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神经科学杂志。2012年11月28日；32(48): 17230–17240.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.2951-12.2012
预防性维修识别码：PMC6621869
PMID：23197715

Rett综合征小鼠模型呼吸功能障碍的焦虑相关机制

任军, 丁秀青, 格雷戈里·芬克,和约翰·格里尔通讯作者
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Rett综合征（RTT）是一种严重的神经系统疾病，与甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）基因突变有关。RTT患者患有精神发育迟滞和行为障碍，包括高度焦虑和状态依赖性呼吸异常，如过度换气和呼吸暂停。许多症状通过机械2-空白雄性小鼠(机械2−/年). 为了描述呼吸表型的发展进程并探索其潜在机制，我们检测了机械2−/年和野生型（WT）小鼠从症状前期到疾病终末期。我们监测了在清醒-睡眠状态下自由活动的小鼠的呼吸模式，同时使用运动限制或危险气味（三甲基噻唑啉）改变应激水平。呼吸运动模式由就地测量工作心脏-脑干准备物（WHBP），以评估脑干呼吸网络从脑桥上结构分离出来的功能。数据显示机械2−/年老鼠。在早期，呼吸异常仅限于清醒状态，与应激标记物相关（粪便沉积增加和血液皮质酮水平升高），并可通过安他拉明（促肾上腺皮质激素释放激素受体1拮抗剂）缓解。此外，WHBP产生的呼吸节律在WT和机械2负极/年老鼠。在后期，清醒和睡眠期间出现明显的呼吸异常。此外，WHBP来自机械2−/年表现为中枢性呼吸暂停。我们的结论是，在疾病早期，桥上结构的应激相关调节是机械2−/年呼吸表型和抗焦虑药物可能有效。在后期，脑干呼吸网络的异常是导致呼吸模式不规则和中枢性呼吸暂停的重要原因。

介绍

Rett综合征（RTT）是一种严重的神经系统疾病，通常（80-90%）与甲基-CpG结合蛋白2（MeCP2）基因突变有关（有关综述，请参阅Neul和Zoghbi，2004年). 传统观点认为，MeCP2在关键发育期丢失会导致大脑结构和细胞功能发生不可逆转的变化，但在以下情况下，表型发生了显著逆转：机械2可诱导转基因小鼠模型中的表达被重新激活(Guy等人，2007年;Cobb等人，2010年;Guy等人，2011年;Lioy等人，2011年). RTT患者出生时看起来正常，但逐渐出现一些行为障碍，包括严重的呼吸不规则，这些呼吸不规则在受影响的个体之间和个体内部都有很大的变化，具体取决于行为唤醒的水平。患者经历了长时间的正常呼吸（例如在睡眠中）这一事实表明，呼吸功能障碍的基础不一定是呼吸节律产生中心本身。相反，呼吸节律异常可能归因于状态依赖，下行驱动至脑干呼吸网络。在这里，我们用雄性小鼠来测试这个假设(机械2−/年)缺少机械2基因产物，并具有明显的渐进性呼吸功能障碍，作为其表型的一部分（有关综述，请参阅Katz等人，2009年). 我们关注焦虑水平与呼吸异常之间的关系，因为RTT患者经常出现焦虑加剧的情况，并且对压力有异常的生理反应(Sansom等人，1993年;哈格伯格，2002年;Mount等人，2002年;Axelrod等人，2006年). RTT小鼠模型同样显示出焦虑样行为增加(莫雷蒂和佐格比，2006年;Fyffe等人，2008年)以及应激激素系统的改变(Nuber等人，2005年;McGill等人，2006年;Braun等人，2012年).

我们通过在广泛的发育窗口内检查单个小鼠和/或小鼠队列来评估中央呼吸控制机制，该发育窗口涵盖了从症状前期到终末期疾病。使用全身容积描记术，我们监测了患者的呼吸模式以及低氧和高碳酸通气反应机械2−/年和野生型（WT）小鼠处于不同的睡眠-觉醒状态，同时系统性地改变应激相关信号的水平。此外，我们测试了阻断应激相关信号是否可以逆转呼吸不稳定并稳定心律。此外，我们比较了在不同年龄段就地WT和机械2−/年将小鼠从桥上下行输入的影响中分离出来，以评估脑干呼吸网络的功能。总体而言，数据表明机械2负极/年小鼠在其一生中经历两个阶段的呼吸功能障碍。脑桥上结构对呼吸模式的应激相关调节是疾病早期呼吸表型的重要组成部分。在后期，呼吸表型主要由脑干呼吸网络内功能异常的发展决定。

材料和方法

动物。

所有实验程序均由阿尔伯塔大学医学院和牙科动物福利委员会批准。机械2杂合女性(机械2tm1–1日) (Chen等人，2001年)和WT雄性小鼠从老鼠区域资源中心（加利福尼亚大学戴维斯分校，加利福尼亚州戴维斯分校）获得，并在阿尔伯塔大学建立了一个群体。B6.129号机械2−/年和WT(机械2+/年)来自同一窝的小鼠被一起处理以进行比较。

容积测量。

在全身Plexiglas容积描记器中对未受训练的小鼠进行测量，该容积描记仪具有流入口和流出口，用于持续输送稳定流量（300 ml/min）的新鲜空气并清除过期的二氧化碳。定制的各种尺寸的有机玻璃室用于容纳动物。大腔室的容积为260毫升，直径为5厘米，长度为13厘米。小腔室的体积为50毫升，直径3.5厘米，长度6厘米。在大腔室（小鼠可以自由移动）中进行记录，除非另有说明。将小鼠放入试验箱后约20分钟开始进行容积描记记录。使用压力传感器（型号DP 103；Validyne）、信号调节器（CD-15；Validyne）、模数板（Digidata 1322A）以及数据采集（Axoscope）和分析（Clampfit）软件（Molecular Devices）检测压力变化。值得注意的是，我们的容积描记仪对研究呼吸频率是有效的(（f）R（右）)和呼吸暂停检测。然而，它并不是为潮汐量的精确量化而设计的(V（V）T型; 毫升/克）。全身容积描记术的物理原理是检测吸入气体加热和加湿引起的腔室压力变化。然而，潮气量测量也可能受到与气道阻力相关的气体压缩效应的影响。由于这些局限性，我们的全身体积描记系统仅提供了以下方面的半定量测量V（V）T型以及检测相对于控制状态的变化。因此，我们对分钟通风量的测量(V（V）E类; 毫升每分钟每克），这等于（f）R（右）×V（V）T型，也是半定量的，仅报告相对于对照。呼吸暂停被定义为在相当于或超过两个完整的呼吸周期内没有气流。化学感受性反应（气体交换后1分钟）2或CO2通过从室内空气切换到缺氧（8%O2)或高碳酸血症（5%CO2)流速为3L/min。注意，首先将室内空气的流量提高到3L/min，让动物沉降，然后改变气体成分，而不改变气流或与气体切换一致的任何其他明显事件。使用Oxychek仪器（Critikon）测量氧气含量证实，新气体在大室内平衡需要约12秒。在容积描记法记录前后测量直肠温度（8402-10型热敏电阻；Cole-Parmer仪器公司）。WT和机械2−/年小鼠在1-2小时的记录过程中没有明显变化（<0.2°C，n个=3个）。

无线遥测监测睡眠-唤醒状态。

通过遥测技术测量大脑皮层脑电图（EEG）和颈部肌电图（EMG）信号，用于识别和确认视觉检测睡眠-觉醒状态的可靠性机械2−/年和WT小鼠。高振幅肌电图活动和低振幅脑电图的结合表明清醒。安静的清醒状态与不规则的脑电图有关，而活跃的清醒状态（动物在房间内积极行走和转动）与有规律的θ节律脑电图有关。低水平的肌电活动与规律的θ（5–9 Hz）节奏对应于快速眼动（REM）睡眠。低水平的肌电活动和高振幅δ波（1–4 Hz）被归类为非快速眼动睡眠(Steriade等人，1993年;Brankack等人，2010年). 仅凭目视检查，无法可靠区分REM和NREM睡眠。因此，我们只能从视觉上区分睡眠和清醒状态。用异氟醚（0.5%–1%，5%CO）麻醉小鼠2–95%O2)并装有F20无线电遥测探头（国际数据科学公司），如前所述(斯蒂芬森等人，2001年). 简单地说，在头皮和腹部做中线切口，分别暴露颅骨和腹腔。使用加热垫将体温维持在37°C。将无线电发射机插入腹膜腔内，并与腹直肌松散缝合。从植入物引出的电极导线从腹膜腔中穿过隧道，经皮下引至头部。腹部肌肉和皮肤闭合。将肌电电极缝合到颈部肌肉上。在头骨上钻一个洞，将脑电图电极放置在右侧约2毫米处，位于脑角前方2毫米处。牙科用丙烯酸树脂将电极固定在颅骨上。在记录之前，允许小鼠恢复至少一周。将动物置于体积描记器中，在监测呼吸的同时，连续记录传输的颈部肌电和脑电图信号。体积描记器显示，小鼠每天1-2小时的睡眠时间为30%(n个=WT和机械2−/年).

应激相关行为和血清皮质酮的测量。

压力相关行为与呼吸模式记录一起进行监测。将小鼠放入体积描记室后10分钟内沉积的粪便玻利来计数公认标准监测应激指示(Calvo-Torrent等人，1999年). 此外，从WT和机械2−/年暴露于应激诱导方案1小时后，从四个实验组中获得皮质酮水平：（1）在家庭笼子或大房间（260ml容量）中；（2） 在小记录室（50ml容量）的更多限制范围内；（3） 暴露于0.5μl三甲基噻唑啉（TMT）（Phero-Tech）（TMT是从狐狸粪便中提取出来的，是一种实验模型，被证明会引起急性焦虑和皮质酮水平升高(布兰查德等人，2003年;Vendruscolo等人，2006年)在大房间里；（4）给予促肾上腺皮质激素释放激素受体1（CRHR1）拮抗剂安替拉明（10mg/kg，i.p.）后，将动物放回笼中20min，然后放入大室或小室中1h。将Antalarmin溶解在浓度为60 mg/ml的100%二甲基亚砜中，然后用生理盐水稀释至3 mg/ml溶液中进行注射。通过快速斩首杀死小鼠，并在含有EDTA的预冷试管中收集干血。将血液离心10分钟，收集血清并在−80°C下冷冻，直至分析。根据制造商的说明（免疫诊断系统），使用ELISA试剂盒测量血清皮质酮总浓度。在每次分析中，为每个样品分配两个孔。使用微孔板阅读器测量井的信号强度。使用KC Junor软件（Bio-Tek）生成标准曲线。

现场工作心脏-脑干准备。

这个就地去脑工作心脏-脑干准备（WHBP）产生强大的呼吸放电(Paton，1996年)并且非常适合于分析减少成年啮齿动物的基本呼吸节律发生，而不需要桥上结构的调节性状态依赖性输入。我们遵循了之前描述的协议(Ren等人，2006年). 简单地说，用异氟醚麻醉小鼠，将其浸没在冰镇氧合灌注液中，再去脑，切断尾侧至膈肌。然后将躯干和脑干转移到一个记录室，在该记录室中，用双腔套管（一条管道用于输送灌流液，另一条用于监测血压）对降主动脉进行插管，并灌注生理盐水[125m米氯化钠，4米米KCl，1.25米米硫酸镁4，24米米氯化钠三，1.25米米千赫2人事军官4，2.5米米氯化钙2，10米日（m）-葡萄糖和用95%O鼓泡的1.3%Ficoll（Sigma）2–5%一氧化碳2流速为15–22 ml/min]，足以产生并维持60 mmHg的动脉压（初始潜水后<8 min）。一旦开始灌注并稳定动脉压力，通过加热灌注液将制剂逐渐加热至30°C。然后让制剂稳定1小时，在此期间，解剖左侧膈神经以监测吸气活动（频率和爆发幅度）。稳定1小时后，记录基线呼吸输出量。通过放置在两个铂钩电极上的膈神经监测WHBP的呼吸节律。使用模拟-数字转换器（Molecular Devices Digidata 1200）和数据采集（Axoscope）和分析（Clampfit）软件对信号进行放大、校正、低通滤波并记录到计算机中。

数据分析。

数据表示为平均值±SEM。呼吸频率的变异系数是通过将SD除以呼吸频率的算术平均值来计算的。在至少5分钟的时间内测量两组患者的呼吸参数体内和WHBP，但在化学感受性实验中，我们分析了1分钟内对缺氧和高碳酸血症的反射反应。对于分钟通气测量，这些值被报告为安静清醒时相对于WT控制的平均值。使用SigmaStat 3.5（Systat软件）进行统计分析。在完整的动物和WHBP实验中，通过Tukey’s的单向方差分析评估呼吸参数、应激激素皮质酮、粪便血糖和体重变化的重要性临时的测试（多组）或t吨测试（两组）。只有在验证了正态性之后，才对数据进行统计比较。生存率分析采用Kaplan–Meier log-rank检验。用Spearman秩次检验检验呼吸表型与皮质酮测定值的相关性，相关系数接近1第页<0.001表示存在较强的正相关。第页<0.05表示平均值之间存在显著差异。

结果

机械2−/年小鼠表现出进行性呼吸功能障碍体内

我们通过对单个小鼠的呼吸模式进行纵向分析来启动这项研究。我们观察到机械2负极/年小鼠表现出两个阶段的呼吸功能障碍。图1A类显示了WT小鼠在安静清醒和睡眠期间的典型体积描记图痕迹。中的录制图1A类来自出生后第32天（P32）的WT小鼠。年龄相近的野生动物的呼吸模式相似（P32–P115）。录制自机械2−/年类似条件下的小鼠如图所示图1B类（所有记录均在260毫升的大腔室中）。在最初的实验中，用仪器记录小鼠大脑皮层的脑电图和颈部肌肉的肌电图，并结合全身体积描记法记录(图1C类;n个=WT和机械2−/年小鼠）验证随后使用的将睡眠与清醒状态区分开来的观察方法是可靠的。所有机械2−/年所研究的小鼠在～1-2个月大时表现出明显异常的呼吸模式。在早期阶段，机械2−/年小鼠有一种不稳定的呼吸模式，其特征是呼吸频率降低引起的快速呼吸，在安静清醒时出现明显的呼吸暂停，但在睡眠时没有。因此，在本研究中，我们将呼吸功能障碍的早期定义为清醒时的明显呼吸暂停，而非睡眠时。我们没有分析全身运动（即在室内行走或转身）期间的呼吸模式。随着时间的推移，机械2−/年小鼠在睡眠和清醒时开始出现呼吸暂停。呼吸功能障碍的发生和进展在以下队列中有所不同：机械2−/年检查小鼠。在大多数（13只中的9只）小鼠中，清醒时的呼吸暂停大约出现在P32。睡眠呼吸暂停在1-3周后开始出现，并随着年龄的增长而变得更加频繁和持续时间更长(图1D类显示死亡前的呼吸暂停）。两个机械2−/年小鼠（13只受试动物）在P26时出现明显的清醒性呼吸暂停，从第P34天开始出现睡眠呼吸暂停，并在P43和P45时死亡。剩下的两个机械2−/年研究显示，从第46页到第50页有明显的觉醒性呼吸暂停。全部13个机械2−/年小鼠在6-12周龄时死亡。人口数据显示机械2−/年和WT小鼠每分钟呼吸暂停次数、呼吸频率、变异系数(（f）)，和相对分钟通气量如所示图1E类由于呼吸表型的出现在个体小鼠之间有所不同，因此呼吸参数随年龄变化的群体数据被标准化，第0天被定义为清醒时出现明显呼吸暂停的前一天。

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WT患者呼吸模式的年龄和状态依赖性变化机械2−/年老鼠。无约束WT呼吸活动的代表性全身容积测量(A类，第32页）和机械2−/年(B类来自一只不同发育年龄的P32、P40和P48小鼠，在安静清醒（左）和睡眠（右）期间。C类、睡眠-觉醒阶段的记录，显示体积描记轨迹（Resp）、脑电图和颈部肌电图机械2−/年小鼠处于疾病进展的早期和晚期。D类，体积描记记录来自机械2−/年小鼠在终末期呼吸暂停前的最后几分钟制造的。E类人口数据显示了不同年龄和清醒-睡眠状态下每分钟呼吸暂停次数、呼吸频率、呼吸频率变异系数和分钟通气量（相对于安静清醒时的WT控制）。n个=每个数据点7–13；+第页< 0.05, *第页<0.01，以及#第页与第0天以及WT和机械2−/年老鼠。请注意，绘制的天数被标准化为在明确的觉醒性呼吸暂停发作之前开始（发作随着年龄的变化在以下人群中有所不同机械2−/年研究小鼠；有关详细信息，请参阅结果）。

化学感受性反应的改变机械2−/年老鼠

环境O水平变化引起的化学感受性反应2和CO2还通过容积描记法进行了检查。注意，我们的系统允许快速气体交换（12秒），我们将测量重点放在对缺氧和高碳酸血症的主要反应上（气体平衡12秒后持续1分钟）。WT和机械2−/年小鼠（在呼吸功能障碍的早期和晚期）在室内空气中和暴露于缺氧（8%O2)和高碳酸血症（5%CO2)如所示图2A类（在安静清醒的时候）。显示频率（相对于室内空气）和频率变化系数的人口数据如所示图2B类在低氧和高二氧化碳状态下，呼吸频率和变异系数有增加的趋势机械2−/年(n个=5）相对于WT(n个=6）小鼠处于早期阶段，但差异无统计学意义。然而，在呼吸功能障碍的晚期，机械2−/年小鼠对缺氧（8%O2,n个=5），显著增加相对频率（2.1±0.12，F类(2,13)= 12,第页=0.001）和呼吸频率变化系数（0.33±0.04，F类(2,13)= 4.7,第页=0.02）与WT相比（相对频率为1.42±0.07；呼吸频率变化系数为0.18±0.02）。同样，机械2−/年小鼠对高碳酸血症（5%CO）的反应显著改变2,n个=5）明显增加的相对频率（1.84±0.15，F类(2,13)=6.8，第页=0.012）和呼吸频率变化系数（0.31±0.04，F类(2,13)= 9.3,第页=0.003）与WT相比（相对频率为1.35±0.08；呼吸频率变异系数为0.14±0.02）。

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缺氧和高碳酸血症的通气反应。A类，P52 WT、P40呼吸的代表性全身容积描记测量机械2−/年（早期呼吸功能障碍），P52机械2−/年（晚期呼吸功能障碍）小鼠在室内空气中，缺氧（8%O2)或高碳酸血症（5%CO2).B类，显示WT响应的人口数据(n个=6），早期(n个=5）和后期(n个= 5)机械2−/年小鼠缺氧、高碳酸血症；绘制了频率（相对于室内空气）和呼吸频率变化系数。比较相对频率（房间空气中的频率被描绘为1），因为后期房间空气中基线呼吸频率较慢机械2−/年老鼠。纳秒第页≥ 0.05,+第页< 0.05, *第页<0.01，两组之间。

CRHR1介导的高焦虑和压力机械2−/年老鼠

通常，在记录啮齿动物呼吸模式时，体积描记室的大小保持在最小，以最大限度地提高信噪比。然而，我们注意到，与其他鼠种相比，许多机械2−/年小鼠表现出过度换气，随后被放置在50毫升的密闭室中时出现呼吸暂停，这表明焦虑加剧。当动物被放置在更大的260毫升容积描记室中时，这种焦虑、过度呼吸暂停的行为明显减少。这些观察结果与过去的报告相结合机械2−/年和机械2308/年老鼠(Gemelli等人，2006年;Fyffe等人，2008年;Adachi等人，2009年)引导我们进一步研究小鼠模型中的应激反应及其与呼吸功能障碍的关系。首先，我们测量了WT和机械2−/年小鼠（早期呼吸表型）在以下条件下：基础条件（在大体积描记室中）；约束应力（在较小的体积描记室中）；大腔室中TMT暴露引起的应力；以及在施用CRHR1拮抗剂安他拉明（10mg/kg，i.p.）后20分钟放置在大或小腔室中。图3A类显示了将小鼠放入体积描记器记录后的前10分钟内，粪便中的玻利计数。机械2−/年小鼠（4.4±0.53/10分钟，n个= 7,t吨(12)= 3.4,第页=0.006）沉积的粪玻利显著高于WT（2.3±0.36/10 min，n个=7）在大体积描记室中。在较小的试验箱内，两个WT（4.2±0.6/10 min，n个= 6,F类(3,21)= 6.5,第页=0.02）和机械2−/年（7.2±0.6/10分钟，n个= 6,F类(3,21)= 15,第页=0.005）小鼠相对于较大的培养箱显著增加了粪便中的boli沉积。在机械2−/年相对于WT(t吨（10）＝3.5，第页=0.005）小室中的小鼠。接触TMT气味后，WT中的粪丸沉积量也显著增加（4.0±0.37/10 min，n个= 6,F类(3,21)= 6.5,第页=0.037）和机械2−/年（6.2±0.48/10分钟，n个= 6,t吨(11)= 2.4,第页=0.035）小鼠作为较小的小室，对机械2−/年小鼠显著大于WT小鼠(t吨（10）= 3.6,第页= 0.005). 在最后的范例中，WT和机械2−/年在放置于大体积描记室之前，给予安替拉明（10mg/kg，i.p.）(n个=3）或小腔室(n个= 3). 这对WT小鼠在大腔室中的粪便BOI沉积没有影响，但降低了小腔室的粪便BOL(t吨(7)= 2.4,第页= 0.049). 然而，安替拉明预处理通过以下方式减少了粪便中的玻利沉积机械2−/年小鼠在大小室中的水平（2.5±0.43/10 min，n个=6）与大腔室中的WT小鼠相当。将来自大室和小室的抗警报素数据汇总在一起，以计算粪便玻利，因为它们没有显著差异。

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通过粪便中的脂肪沉积和皮质酮水平测量的应激机械2−/年小鼠（早期）。A类，将小鼠放养后前10分钟内沉积的粪便玻利数量(n个=WT和机械2−/年组）或小(n个=WT和机械2−/年暴露于TMT（0.5μl；n个=WT和机械2−/年组）或在放置于大或小腔室（10mg/kg，i.p。，n个=WT和机械2负极/年组；其中，n个=大室和小室各3个）。B类、从笼子中取出小鼠后的血皮质酮水平(n个=WT和机械2−/年组），大鼠1小时后(n个=WT和机械2−/年组）或小(n个=WT和机械2−/年暴露于TMT（0.5μl，n个=WT和机械2−/年组）或在放置于腔室前给予安他拉明（10mg/kg，i.p。，n个=WT和机械2−/年组；其中，n个=大室和小室各3个）。纳秒第页≥ 0.05,+第页<0.05，以及*第页两组间<0.01。

重复实验方案，从机械2−/年将WT小鼠从体积描记器室中取出后1小时，对其进行测量（人口数据如所示图3B类). 注意，放置在笼子里的动物的皮质酮数据与放置在大房间里的动物数据汇集在一起(图3B类，大型），因为它们之间没有显著差异。WT动物收集的这些数据（家庭笼子和大腔室）用作参考点（78±10 ng/ml，n个=6）所有其他实验组。皮质酮水平机械2−/年从笼子里抓出来的老鼠(n个=3）或在大体积描记室中停留1小时后(n个=3）显著升高（122±12 ng/ml，t吨（10）= 2.9,第页=0.017）相对于类似处理的WT小鼠。在小容积描记室中，皮质酮水平因束缚应激而显著升高（119±11 ng/ml，n个= 6,F类(3,19)= 6.4,第页=0.046）或TMT暴露（131±11 ng/ml，n个= 5,F类(3,19)= 6.4,第页=0.012）。同样，皮质酮水平在小容积描记室的束缚应激反应中显著升高（176±19 ng/ml，n个= 6,t吨（10）= 2.5,第页=0.032）或TMT暴露（208±16 ng/ml，n个= 5,F类(3,19)= 14,第页=0.004）英寸机械2−/年老鼠。突变体小鼠在两个小的(t吨（10）=2.7，第页=0.023）或更大(t吨(8)= 4,第页=0.004）室。服用安替拉明、WT和机械2−/年老鼠被放在大的(n个=3）或较小(n个=3）小室1小时。这对大室中WT小鼠的血皮质酮水平没有影响，但当放置在小室中时降低了皮质酮浓度(t吨(7)= 2.4,第页= 0.049). 然而，安替拉明预处理降低了机械2−/年小鼠在大室和小室中的浓度均达到（84±12 ng/ml，n个=6）与大腔室中的WT小鼠相当。安替拉明后，将动物置于大小房间中的皮质酮数据进行汇总，因为它们没有显著差异。

应激相关呼吸功能障碍机械2−/年老鼠体内

为了将呼吸表型与应激相关反应的分析相关联，我们从机械2−/年和WT小鼠在基础条件下（大腔室）、束缚应激下（小腔室），暴露于TMT（0.5μl）后，以及在给予CRHR1拮抗剂安他拉明（10 mg/kg，i.p.）后将动物置于大腔室或小腔室时。如中具有代表性的容积描记记录所示图4A类,机械2−/年具有早期呼吸表型的小鼠在大体积描记室清醒时呼吸模式不稳定(n个= 6; 呼吸暂停，4.2±0.4/min，t吨（10）= 5.1,第页< 0.001; 频率变化系数，0.44±0.04，t吨（10）= 3.4,第页=0.007）与WT相比(n个=6，呼吸暂停，1.8±0.26/min；频率变化系数，0.27±0.03）。即使是WT在置于小体积描记室时也有不规则的呼吸模式(n个=6；呼吸暂停，3.9±0.38/min，F类(3,19)= 7.2,第页= 0.004; 频率变化系数，0.41±0.04，t吨（10）= 3.1,第页=0.011）或暴露于TMT时(n个= 5; 呼吸暂停，3.5±0.47/min，F类(3,19)= 7.2,第页= 0.027; 频率变化系数为0.43±0.05，F类(3,19)= 5.3,第页= 0.04). 同样，当置于小容积描记室中时，这些呼吸模式的不规则性会加剧(n个= 6; 呼吸暂停，7.8±0.87/min，F类(3,19)= 12.5,第页= 0.018; 频率变化系数，0.64±0.05，F类(3,19)= 11,第页=0.048）或暴露于TMT时(n个= 5; 呼吸暂停，7.7±1.15/min，F类(3,19)= 12.5,第页= 0.019; 频率变化系数，0.68±0.06，F类(3,19)= 11,第页=0.016）英寸机械2−/年老鼠。突变小鼠的这些呼吸模式不规则性的增加明显大于野生型小鼠(t吨（10）= 3.9,第页=0.003）和较大(t吨(8)= 3.4,第页=0.009）室暴露于TMT后。请注意，这些数据对解释RTT小鼠模型体积描记法研究中的呼吸异常程度具有指导意义，因为呼吸模式紊乱的严重程度与测量仪器相关的压力量有关。WT服用安替拉明增加了小室内呼吸模式的规律性（呼吸暂停，2.2±0.42/min，F类(3,19)= 7.2,第页= 0.021; 频率变化系数，0.27±0.04，t吨（10）= 2.8,第页=0.019），在大腔室中没有显著差异。安他拉明给药机械2−/年增加呼吸模式的规律性(n个= 6; 呼吸暂停，2.4±0.45/min，F类(3,19)= 12.5,第页与小腔室相比<0.001；t吨（10）= 3,第页与大腔室相比=0.014；频率变化系数，0.34±0.04，F类(3,19)= 11,第页=0.002（与小腔室相比）。服用安他拉明后，呼吸模式（呼吸暂停、，t吨（10）= 0.4,第页= 0.69; 频率变化系数，t吨（10）= 1.2,第页=0.25）WT和机械2负极/年人口数据如所示图4B类呼吸暂停次数和频率变化系数机械2−/年小鼠在各种实验条件下处于疾病早期。然后，我们将呼吸表型的严重程度（即每分钟呼吸暂停和频率变异系数）与压力测量值（血皮质酮水平）进行对比机械2−/年不同应激诱导实验条件下小鼠早期疾病的测定(n个= 20). 每分钟呼吸暂停和呼吸频率变异系数的相关系数分别为0.87和0.83(图4C类;第页< 0.001). 所有数据表明，呼吸异常与应激水平相关（如血液皮质酮水平所示）。

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WT和早期的呼吸模式机械2−/年小鼠对压力的反应。A类，代表性全身容积描记记录机械2−/年小鼠早期在大室、小室清醒，暴露于TMT（大室0.5μl），或服用安替拉明（Anta；给药后40分钟，小室静脉注射10 mg/kg）。B类，显示WT和早期每分钟呼吸暂停次数和频率变异系数的人口数据机械师−/年小鼠安静清醒期间(n个=6个）和小型(n个=6个）容积描记室，暴露于TMT（在大室中，n个=5个）或在大鼠体内放置前服用安替拉明(n个=3个）或小腔室(n个=3个）。纳秒第页≥ 0.05,+第页<0.05，以及*第页两组间<0.01。C类，呼吸功能障碍严重程度（呼吸暂停分钟、频率变异系数）与应激措施（血皮质酮水平）之间的相关性机械2−/年老鼠。来自大腔室的数据(n个=3），小室(n个＝6）、TMT暴露（在大腔室中，n个=5），以及抗凝血酶治疗（在大小室中，n个=3个）汇集在一起进行分析。呼吸频率与血皮质酮水平的相关系数分别为0.87和0.83第页< 0.001.

图5A类显示了机械2−/年在睡眠中出现明显呼吸暂停的后期阶段。图5B类显示了安静清醒和睡眠期间的呼吸暂停次数和变异系数的人口数据机械2−/年具有晚期呼吸表型的小鼠。服用安替拉明（10 mg/kg，i.p。，n个=5）部分减少了呼吸暂停的次数(F类(2,16)= 22,第页=0.007）和呼吸不规则(F类(2,16)= 18,第页=0.024）清醒时机械2−/年老鼠。在安替拉明的作用下，机械2−/年老鼠(n个=5）仍有不规则呼吸模式（呼吸暂停，3.9±0.88/min，F类(2,16)= 22,第页= 0.048; 频率变化系数，0.45±0.07，F类(2,16)= 18,第页=0.047）与WT相比(n个= 9; 呼吸暂停1.7±0.21/min；频率变化系数，0.27±0.023）小鼠清醒时。此外，服用安替拉明并没有显著减少呼吸暂停的次数(F类(2,16)＝16，第页=0.86）和呼吸不规则(F类(2,16)＝13，第页=0.44）睡眠期间机械2−/年老鼠(n个= 5).

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晚期呼吸模式机械2−/年小鼠对CRHR1阻滞剂安替拉明治疗的反应。A类，代表性全身容积描记记录机械2−/年在对照条件下，小鼠在睡眠后期的大房间中睡觉，以及服用安替拉明（Anta；10 mg/kg i.p.）后40分钟。B类，显示每分钟呼吸暂停和变异系数的人口数据机械2−/年小鼠安静清醒时和睡眠后期，在大容积描记室中进行或不进行抗凝血酶预处理。n个=WT为9，n个=5，用于机械2−/年;纳秒第页≥ 0.05,+第页< 0.05, *第页<0.01，以及#第页两组之间<0.001。

接下来，我们测试了持续20天（从P32开始）的慢性抗凝血酶治疗（每天一次性腹腔注射10 mg/kg）是否可以延长患者的生命机械2−/年老鼠。如所示图6A类，略有但显著增加(第页=0.018，卡普兰-迈耶对数库试验）机械2−/年P75±P4组(n个=13）从P63±P2(n个=25）在未治疗/车用治疗组。Antalarmin治疗对随着年龄增长而出现的体重减轻没有显著影响机械2负极/年老鼠(图6B类).

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安替拉明治疗对WT和WT患者寿命和体重增加的影响机械2−/年老鼠。A类、存活重量百分比和机械2−/年经溶媒（生理盐水中5%二甲基亚砜）和安替拉明（10 mg/kg，i.p.，每天从P32开始）治疗后的年龄小鼠。B类，WT体重(n个= 7),机械2−/年载体治疗后P39和P52小鼠(n个=5）和安替拉明治疗后(n个= 6).纳秒第页≥0.05时，+第页< 0.05, *第页<0.01，以及#第页两组之间<0.001。

机械2−/年小鼠出现渐进性呼吸功能障碍就地

根据我们的观察，睡眠期间呼吸正常，呼吸不稳定程度与早期的行为状态（如压力水平）之间存在明显的相关性机械2−/年我们假设机械2−/年发生在疾病进展早期的小鼠并不是由呼吸节律发生的固有问题引起的。为了验证这个假设，我们检查了WHBP降低所产生的呼吸模式。该制剂产生了一种强健的呼吸模式，而不受来自脑桥上脑结构的行为和状态依赖性输入的影响。如所示图7,A类和B类来自WT的WHBP(n个=5）和早期机械2−/年老鼠(n个=4）从膈神经记录到的规则呼吸模式。没有区别(F类(3,13)= 7.3,第页=0.89）中的窒息次数机械2−/年（0.96±0.22/min）和WT（0.67±0.16/min）小鼠。相反，有更多的中枢性呼吸暂停(F类(3,13)= 7.3,第页与WT相比=0.007，第页=0.039，与早期相比机械2−/年)晚期分离的WHBP机械2−/年小鼠（2.2±0.38/min，n个=5），其中完整动物在清醒和睡眠期间均出现呼吸暂停(图7C类). WHBP中枢节律活动的缺陷不受安他拉明（1mg/100ml，n个= 3; 呼吸暂停，2.0±0.29/min，F类(3,13)= 7.3,第页= 0.99). (图7D类). 人口数据如所示图7E类.

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灌注产生的呼吸节律就地WT和机械2−/年早期和晚期小鼠。P59 WT雄性大鼠膈神经（Phr）的完整记录和原始记录(机械2+/年) (A类)，第36页机械2−/年（早期）(B类)，第44页机械2负极/年（后期）(C类)和相同的WHBP制剂(D类)应用CRHR1拮抗剂安他拉明（1 mg/100 ml）后(C类).E类，显示每分钟呼吸暂停次数的人口数据。n个=WT的5、4、5和3，早期机械2−/年，后期机械2−/年安塔拉明之前和后期机械2−/年分别在安替拉明存在下。纳秒第页≥ 0.05,+第页<0.05，以及*第页两组间<0.01。

讨论

本纵向研究机械2−/年小鼠表现出与呼吸行为有关的疾病进展，并表现出两个一般阶段。在早期阶段，呼吸模式的异常仅限于清醒状态，应激刺激会加剧呼吸模式异常，CRHR1拮抗剂安他拉明可以缓解呼吸模式异常以及脑干呼吸网络的脑桥上下行输入信号被清除。在后期，呼吸异常更加严重，不再依赖于状态，并在脑干网络水平上表现出来。

早期

与之前的研究一致机械2−/年1-2个月大的小鼠出现明显的呼吸功能障碍(Viemari等人，2005年;Ogier等人，2007年;Stettner等人，2007年). 中枢性呼吸暂停最初只在清醒时发生。WHBP的数据与脑干呼吸网络在无桥上结构的情况下的正常输出一致。呼吸表型与焦虑水平之间存在明显的相关性。即使在基线条件下，机械2−/年相对于WT小鼠，小鼠具有升高的皮质酮水平和应激相关行为。这种差异随着被禁闭或暴露于与捕食者相关的危险气味的额外压力源而加剧。服用安替拉明后，皮质酮释放、应激相关行为和呼吸表型减少，明显参与了CRHR1信号传导。这些数据与先前关于RTT小鼠模型焦虑加剧的报道一致(Gemelli等人，2006年;Fyffe等人，2008年;Adachi等人，2009年). 杏仁核是通向脑干和下丘脑的主要含CRH通路的来源，杏仁核和终纹床核的输入是提供压力相关呼吸调节的候选信号(Swanson等人，1983年;Sakanaka等人，1986年;格雷和宾格曼，1996年;Pitkänen等人，1997年;Chen等人，2000年). 这一点得到了靶向药物治疗小鼠应激水平显著增强的支持机械2这些区域中的删除(Fyffe等人，2008年;Adachi等人，2009年).

与安替拉明类似，一些药物干预可降低RTT小鼠模型的呼吸表型。其中包括去甲肾上腺素转运体抑制剂去甲肾上腺素(Roux等人，2007年;Zanella等人，2008年)苯二氮卓类咪达唑仑和地西泮(Voituron和Hilaire，2011年;Abdala等人，2010年)，5-HT受体拮抗剂8-OH-DPAT[8-羟基-2（di-n个-丙胺基）四氢吡啶]、GABA摄取抑制剂NO-711（1-[2（[（二苯亚甲基）亚氨基]氧基）乙基]-1,2,5,6-四氢-3-吡啶甲酸盐酸盐）和GABA受体功能的正调节剂L-838417[3-（2,5-二氟苯基）-7-（1,1-二甲基乙基）-6-[（1-甲基-1H（H）-1,2,4，-三唑-5-基）甲氧基]-1,2,4-三唑[4,3-b]哒嗪](Abdala等人，2010年). 值得注意的是，这些药物还具有镇静、催眠和/或抗焦虑的特性(Brady等人，1991年;De Vry等人，1993年;Dalvi和Rodgers，1996年;Centeno和Volosin，1997年;鲁道夫等人，1999年;Santibañez等人，2006年). 因此，可能是焦虑效应和呼吸细胞核异常神经递质信号的特异性靶向作用的结合导致了有益的影响。

后期

随着病情的发展，睡眠和清醒时会出现呼吸暂停。在缺氧和高碳酸血症的情况下，吸气频率和呼吸模式的不稳定性也显著增加。服用安替拉明并不能缓解睡眠中出现的呼吸暂停。WHBP的记录表明，呼吸暂停起源于脑干水平，不依赖于桥上结构的破坏性调节输入。这些数据与观测结果一致Ward等人（2011年）有选择地删除和恢复机械2在小鼠脑干神经元中的表达。RTT模型的基线过度换气依赖于髓上输入，但对缺氧的异常反应和晚期疾病自主控制的严重障碍需要脑干机械2删除。

Stettner等人（2007）从40岁儿童分离出的WHBP中报告的中枢性呼吸暂停和吸气后迷走神经放电异常机械2−/年老鼠(Guy等人，2001年). 该阶段对应于呼吸表型的晚期机械2负极/年RTT模型与晚期出现的心律失常中心缺陷相一致。然而，有一份报告声称青少年有一个主要缺陷机械2−/年在出现呼吸暂停或呼吸不规则的迹象之前(Viemari等人，2005年). 这一解释是基于从P14–P21分离出的具有不明确口-口交界的厚髓质切片的记录机械2−/年产生节奏性爆发的老鼠体外试验。体内分离骨髓切片的小鼠均未表现出呼吸表型。此外，两组患者的呼吸暂停次数、频率、幅度或节律性运动爆发持续时间在统计学上没有显著差异机械2−/年和WT在体外准备工作。报告的唯一显著差异是机械2−/年切片，这被解释为提示早发性呼吸不稳定。

我们认为，一些与异常应激相关网络协同作用的因素有助于小鼠模型的晚期呼吸表型。RTT患者和小鼠模型中存在多种神经递质系统的渐进性扰动，包括乙酰胆碱、多巴胺、血清素、谷氨酸、GABA和P物质，所有这些都调节呼吸节律发生（综述见Katz等人，2009年;Roux和Villard，2010年). 令人惊讶的是机械2大多数特定类别的胺能神经元不会产生深刻的呼吸表型或早期致死(Samaco等人，2008年)根据之前的研究建议(Viemari等人，2005年). 更可能的是，呼吸表型是由多个神经调节缺陷和大脑组织多个层次上的广泛结构和功能变化共同导致的（有关综述，请参阅Neul和Zoghbi，2004年;Chahrour和Zoghbi，2007年;翁等人，2011年). 这包括大脑尺寸和重量的减小以及神经元密度和形态的变化，包括树突分支减少、轴突束化以及脊椎密度和形态变化。在功能上，神经元的放电特性、突触信号、突触事件的频率和幅度以及基础的抑制性和兴奋性突触传递都发生了变化。RTT中脑源性神经营养因子表达缺陷可能是与神经元存活和功能异常相关的关键因素之一，包括关键脑干呼吸核团(卡茨，2005年;Mironov等人，2009年;Kline等人，2010年;Schmid等人，2012年). 此外，损失机械2星形胶质细胞和小胶质细胞的表达似乎在RTT的进展中起着重要作用，特别是在呼吸和焦虑表型的发展中(Maezawa和Jin，2010年;Lioy等人，2011年;Derecki等人，2012年).

与RTT患者数据的相关性

MeCP2突变的雌性通常是镶嵌的，大约一半的细胞随机表达突变等位基因。这种缺失的异质性很可能解释了RTT患者呼吸异常的频谱，包括缓慢深呼吸、过度换气、中枢性呼吸暂停、屏气以及Valsalva和Cheynes-Stokes呼吸(Julu等人，2001年;Weese-Mayer等人，2006年). 具有均匀缺失的雄性小鼠模型只表达了这些模式的一个子集。关于睡眠和清醒时呼吸暂停的发生，许多RTT临床研究(Lugaresi等人，1985年;Marcus等人，1994年;Julu等人，2001年)报告睡眠状态下的规律呼吸，类似于我们在小鼠模型早期疾病中观察到的情况。然而，有报道称一部分患者在睡眠期间呼吸节律异常(Rohdin等人，2007年;d'Orsi等人，2009年)与机械2负极/年小鼠呼吸表型。也有数据表明，随着患者年龄的增长，睡眠期间会出现呼吸不规则(Schlüter等人，1995年).

据报道，与其他形式的精神发育迟滞相比，RTT患者出现焦虑加剧的频率更高(Sansom等人，1993年;Mount等人，2002年). 我们发现，在小鼠呼吸表型的早期阶段，焦虑水平和呼吸不稳定之间存在明显的相关性。此外，抗焦虑药物使患者的呼吸模式正常化机械2小鼠模型。这表明，对于那些焦虑明显升高且主要在清醒期间出现呼吸表型的患者，可能需要进行药物干预。最近的一项人体研究表明，服用耐受性良好的CRHR1拮抗剂可以减轻7.5%CO引起的焦虑2暴露，曝光(Bailey等人，2011年). 服用同样作用于RTT中受影响的神经调节系统的抗焦虑药可能是有益的。所面临的挑战是，由于该疾病的镶嵌性质以及单个患者体内可能发生年龄依赖性变化，具体的神经调节失衡将有所不同。对清醒-睡眠状态下的呼吸模式和缺氧反射反应的纵向研究将区分稳定的呼吸表型和髓质呼吸细胞核内神经元-胶质细胞异常发展导致的渐进性呼吸表型。此外，可能有一组RTT患者患有一种特殊的镶嵌型神经元缺陷，导致早期中枢性髓质呼吸缺陷，不能用抗焦虑药物有效治疗。将这些概念纳入未来呼吸表型的临床研究和有效药物治疗的战略发展中是很有意义的。

脚注

这项工作得到了国际Rett综合症基金会（IRSF）、安大略省Rett综合征基金会、加拿大卫生研究院和妇女儿童卫生研究所的支持。J.R.获得了IRSF的奖学金。J.J.G.和G.D.F.是阿尔伯塔创新基金资助的科学家。我们感谢桑德拉·凯利的技术帮助。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会