βCaMKII通过靶向突触αCaMKI在海马突触可塑性和学习中发挥非酶作用

αCaMKII在凸轮2b^−/−神经元

由于βCaMKII能够以活性控制的方式结合F-actin(Shen等人，1998年;Shen和Meyer，1999年)药物诱导的肌动蛋白束的变化对CaMKII在脊柱中的递送有很大影响(Allison等人，2000年;Okamoto等人，2004年)βCaMKII可能会改变肌动蛋白动力学和CaMKIL全酶的定位。因此，我们假设βCaMKII的缺失可能导致αCaMKIL突触定位异常。然而，使用脑切片定量分析αCaMKII的定位变化具有挑战性，因为其普遍分布，并且其自我聚集和重新分布的能力取决于包括固定条件在内的多种因素(陶成等，2002). 因此，我们通过免疫染色研究了内源性αCaMKII在E18海马神经元培养物中的定位凸轮2b^−/−和野生型小鼠。将神经元固定在DIV14，并用抗巴松管（突触前活性区的标记物）、GKAP（突触后密度的标记物(图2). 尽管αCaMKII在野生型神经元中显示出显著的突触标记，但在凸轮2b^−/−-衍生神经元。为了量化这一点，我们测量了突触中的αCaMKII（与巴松管或GKAP共定位）与树突状轴中的αCalMKII的比率，发现该比率在凸轮2b^−/−在巴松管（αCaMKII）上测量神经元_突触/αCaMKII_轴比率：野生型神经元，3.3±0.2，n个= 15;凸轮2b^−/−神经元2.1±0.2，n个= 14; 曼·惠特尼U型测试，U型= 17.00,第页= 0.0002) (图2一)，在GKAP（αCaMKII）上测量时为60%_脊椎/αCaMKII_轴比率：野生型神经元，3.42±0.16，n个= 10;凸轮2b^−/−神经元，1.50±0.14n个= 10; 曼·惠特尼U型测试，U=8.00，第页= 0.001) (图2b条). 在降低或增加凸轮2b^−/−用河豚毒素或荷包牡丹碱培养神经元24小时，因为这两种处理均未显著改变αCaMKII的定位（αCaMJII_突触/αCaMKII_轴比值：对照介质，1.66±0.19，n个= 5; 河豚毒素，1.74±0.18，n个= 5; 荷包牡丹碱，1.80±0.13，n个= 6; 方差分析F类_(2,13)= 0.05;第页= 0.96). 这表明这些变化并不是由于文化间自发活动的差异造成的。此外，尽管培养物来自E18神经元，但野生型DIV14培养物中αCaMKII/βCaMKII的比率与成年小鼠海马体中观察到的比率相当(图2d日). 总之，这些发现突出了βCaMKII在调节突触池和相邻树突状轴之间内源性αCaMKIL分布方面的重要性。

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图2。

靶向树突棘的受损αCaMKII凸轮2b^−/−老鼠。一，培养的野生型海马神经元的代表性图像（顶部），树突节段的扩大（底部），标记为αCaMKII（绿色）和巴松管（红色），以及它们的共定位（合并）。b条、有代表性的文化形象凸轮2b^−/−海马神经元（顶部），树突节段（底部）扩大，标记有αCaMKII（绿色）和巴松管（红色），以及它们的共定位（合并），表明αCaMJII对神经突触的靶向性降低凸轮2b^−/−海马神经元。c（c）、野生型的代表性图像（顶行）和凸轮2b^−/−（最下面一行）海马树突状节段，标记有αCaMKII（绿色）和GKAP（红色），以及它们的共定位（合并）（左侧）和标记有αCaMKII和F-actin（指骨蛋白染色）（红色）及其共定位（融合）（右侧），显示αCaMKII对脊髓的靶向性降低凸轮2b^−/−海马神经元。d日Western blot显示，与成年野生型小鼠的裂解液相比，DIV14上E18衍生的野生型培养神经元中αCaMKII（α）与βCaMKIL（β）的比率相当。

凸轮2b^−/−小鼠表现出LTP受损

考虑到整体神经元形态在凸轮2b^−/−αCaMKII在树突棘中定位受损的突变体，我们通过研究海马CA1突触的突触可塑性来研究其功能意义。利用急性海马脑片中的细胞外记录，我们重点研究了Schaffer–侧支通路，因为大量文献表明这种突触在许多形式的海马依赖性学习和记忆中都有作用。未观察到基底突触传递的明显损伤凸轮2b^−/−老鼠(图3一)两次纤维截击均无显著变化（重复测量方差分析，F类_(1,135)= 0.22;第页=0.64）或fEPSP斜率（重复测量ANOVA，F类_(1,135)= 1.4;第页= 0.23). 然而，我们发现凸轮2b^−/−与野生型同窝小鼠相比的突变体（野生型小鼠，152.6±7.7，n个= 27;凸轮2b^−/−小鼠，119.3±4.4，n个= 21; 曼·惠特尼U型测试，U型= 130.00,第页= 0.0015) (图3b条)表明βCaMKII在海马Schaffer侧支通路的突触可塑性中起着重要作用。值得注意的是凸轮2b^−/−由100 Hz/1 s破伤风诱导的小鼠，其严重程度与失去更丰富的αCaMKII后一样(Elgersma等人，2002年). 此外，应该注意的是，杂合子对海马LTP没有影响凸轮2a突变体(弗兰克兰等人，2001年;Elgersma等人，2002年)，这表明与纯合子相比，总CaMKII水平下降较大凸轮2b突变体。这表明凸轮2b^−/−小鼠不能仅用CaMKII活性丧失来解释。

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图3。

海马可塑性与学习凸轮2b^−/−老鼠。一,凸轮2b^−/−小鼠表现出正常的突触传递（野生型，n个= 74;凸轮2b^−/−,n个= 63).b条,凸轮2b^−/−小鼠表现出100 Hz LTP受损（野生型，n个= 27;凸轮2b^−/−,n个= 21).c（c）,凸轮2b^−/−小鼠表现出正常的200 Hz LTP（野生型，n个= 14;凸轮2b^−/−,n个= 12).d日，200 Hz LTP依赖于αCaMKII，如凸轮2a^−/−小鼠表现出200 Hz LTP受损（野生型，n个= 12;凸轮2a^−/−,n个= 18).e（电子），上下文恐惧条件反射受损凸轮2b^−/−老鼠。足震前（Pre）和训练后24小时（Post）训练期间的冻结时间百分比表明，休克后冻结时间减少，而震前冻结时间正常（野生型，n个= 10;凸轮2b^−/−,n个= 10). 误差线代表SEM；星号表示突变体和对照之间存在显著差异。

先前已经表明，F-actin/G-actin平衡的变化影响αCaMKII定位(Allison等人，2000年;Okamoto等人，2004年)NMDA受体的刺激影响CaMKII的定位以及F-肌动蛋白/G-肌动蛋白的平衡(Shen和Meyer，1999年;Okamoto等人，2004年). 总之，这些发现支持了一个模型，即CA1 LTP高度依赖于αCaMKII对脊椎的正确靶向，而βCaMKIL是必需的。如果LTP赤字是由于αCaMKII定位错误造成的，可以想象，可以通过使用更强的LTP诱导协议（4列200 Hz 0.5 s，间隔5 s）来弥补LTP赤字(Grover和Teyler，1990年). 事实上，使用这种刺激方案，LTP在凸轮2b^−/−小鼠，证实了改变的CaMKII定位的功能意义（野生型小鼠，131.6±4.4，n个= 14;凸轮2b^−/−小鼠，129.7±5.7，n个= 12; 非配对双尾t吨测试，t吨₍₂₄₎= 0.36,第页= 0.72) (图3c（c）). 为了确认此200 Hz LTP协议需要αCaMKII，我们还在凸轮2a^−/−老鼠。的确，凸轮2a^−/−小鼠表现出显著的损伤（野生型小鼠为179.6±13.3，n个= 12;凸轮2a^−/−, 133.3 ± 4.8,n个= 18; 曼·惠特尼U型测试，U型= 36.00,第页= 0.0025) (图3d日)，表明该LTP协议确实依赖于CaMKII活动。总之，这些结果表明凸轮2b^−/−强烈的LTP诱导方案可以战胜小鼠。这些发现与海马突触可塑性缺陷是由于未能将αCaMKII正确靶向海马突触树突棘的假说相一致，但不是其证据凸轮2b^−/−鼠标。

凸轮2b^−/−小鼠表现出海马依赖性学习障碍

测试CaMKII在凸轮2b^−/−小鼠也会影响海马学习，我们利用情境恐惧条件反射。在这项任务中，老鼠习惯于将特定的环境与温和、厌恶的脚震联系起来。学习是通过测量冷冻行为（即停止除呼吸外的所有运动）来评估的，这是小鼠恐惧的自然表达。凸轮2b^−/−突变体在休克前基线冷冻行为方面与野生型同窝小鼠没有差异（野生型小鼠，0.9±0.2%，n个= 11;凸轮2b^−/−小鼠，0.7±0.2%，n个= 9; 双尾t吨测试，t吨₍₁₈₎= 0.72,第页= 0.48) (图3e（电子）)，但在24小时长期记忆测试中显示冻结明显减少，表明海马依赖性记忆受损（野生型小鼠，44.8±4.6%，n个= 11;凸轮2b^−/−小鼠，27.8±2.7%，n个= 9; 双尾t吨测试，t吨₍₁₈₎= 3.0,第页= 0.0079) (图3e（电子）).

生成和表征凸轮2b^a303年鼠标

上述结果表明，βCaMKII通过调节αCaMKI定位于树突棘而强烈影响海马可塑性。然而，βCaMKII对钙/钙调素的亲和力比αCaMKI高近10倍，异源全酶的敏感性范围取决于α与β亚基的比率(德科宁克和舒尔曼，1998年;Brocke等人，1999年). 因此，我们不能排除CA1 LTP和海马依赖性学习缺陷是由βCaMKII酶活性的丧失而不是αCaMKIL的异常定位引起的。因此，我们试图利用βCaMKII（A303R）的一个描述良好的突变来区分这些可能性，该突变可防止激酶激活（通过干扰钙/钙调素结合），同时保留F-actin结合和捆绑(Shen和Meyer，1999年;Fink等人，2003年;O'Leary等人，2006年). 此外，βCaMKII-A303R蛋白对树突状树枝化没有显示出显性负效应在体外与表达催化死亡的βCaMKII-K42R蛋白的细胞不同，后者不能结合ATP(Fink等人，2003年). 因此，这种突变使我们能够很好地剖析βCaMKII激酶活性和F-actin捆绑对LTP和学习的需求。

我们创造了凸轮2b替代丙氨酸的基因³⁰³精氨酸（A303R）(图4一,b条). 纯合子点突变体（指定为凸轮2b^a303年小鼠）中βCaMKII和αCaMKIL的表达没有变化凸轮2b^A303R型鼠标(图4c（c）,d日). 由于钙/钙调蛋白的结合是Thr286/287处CaMKII自动磷酸化的先决条件（有关审查，请参阅Hudmon和Schulman，2002b;Lisman等人，2002年;科尔布兰，2004年)，我们使用磷酸化-Thr286/287抗体来确认这种突变使βCaMKII-A303R蛋白对钙/钙调素激活不敏感。事实上，Western blot分析显示βCaMKII Thr²⁸⁷磷酸化在凸轮2b^A303R型鼠标(图4d日)，确认在体外研究表明，A303R突变阻断了βCaMKII的激活。我们还观察到αCaMKII Thr显著减少²⁸⁶自身磷酸化（野生型小鼠100±7.2，n个= 7;凸轮2b^A303R型小鼠，69.9±8.3，n个= 5; 曼·惠特尼U型测试，U型= 4.0,第页= 0.03) (图4d日)，这并不意外，因为大多数αCaMKII亚单位与βCaMKIL亚单位相关，并且需要两个相邻的激活CaMKIl亚单位才能在Thr286/Thr287处实现亚单位间的自动磷酸化(Hudmon和Schulman，2002b;Lisman等人，2002年;科尔布兰，2004年). 硫胺素染色未显示大脑的任何大体形态变化(图4e（电子）)表明尽管存在一种非活性形式的βCaMKII，但大脑发育正常。

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图4。

的生成凸轮2b^A303R型老鼠。一，生成的示意图凸轮2b^A303R型突变体。基因组，野生型凸轮2b带有Ala303周围外显子的基因座被描绘成黑箱；构建物，用于在Ala303中引入突变的靶向构建物。外显子12中的星号表示Ala303突变。新霉素基因两侧的LoxP位点被描绘成三角形。在构建物中克隆DTA进行阳性选择。重组，突变凸轮2b^A303R型ES细胞同源重组后的位点；Floxed，突变型凸轮2b^A303R型Cre重组后的位点。b条，第12外显子中的Ala303序列显示诱导Ala303Arg的特异性突变。c（c），使用βCaMKII特异性抗体进行免疫细胞化学染色，结果表明，海马中βCaMJII染色无差异凸轮2b^A303R型小鼠（底部）与野生型小鼠（顶部）进行比较。d日，使用αCaMKII和βCaMKIL特异性抗体进行的Western blot分析显示，海马中αCaMKII和βCaM KII的水平没有差异凸轮2b^A303R型老鼠。使用特异性抗体检测αCaMKII-T286和βCaMKII-T287磷酸化水平的Western blot分析显示，Thr286磷酸化略有降低，而Thr287磷酸化在海马中完全缺失凸轮2b^A303R型老鼠。e（电子），Thionin染色显示凸轮2b^A303R型老鼠。

αCaMKII在凸轮2b^A303R型神经元

为了直接检测βCaMKII对αCaMKIL定位的影响，我们测试了αCaMJII的突触靶向性是否在神经元中发生改变凸轮2b^A303R型老鼠。值得注意的是，与凸轮2b^−/−神经元，凸轮2b^A303R型神经元显示正常的αCaMKII突触定位_突触/αCaMKII_轴：野生型神经元，4.2±0.7，n个= 6;凸轮2b^A303R型神经元3.9±0.6，n个= 7; 曼·惠特尼U型测试，U型= 14.00,第页= 0.37) (图5). 这些结果表明，αCaMKII靶向突触需要βCaMKIL蛋白而不是其钙/钙调素依赖性激活。

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图5。

αCaMKII在体外培养大鼠神经元中的正常分布凸轮2b^A303R型老鼠。培养的野生型和凸轮2b^A303R型海马神经元标记有αCaMKII（绿色）和巴松管（红色），其共定位（合并）显示αCaMJII在凸轮2b^A303R型海马神经元。插入物显示具有两个棘的树枝状节段的扩大。

这个凸轮2b^A303R型小鼠LTP正常

凸轮2b^A303R型尽管βCaMKII的钙/钙调蛋白依赖性激酶活性完全消失，但小鼠仍保持了αCaMKIL的正常突触定位。这为剖析βCaMKII影响突触可塑性和学习的机制提供了一个独特的机会。

如中所述凸轮2b^−/−老鼠(图3一)，急性海马脑片细胞外记录凸轮2b^A303R型小鼠表现出基础突触传递的轻微但不显著的减少（基础突触传递：重复测量ANOVA纤维截击，F类_(1,46)= 0.44,第页= 0.51; fEPSP坡度，F类_(1,46)= 0.93;第页= 0.34;n个对于野生型和凸轮2b^A303R型老鼠）(图6一). 然而，与凸轮2b^−/−100 Hz LTP严重缺失的小鼠，凸轮2b^A303R型小鼠表现出正常的100 Hz LTP（野生型小鼠，149.7±9.2，n个= 15;凸轮2b^A303R型小鼠，133.4±7.5，n个= 10; 双尾t吨测试，t吨₍₂₃₎= 1.40,第页= 0.17) (图6b条). 这些结果表明，βCaMKII的激酶活性对海马突触可塑性是不必要的，并且表明βCaMJII的功能主要是调节αCaMKI靶向树突棘。

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图6。

正常海马突触可塑性与学习凸轮2b^A303R型老鼠。一,凸轮2b^A303R型小鼠表现出正常的突触传递（野生型，n个= 68;凸轮2b^A303R型,n个= 58).b条,凸轮2b^A303R型小鼠表现出正常的100 Hz LTP（野生型，n个= 28;凸轮2b^A303R型,n个= 19).c（c）,凸轮2b^A303R型小鼠表现出正常的情境恐惧条件反射。足震前（Pre）和训练后24小时（Post）训练期间冻结的时间百分比，表明在凸轮2b^A303R型小鼠（野生型，n个= 14;凸轮2b^A303R型,n个= 6). 误差条代表SEM。

神经元发育不需要βCaMKII

考虑到与αCaMKII相比，βCaMKIL在发育早期的表达(Sahyon等人，1985年;拜耳等人，1999年)βCaMKII的敲除或过度表达影响培养海马神经元或神经母细胞瘤细胞的突触数量和突起生长(野村等，1997年;Fink等人，2003年)，可能会对海马发育产生重大影响。然而，我们发现βCaMKII的缺失或失活都不会在光镜水平影响大脑发育。因此，我们得出结论，βCaMKII对正常的大脑发育和CA1锥体神经元的正常脊椎数目来说不是必需的。这与之前小脑的发现类似(van Woerden等人，2009年). 然而，尽管我们的数据表明，βCaMKII对正常大脑发育是不必要的，但我们不能排除βCaMJII的种系突变导致稳态代偿机制，以防止βCaMKII表达改变后不久在神经元培养物中出现的变化。