

通过对星形胶质细胞、神经元和OL基因表达的定量比较，可以确定每种细胞类型中差异过度表达的所有基因。通过微阵列（SAM）的显著性分析（错误发现率（FDR）阈值<1%），所有基因至少富集了1.5倍，且具有统计学差异(Tusher等人，2001年)在补充表S4–S6中列出（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些基因包括2618个富含星形胶质细胞的基因、2036个富含神经元的基因和2228个富含OL的基因。根据先前建立的细胞型标记物的富集水平（补充表S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），富集20倍以上的基因被认为是细胞型特异性基因。排名前40位的星形胶质细胞、神经元和OL细胞类型特异性基因显示在图3前250个基因出现在补充图S3中（参见网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。正如预期的那样，前40个细胞类型特异性基因包括已建立的细胞类型特异标记，验证了我们的分离程序。然而，这些基因中的许多以前没有被描述为CNS中的细胞类型特异性基因，其功能作用尚不清楚。

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图3。

星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元特异性基因的表达。描述了星形胶质细胞（绿色条）、神经元（黄色条）和少突胶质细胞（红色条）表达的前40个细胞类型特异性基因。每个单独的基因表达水平都进行了标准化（参见材料和方法）并绘制在日志上₂色阶，蓝色代表低表达，红色代表高表达。褶皱富集度可根据测井曲线进行估算₂颜色条标度，例如，从中蓝色（−2）到红色（3）的变化表示表达水平的32倍差异。

我们将基于3′-阵列数据的前40个细胞类型特异性基因列表与我们的外显子阵列数据进行了比较，以确认这些基因的细胞类型特异性。我们首先使用Affymetrix提供的映射文件和NetAffx的手动查询，将来自3′阵列探针集（总共120个探针集）的前40个星形胶质细胞、神经元和OL特异性基因映射到小鼠外显子阵列转录簇。在120个3′-阵列探针组中，101个被明确地映射到由核心探针组表示的唯一外显子阵列基因标识符。在这101个基因中，根据外显子阵列表达指数，92（91%）个基因在其各自的细胞类型中至少富集了15倍，100（99%）个基因至少富集了5倍，最小外显子数组变化为3.9（补充表S7，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。除了验证3′阵列结果外，外显子阵列转录水平数据算法也进行了优化，以提供独立于不同mRNA剪接形式的总体基因表达水平(Xing等人，2006年). 因此，当一个基因被外显子阵列数据证实时，这表明该基因是细胞类型特异性的，而与基因剪接无关。补充表S8中列出了17213个独立于剪接的基因的外显子阵列表达值的完整列表（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。利用外显子阵列数据确定细胞类型特异性基因剪接的其他分析正在进行中。使用不同标记方法和探针选择区域的外显子阵列结果为从3′-阵列中发现的CNS细胞类型特异性基因提供了有力的独立证据。

我们接下来表演就地杂交（ISH）以确认CNS中一些新的细胞型特异性基因(图4). 神经细胞高度富集的几个任意选择基因的ISH(图4 A–F，Nov、Tmem130和Brunol4）在所有三种情况下都证实了这些基因具有与神经元特异性表达一致的表达模式，尽管神经元亚型之间的分布在基因之间有所不同，Nov表现出比Tmem130或Brunol4更受限制的皮层表达。类似地，在星形胶质细胞中高度富集的基因的ISH(图4 G–I型Ntsr2、Aldh1L1和Acsbg1）的表达模式与星形胶质细胞特异性表达一致，染色显示许多小细胞体和突起广泛分布于大脑皮层。OLs中高度富集的基因(图4 J–L型Fah2、Tmem125/6330530A05Rik和Gpr62）给出了与OL特异性表达一致的染色模式，染色主要局限于皮质内的白质和散在细胞。对于我们确定为具有上述背景ISH的细胞类型特异性的基因，我们的分析表明，使用我们的阵列数据预测的细胞类型特异性与使用ISH看到的区域分布之间存在极好的一致性。

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图4。

基因表达数据验证就地杂交。A–C，冠状脑切片显示阵列数据确定的具有特定神经元表达的基因的ISH：A类，11月；B类，Tmem130；C，布鲁诺4。D–L型，中轮廓区域对应的高倍图像A类显示海马、胼胝体（cc）和上覆皮层。D–F型，阵列数据确定的基因具有特定的神经元表达，在海马体和皮层中显示表达：D类，11月；E类，Tmem130；F类，布鲁诺4。G–I型，通过阵列数据鉴定为具有星形胶质细胞富集表达的基因，在整个白质和灰质中显示纤维状阳性细胞：G公司，Ntsr2；H（H），Aldh1L1；我，Acsbg1。J–L型阵列数据确定的具有特定OL表达的基因的ISH，显示胼胝体中的白质表达和上覆皮层中偶尔的阳性细胞：J型，传真2小时；K（K），Tmem125/6330530A05Rik；我，Gpr62。所有ISH均在P17小鼠大脑上进行。比例尺：A–C，2毫米；D–L型，200微米。

由于我们的数据库中列出了比ISH自己检测的更多的细胞型富集基因，我们接下来将我们的发现与Allen Brain Atlas（ABA）项目的结果进行了比较，该项目是一个综合ISH数据库，用于确定成年鼠脑中约20000个基因的解剖表达模式。ABA信息学过滤器识别具有相似空间分布模式的基因。使用ISH模式对这些过滤器进行训练，以获得已建立的细胞类型特异性标记，从而预测新的细胞类型富集基因(Lein等人，2007年). 我们将44个富含星形胶质细胞的基因、78个富含OL的基因和69个富含神经元的基因的ABA列表与每个细胞类型中mRNA水平的定量3′阵列测定进行了比较。由ABA识别的每个基因的星形胶质细胞、OL和神经元基因表达值的热图如补充图S4–S6所示（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。在191个ABA细胞类型特异性基因中，在我们的3′阵列分析中，178个（93%）在纯化的CNS细胞中表达。在这些表达基因中，141个（79%）的细胞型富集倍数大于1.5倍，106个（60%）的细胞类型富集倍数大于4倍，30个（17%）的基因在ABA鉴定的相同细胞类型中富集倍数大于20倍（细胞类型特异性）。这表明ABA过滤器和我们的数据分析之间的总体一致性，尽管我们的分析表明，由ABA鉴定的23（13%）个基因实际上富集在另一种细胞类型中。

这两个数据集之间的比较显示了高度一致性，并且ABA如何代表一种资源，以补充我们的数据库中每个主要CNS细胞类型的全基因组基因表达值。它还显示了全基因组定量基因表达分析的威力。尽管ABA能够在几乎80%的所选基因中确定正确的细胞型富集基因表达模式，但这些基因中很少有代表大多数细胞型特异性基因。此外，我们的数据库还确定了更多细胞类型丰富的基因，包括不同细胞类型和不同发育阶段的定量基因富集水平。

Aldh1L1是一种新的星形细胞特异性标记物

为了表征新的星形细胞特异性标记物，我们检查了我们的基因表达数据库，以确定mRNA表达水平最高的星形细胞特异性基因、全脑范围内ISH标记模式最广的基因以及预计在整个细胞（即不限于细胞亚室）中表达的蛋白质。其中一个符合这些标准的基因是醛脱氢酶1家族成员L1（Aldh1L1）基因，也称为10-甲酰四氢叶酸脱氢酶（FDH）(库克等人，1991年;Anthony和Heintz，2007年). 该基因的ISH表明其mRNA在整个CNS中的表达模式与泛天冬氨酸细胞的表达模式一致(图4 H（H）)之前已经证明Aldh1L1蛋白在成年大鼠星形胶质细胞中表达(Neymeyer等人，1997年). 用Aldh1L1特异性多克隆抗体进行免疫组织化学染色，显示了高度分支的星形胶质细胞形态，包括星形胶质细胞胞体及其广泛的突起。相反，GFAP抗体主要标记一些星形胶质细胞的厚主突(图5 A–C). 所有GFAP阳性的细胞也标记有Aldh1L1，而Aldh1L2强烈标记了更多的星形胶质细胞。此外，Aldh1L1 mRNA在整个大脑中的表达更为广泛，而GFAP在白质中的表达则更为显著（参见艾伦脑图谱）（补充图S7，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。Aldh1L1和神经元标记物（微管蛋白）、OLs（CC1和MBP）和OPCs（NG2）的双重标记表明Aldh1L1不标记其他脑细胞类型(图5 D–F型).总之，这些发现确定Aldh1L1是一种高度、广泛和特异性表达的星形胶质细胞基因，并表明它是一种有用的星形细胞特异性标记物。

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图5。

Aldh1L1是一种特异性全细胞标记物。A–F，P15大鼠皮层的免疫组织化学染色显示Aldh1L1是一种细胞型特异性泛天冬氨酸细胞标记物。A–C大鼠皮层Aldh1L1（红色）和GFAP（绿色）染色。A类，Aldh1L1标记皮层中星形胶质细胞的细胞体和广泛的过程。B类GFAP标记星形胶质细胞中间丝细胞骨架，但不是Aldh1L1能够标记的精细过程。C，GFAP标记一组星形胶质细胞：GFAP标记的细胞也呈Aldh1L1阳性（白色箭头），而Aldh1L2标记的许多星形胶质细胞未被GFAP标记（黑色箭头）。D–F型，Aldh1L1不标记神经元(D类，Tuj1），OL(E类、MBP+CC1）或OPC(F类，NG2）。G–I型、合并(我)Aldh1L1免疫染色(G公司)和强烈的BAC-Aldh1L1-EGFP荧光(H（H）)在Aldh1L1-EGFP转基因小鼠皮层中发现，所有表达EGFP转基因的细胞也表达内源性Aldh1L2蛋白。比例尺：A–F，40微米；G–I型，60微米。

GENSAT项目已经生产出BAC Aldh1L1-EGFP小鼠(海因茨，2004). Aldh1L1在该小鼠整个中枢神经系统的扩散表达模式与泛天冬氨酸细胞的表达一致（补充图S7，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。我们分析了该小鼠系的脑冰冻切片，以进一步验证Aldh1L1的表达模式，并确定该小鼠是否忠实地报告星形胶质细胞中特异性EGFP。如所示图5 G–I型我们发现，在整个大脑中，Aldh1L1免疫组织化学染色与EGFP共定位，证实BAC-Aldh1L1-EGFP转基因以与内源性Aldh1L蛋白相同的星形细胞特异性模式驱动EGFP表达。此外，EGFP扩散到细胞核，使得在这些小鼠中识别星形胶质细胞细胞体特别容易。然后，我们从Aldh1L1-EGFP小鼠制备细胞悬液，用O4单克隆抗体对OLs进行免疫染色，并对FACS进行分析，以确定Aldh1L1-EGFP小鼠是否有助于FACS纯化星形胶质细胞。补充图S8（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）显示出EGFP阳性星形胶质细胞和剩余EGFP阴性细胞之间的良好分离。此外，O4-阳性OLs为EGFP阴性，表明Aldh1L1-EGFP小鼠比S100β小鼠更适合于FACS纯化星形胶质细胞。这些数据表明，Aldh1L1蛋白由星形胶质细胞特异性表达，而不是由OLs或神经元表达，因此，Aldh1 L1是比GFAP更好的免疫组织化学星形胶质细胞标记物，因为它能更好地标记星形胶质细胞胞体和整个灰质和白质的过程。

我们已经确定的最特异的神经细胞类型标记已经提供给Neuromab项目(网址：http://www.neuromab.org)NINDS GENSAT项目和NIH Neuromouse Cre项目，以便神经科学界能够很快获得低成本、高质量的抗体和鼠系。

富含主要CNS细胞类型的典型途径分析

每种神经细胞类型优先表达的大量基因表明，星形胶质细胞、神经元和OL在许多基本信号和代谢途径上可能不同。为了更系统地确定每种CNS细胞类型中丰富的典型信号和代谢途径，我们使用了Ingenuity Systems的IPA工具。给定一个基因列表，IPA在其手工处理的典型路径数据库中对这些基因的富集进行统计测试。每个独立的IPA信号通路包括细胞外信号成分、细胞膜受体、下游效应器和转录因子，这些已被描述为与已发表的科学文献相互作用，每个通路通常包括30到100个或更多的单个基因。IPA代谢途径源自KEGG代谢途径(Kanehisa等人，2006年). 这些工具使我们能够确定在每个给定细胞类型中显著富集的基因中代表的顶级典型信号和代谢途径（补充表S4–S6，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。表1列出信号通路(A–C)和代谢途径(D–F型)在每种细胞类型中富集第页< 0.05. 这些丰富的信号通路可能受到细胞间相互作用的影响，受到疾病过程的干扰，并受到药物的影响而产生生理效应。我们在星形胶质细胞中观察到12条显著富集的代谢途径，但在OL和神经元中只有3条，这表明星形胶质细胞在中枢神经系统的能量代谢产物和氨基酸生成中发挥着重要作用（见讨论）。

表1。

灵巧途径分析确定了细胞型富集途径

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典型信号通路（A–C）和代谢通路（D–F）在星形胶质细胞、OL和神经元中统计丰富第页<0.05（5.00E-02）。富含星形胶质细胞、OL和神经元的基因（补充表S4–S6，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料）与Ingenuity的72条典型信号通路和80条代谢通路数据库进行了比较。路径丰富于第页<0.001（1.00E-03）被视为高度显著。

星形胶质细胞表达的基因分析

通过分析急性分离、高度纯化的星形胶质细胞，我们对其mRNA表达的全基因组分析首次真正全面地观察了发育和成熟小鼠中枢神经系统中星形胶质细胞表达的基因，为星形胶质细胞的规格、发育、功能、，以及与血管和突触相互作用的信号。我们的分析确定了许多转录因子、信号转导跨膜受体以及星形胶质细胞特异性高表达的分泌蛋白（补充表S9-S13，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。星形胶质细胞的发育不如神经元和OL的发育好。我们确定了星形胶质细胞中高度富集的DNA结合蛋白，其中一些含量非常高（补充表S10，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些基因包括转录激活因子和阻遏因子，并且可能包含许多指定星形胶质细胞基因表达的关键基因。因为目前在哺乳动物大脑中没有已知的星形细胞特异性转录因子[尽管在限制性脊髓结构域中已有描述(Muroyama等人，2005年)]这些富含星形胶质细胞的基因代表了第一个星形胶质细胞特异性转录因子。尽管只有三个基因（Rfx4、Pbxip1和Gli3）符合我们的星形胶质细胞特异性标准（至少是星形胶质细胞富集的20倍），但许多基因富含星形胶质细胞。许多其他转录因子，如Sox2、Pax6、Id1和Id3，被认为在祖细胞中富集(Ramalho-Santos等人，2002年)，在星形胶质细胞中以惊人的高水平表达。这些发现提出了一个长期存在的问题，即大多数成年星形胶质细胞是终末分化的，还是在适当的情况下能够分裂，甚至恢复成干细胞样行为(Doetsch等人，1999年).

据报道，一些受体对早期星形胶质细胞的发育很重要，如Bmpr1a、Bmpr1 b、Bmpr2、Notch1/2/3和Fgfr3(Song和Ghosh，2004年)在我们发育和成熟的星形胶质细胞中高度表达和丰富（补充表S11，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。Sonic Hedgehog受体补丁型（Ptch1）和Shh信号转导平滑型（Smo）均富含星形胶质细胞及其下游转录介质Gli2和Gli3(Ruiz i Altaba等人，2002年;Palma等人，2005年). Fzzled同源物2（Fzd2）是Wnt受体，高表达，是星形胶质细胞最特异的基因之一。以这些受体为特征的信号通路，如TGF-β（BMP）、Notch、Sonic Hedgehog和Wnt/β-catenin信号通路，经IPA测定均在星形胶质细胞中显著富集(表1 A类). 有趣的是，尽管下游Notch靶基因在OPC成熟为髓鞘化OL时关闭，但随着星形胶质细胞的成熟，Notch靶蛋白基因仍然很高，有时还会增加。虽然Notch信号传导与诱导神经前体细胞发育为星形胶质细胞有关(Tanigaki等人，2001年)这些发现表明Notch信号在维持星形胶质细胞命运中的作用更持久。

我们鉴定了星形胶质细胞对吞噬和吞噬的几种高度保守的完整分子途径的特异性高表达(表2). 一种是细胞死亡异常（ced）途径，该途径首先被确定为具有缺陷的凋亡细胞吞噬功能秀丽线虫也显示在轴突修剪中起作用果蝇属(Zhou等人，2004年;Awasaki等人，2006年). ced基因形成两条平行的途径，导致ced-10（Rac1）激活和吞噬。第一条通路包含基因ced-1（Megf10，果蝇属draper）、ced-7（Abca1）和ced-6（Gulp1），所有这些都富含星形胶质细胞(表2). ced-1的另一个同源物是Lrp1（cd91），它在星形胶质细胞中也高度表达和富集，是ApoE的受体，ApoE是一种与家族性阿尔茨海默病有关的基因(Corder等人，1993年). 第二条平行的ced通路是ced-2（Crk）、ced-5（Dock1）、ced-12（Elmo）复合物，所有这些基因也在星形胶质细胞中高水平表达，尽管没有ced-7/ced-6/ced-1通路那么丰富(表2). 其他明确的吞噬途径的分子成分，受体酪氨酸激酶（Mertk和Axl）和αvβ5整合素途径(Finnemann和Nandrot，2006年)，也被发现由星形胶质细胞表达。这些都是识别受体（见讨论），参与吞噬被特定调理素包裹的碎片。我们还鉴定了其同源配体，包括Mfge8和Gas6，富含星形胶质细胞。Mfge8是少数几个编码分泌蛋白的高表达星形胶质细胞基因之一，载脂蛋白E也是如此，这两种基因至少部分起调理蛋白的作用。综上所述，这些发现强烈表明星形胶质细胞在吞噬作用中的发育和成熟起着重要作用。

少突胶质细胞表达的基因分析

OLs特异性基因列表表明，与富含星形胶质细胞和神经元的基因列表相比，OLs中的许多细胞类型特异性基因之前都有特征。共鉴定出50个细胞类型特异性基因（>20倍富集）。在这些基因中，有16个是先前确定的OL基因，如髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白（Mobp）、转铁蛋白（Trf）和Claudin 11（Cldn11）。这50个OL特异性基因中有一半以上与DAVID数据库中的术语“膜”有关(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)，考虑到OL在髓鞘膜形成中的高度特异性功能，也许并不令人惊讶。这些包括先前描述的OL谱系标记，如MOG、髓磷脂和淋巴细胞蛋白（Mal）、脂质代谢和合成所需的酶，如半乳糖-3-o-硫转移酶1（Gal3st1）和UDP半乳糖基转移酶8a（Ugt8a），以及功能未知的新型跨膜蛋白，如跨膜蛋白10（Tmem10/opalin）、Tmem125/6330A05Rik和生态病毒整合位点2a（Evi2a）（补充表S5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。基因模型98是一种可能的转录因子（B.Emery和B.a.Barres，未发表的观察结果），被OLs鉴定为最广泛和最特异表达的基因之一，这已被ABA中的ISH所证实。令人惊讶的是，APP、APLP1、APLP2及其处理相关基因（Tace除外）在OLs中高度表达，并且几乎所有这些基因在OLs的表达都高于神经元。例如，β位APP-裂解酶2（Bace2）在OLs中的富集倍数为12倍，并且随着OLs的分化而被强烈上调(图6我们观察到，随着OLs的成熟，整个Wnt平面极性通路被高度激活，这表明该通路在Ranvier结和偏执组织中起着重要作用。我们还鉴定了许多富含OL的跨膜受体、转录因子和分泌蛋白，它们在OL生物学中的具体作用尚不清楚。代谢差异包括用于合成肌酸（Gamt和Gatm）和肉碱的酶的优先表达（补充表S14，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

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图6。

星形胶质细胞和少突胶质细胞发育过程中基因上调和下调。星形胶质细胞发育过程中下调最多的60个基因(A类，浅绿色条）和OL开发(B类和星形胶质细胞发育过程中最上调的前60个基因(C，深绿色条）和OL开发(D类，红色条）。基因绘制在热图上，以说明不同发育阶段所有CNS细胞类型的基因表达模式。将每种细胞类型的单个基因表达水平标准化为年龄平均的星形胶质细胞表达(A类,C)和年龄平均OL表达(B类,D类). 标准化值绘制在日志上₂色阶，蓝色代表低表达，红色代表高表达。褶皱富集度可根据测井曲线进行估算₂颜色条刻度。例如，从浅蓝色（-1）到中红色（2）的变化表示表达水平的八倍差异。注意，尽管在发育过程中很少有基因强烈下调(A类,B类)以细胞类型特异的模式表达，大多数基因在发育过程中强烈上调(C,D类)以细胞类型特定的模式表达。

神经元表达基因的分析

由于区域和亚型神经元的高度异质性，泛神经标记物的识别长期以来一直存在问题。我们的发现，结合ABA上的ISH模式，表明广泛使用的神经元标记物，如Map2、Tau、HuC/Elav3、Gap43、Prpc和电压依赖性钠通道，并不是神经元特异性表达的，许多特定的神经元基因，如Eno3/NSE、Camk2和神经丝链L、M、，和H仅由神经元子集表达。正如我们的资料所证实的那样，许多突触囊泡蛋白，如syntaptotagmin I（Syt1），在神经元中特异而广泛地表达，但由于它们的突触积累，在冰冻切片中对神经元胞体的鉴定没有用处。我们确定的在我们的图谱中高度、特异性和广泛表达的神经元基因是stathmin-like-2（参见ABA），也称为Scg10。我们还鉴定了Brunol4、Brunol5和Brunol6，它们是RNA结合蛋白Bruno家族的成员(Good等人，2000年)，因为它富含神经元（尽管它们绝不是泛神经元）。这个基因家族与发育调控的选择性剪接有关(Ladd等人，2001年)和Brunol6之前被ISH证明是神经元特异性的(McKee等人，2005年). 布鲁诺家族三个成员的强烈神经元富集表明，这些基因是神经元特异性基因剪接的重要因素。最后，我们鉴定了几种高表达的神经元分泌蛋白，包括神经调节蛋白3和Nov/Ccn3。后者是结缔组织生长因子家族的成员，在大脑皮层中有强烈表达(图4 A类). Nov是一种富含半胱氨酸的分泌蛋白，被认为具有生长因子的功能(Liu等人，1999年)11月的一个拟议受体是Ddr1(Das等人，2006年)我们的数据表明，星形胶质细胞和OL在发育中高度表达，但不成熟。

星形胶质细胞和少突胶质细胞发育过程中的基因表达变化

接下来，我们通过比较发育中（P7–P8）和成熟（P17）星形胶质细胞，以及比较OPCs和髓鞘化OLs（MOG⁺OLs）（补充表S15–S18，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。星形胶质细胞和OL发育过程中最上调和下调的前60个基因显示于图6前250位如补充图S9所示（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。P17和P30星形胶质细胞中的整体基因表达非常相似，星形胶质细胞发育过程中上调的基因并没有从P17继续变化到P30（补充图S2和S9，P30星形细胞列，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这表明星形胶质细胞大约在出生后14-21天获得成熟形态(Bushong等人，2004年)通过P17，他们也表达了成熟的基因表达谱，星形胶质细胞发育基本完成。

我们发现在星形胶质细胞和OL发育过程中几乎所有的基因都被强烈下调(图6 A、 B类)在中枢神经系统中由另一种细胞类型表达，60种细胞中只有11种（18%）富含星形胶质细胞，60种中只有3种（5%）在OL谱系中富集。这表明，下调最多的基因代表的是增殖和中枢神经系统发育所需的基因，而不是参与特定细胞类型发育过程的基因。相比之下，在星形胶质细胞发育过程中上调最强烈的基因中，60个中有46个（77%）富含星形胶质细胞，而在OL发育过程中几乎所有上调的基因中有58个（97%）富含OL。

星形胶质细胞发育过程中下调最多的基因中，有一半以上在OL发育过程中也下调，其中许多基因参与细胞周期，如丝裂原信号通路、细胞分裂周期调节蛋白、着丝粒蛋白和基因组复制蛋白。星形胶质细胞和OPC中一个典型的下调基因是母体胚胎亮氨酸拉链激酶（Melk），这是一种自我更新神经祖细胞的标记物，可促进增殖祖细胞的细胞周期(Nakano等人，2005年). Melk从P7到P17被下调了10倍，在所有P17星形胶质细胞和髓磷脂OL样本中被称为缺失。仔细观察星形胶质细胞中下调的前50个基因，可以发现类似的模式，在P17大脑皮层灰质星形胶质细胞中，50个基因中有48个（96%）低于表达阈值，这强烈表明P17使绝大多数皮层星形胶质细胞的细胞分裂完全衰老，正如之前所记录的那样。OPC不表达的特征明确的星形胶质细胞前体细胞标记物的一个例子是nestin，这是一种标记物，在发育期间和损伤后由放射状胶质细胞和星形胶质细胞表达，但不由正常成熟的星形细胞表达。Nestin在P1到P7的星形胶质细胞中下调了三倍，在P7到P17的星形细胞中又下调了四倍，在所有的P17星形胶质细胞样本中都不存在。星形胶质细胞发育过程中两个最下调的基因是无特征的DNA结合蛋白（Tcfcp2l1和Riken基因2310005P05，具有螺旋发夹状DNA-结合，1类蛋白结构域）。它们都富含星形胶质细胞（分别为13倍和5倍），并且不由OPCs表达，这表明它们在星形胶质细胞谱系发育中具有特殊作用。

星形胶质细胞发育过程中最强烈上调的基因之一是{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC055107”，“term_id”：“32766228”，“term_text”：“BC 055107“}}BC055107号，人类中的同源物称为Drr1/Tu3a/Fam107a。在中枢神经系统神经细胞类型中，Drr1是星形胶质细胞特异性的（星形胶质细胞富集21倍），是表达最高的基因之一。Drr1是一种具有核定位信号的144个氨基酸蛋白，被鉴定为多组织肿瘤中缺失的人类抑癌基因(Wang等人，2000年). 小鼠星形胶质细胞发育过程中Drr1的强烈上调，结合其作为肿瘤抑制因子的特性，强烈表明Drr1在维持细胞处于静止、不增殖状态方面具有功能性作用。在未来的研究中，该基因值得关注，以确定多态性或突变是否容易导致胶质母细胞瘤的易感性。

OPC分化过程中下调的基因通常由其他CNS细胞类型表达(图6 B类)表明与分化OL的标记物相比，OPC特异性标记物较少。这一趋势的例外包括两个成熟的OPC标记PDGFRα和NG2/Cspg4，但也包括一些特征不太明确的基因，如Matrilin-4（Matn4）、Numb蛋白X的配体（Lnx1）、蛋白激酶cGMP-依赖性（Prkg2）和含4的锌指BED结构域（Zbed4）。Zbed4是人类hAT家族的一员，可自我关联并作为细胞周期基因的转录激活剂(Yamashita等人，2007年). G蛋白偶联受体17（Gpr17）在发育中的OLs中强烈而特异地表达，到成年时似乎对成人OPC具有特异性。

由于OPC分为OL和Myelin OL（补充表S18、S19，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），在髓磷脂基因上调的同时，它们的基因图谱揭示了可能维持细胞骨架的细胞骨架和基质基因的显著下调，以及大量功能似乎是解聚细胞骨架的基因的强烈上调（如gelsolin）或者破坏细胞骨架（例如ephrin和semaphorin信号通路中的蛋白质），所有这些都可能是髓磷脂致密化所必需的。与MOG和体内髓鞘形成包括与偏执狂相关的基因以及Ranvier形成正常淋巴结所需的基因，如MAL、透明质酸和蛋白多糖链接蛋白2（Hapln2）、接触蛋白3（Cntn3）、Cntn2、Nkx6.2、Stathmin1（Stmn1）和RIKA330104H05（Ermin）。这些观察强烈表明，髓鞘形成的基因可能在不同的波中进行调节(Dugas等人，2006年)第一个参与神经纤维的包裹，第二个参与建立与Ranvier结形成和维持有关的细胞间连接。

新的细胞类型特异性标记的鉴定

需要改进中枢神经系统中的神经细胞类型标志物。由于区域和亚型神经元的高度异质性，泛神经元、星形胶质细胞和OL标记物的识别长期以来一直存在问题。特别是，目前星形胶质细胞的标记物不是在所有星形胶质细胞中都统一表达，就是不能完全标记星形胶质细胞胞体和所有过程。例如，GFAP是最广泛使用的星形胶质细胞标记物，优先在白质中表达，而不是灰质星形胶质细胞，并不标记所有过程(Bushong等人，2002年). 类似地，水通道蛋白4虽然具有高度的星形胶质细胞特异性，但定位于星形胶质细胞末端。连接蛋白43仅标记一些星形胶质细胞，也由内皮细胞表达，虽然S100β标记灰质和白质星形胶质细胞但它也标记OPC和OLs。

在这里，我们确定Aldh1L1是一个非常有用的新的星形细胞特异性标记。我们还发现，GENSAT Aldh1L1-EGFP BAC小鼠具有星形胶质细胞的荧光标记，该标记忠实地遵循星形胶质细胞特异性Aldh1L2表达模式，因此为发育中和成年小鼠大脑中星形胶质细胞可视化提供了一种优越的工具。考虑到Aldh1L1似乎由几乎所有的星形胶质细胞表达，而不是其他CNS细胞类型，Aldh1L2启动子可能是一个有用的工具，用于驱动Cre在星形胶质细胞中的特异性表达。根据其特定的表达模式，Pla2g7和Ascbg1也可能是有用的星形细胞特异性标记物。

以类似的方式，我们的数据集允许识别神经元和OL的许多合适标记。对于OLs，有许多髓磷脂基因，如MBP，长期以来一直是有用的标记物，但由于这些基因高度定位于髓磷脂，因此它们在涉及OL细胞体染色的定量研究中没有用处。我们已经确定了几个具有高度OL特异性的基因，包括Fa2h、Gpr62、Tmem125/63305A05Rik、基因模型98和Plekhh1，这些基因很有可能成为该谱系的改良标记。虽然许多基因的表达对神经元具有高度特异性，但通过ISH分析或与ABA交叉引用时，这些基因绝大多数显示出区域特异性。Stathmin-like-2（Scg10）是我们能够识别的最特异和最广泛表达的基因，这表明它适合作为泛神经标记物。

星形胶质细胞转录组为星形胶质细胞的发育和功能提供了许多新线索

我们已经鉴定出的星形胶质细胞转录组为大脑中主要细胞类型之间代谢劳动分工的戏剧性提供了新的线索。星形胶质细胞中糖原和糖基化的优先储存早已为人所知(赫兹，2004). 星形胶质细胞被认为在将谷氨酸降解为谷氨酰胺以及耦合突触活动和葡萄糖利用方面起着关键作用(Magistretti，2006年). 我们的发现证实了这些代谢途径中星形胶质细胞的显著富集，如糖酵解和克雷布斯循环，但也揭示了大量其他富含星形胶质细胞代谢途径(表1 D类). 例如，参与氨基酸合成和降解的途径显著丰富，例如甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的合成途径优先存在。某些脂质合成途径在星形胶质细胞中也高度富集，如图所示，它们优先表达Acsbg1/bullegum/lipidosin，这是一种具有长链酰基辅酶a合成酶活性的蛋白质(Fraisl等人，2004年). 虽然星形胶质细胞长期以来被认为在谷氨酸降解中起主要作用，但我们的代谢途径分析表明，星形胶质细胞在大多数或所有谷氨酸生成的主要途径或谷氨酸的4碳骨架中也高度富集，这表明星形胶质细胞的一个重要作用实际上可能是产生谷氨酸等神经递质，然后以谷氨酰胺等神经活性前体的形式将其发送给神经元。然而，星形胶质细胞转录组不包括囊泡谷氨酸转运体的mRNA或神经元中发现的突触蛋白，包括Vglut1、Vglut2、synapsin 1和synaptotagmin，因此不支持星形胶质细胞调节谷氨酸分泌的观点体内.

我们已经阐明的星形胶质细胞转录组也指出了许多关于星形胶质细胞功能的假设。可以说，对一种细胞类型中最高度表达的特定基因的了解应该为该细胞类型的可能功能提供重要线索。对于OLs，最高表达的特异性基因主要是髓鞘基因，这与它们在髓鞘形成中的最重要作用一致。对于神经元来说，突触基因的高表达与其神经传递的主要作用有关。对星形胶质细胞来说，对表达量最高的特异性基因的检测揭示了诸如ApoE、ApoJ/clusterin、Pla2g7、Sparc、hevin/Sparcl1和Mfge8等分泌蛋白，我们对这些基因在星形胶质细胞中的功能知之甚少。其中一些富含星形胶质细胞的基因可能对星形胶质细胞突触或星形胶质细胞-内皮细胞的相互作用很重要。其中许多基因在星形胶质细胞中从P1到P7到P17都被强烈上调，这表明它们编码的蛋白质在大多数突触形成前后的中枢神经系统发育中起着重要作用。这种可能性与星形胶质细胞调节突触形成能力的证据相一致(Christopherson等人，2005年). 我们发现了许多其他富含星形胶质细胞的基因，这些基因与精神分裂症和双相情感障碍等精神疾病有关，包括Npas3(Pieper等人，2005年)，Mlc1[发现于远端星形胶质细胞突起(Boor等人，2005年)]，Lgi1/4(Gu等人，2004年;Schulte等人，2006年)和Gpr56(Mochida，2005年)为星形胶质细胞可能参与突触调节以及神经和精神疾病的潜在途径提供线索。