视皮层区MT的早期成熟依赖于视网膜下叶内侧部分的输入

程序。

P60以下的动物用异氟醚麻醉（0.5 L·min内1–2%⁻¹医用氧气），而老年动物最初通过肌肉注射Alfaxan（8 mg·kg⁻¹)和地西泮（3.0 mg·kg⁻¹). 麻醉后，给所有动物服用抗生素（普鲁卡因青霉素，25 mg·kg⁻¹（i.m.），并放置在恒温加热垫上的立体定向框架中，以保持核心体温在38°C。所有动物均用异氟醚维持麻醉（0.5 L·min内1–2%）⁻¹医用氧气）。手术是在无菌条件下进行的，在整个实验期间持续监测血氧水平、心率和温度（外科医生顾问生命体征监测）。

我们的神经追踪协议在前面已经描述过(华纳等人，2010年). 简言之，对于眼内注射，用与荧光示踪剂Alexa Fluor 488（CTb-AF488；Invitrogen）偶联的霍乱毒素亚单位b（CTb）的1%溶液标记视网膜神经节细胞。使用连接在10μl Hamilton微量注射器上的玻璃微移液管将示踪剂（3-5分钟内5-8μl）注入右眼玻璃体（参见图2).

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图2。

用于识别视网膜丘脑–MT和V1–MT通路的协议，以及视觉丘脑背核和视觉皮层区域的划分。为了证明通过LGN和髓核的非突触性视网膜丘脑-MT通路，使用钨棒将FB晶体插入MT区，并使用连接至10μl微量注射器的玻璃吸管将CTb-AF488注入对侧眼睛。A类,A′、LGN的Nissl物质染色冠状切片(A类)用于划分层，并确定FB标记的细胞和CTb标记的对侧眼传入纤维的位置(A′)从相邻部分。B类在冠状切片上进行Calbindin-D28k免疫标记，以标定髓核的亚核，尤其是Calbindin D28k阴性的PIm。B′然后检测相邻切片中FB和CTb-AF488的表达。血管(B类,B′，箭头）在图像之间进行匹配，以确保准确划分。C类，在幼年动物（小于P60）中检测非磷酸化神经丝免疫反应，以确保FB注射部位在MT区的正确位置（图中显示P18；星号表示FB晶体部位）。C′此外，对老年动物进行髓磷脂染色，以帮助划分MT区域，并确保FB晶体的准确放置。显示了下髓（PI）核的后部（PIp）和中央内侧（PIcm）部分以及外侧（PL）和内侧髓（PM）核。R、 罗斯特拉尔；五、 腹侧；五十、 横向。比例尺：A′（用于A′,A类),B类，1毫米；B′500微米；C′（用于C类,C′)，2毫米。

为了进行皮质注射，在左半球MT区进行开颅手术，并切除硬脑膜。这个窗口足够大，可以看到外侧沟（LS）和颞上沟（STS）的背侧范围，因此可以确定MT区的位置。使用LS和STS作为标志物，借助钝钨丝（参见图2). 新皮质首先用一片无菌的可吸收明胶膜（凝胶膜、法玛西亚和厄普约翰）覆盖，然后用硬脑膜覆盖。在开颅手术中取出的骨碎片在缝合前被替换并用组织粘合剂（Vetbond；3M）固定。给动物皮下注射葡萄糖盐水，一种止痛药（卡洛芬，4 mg·kg⁻¹南卡罗来纳州。；丁丙诺啡，0.01 mg·kg⁻¹和地塞米松（0.3 mg·kg⁻¹预防脑水肿。

为了检测枕状核和LGN通路中的神经元是否具有视觉反应，我们通过免疫组织化学分析了cFos蛋白的表达。黑暗适应16小时后(Sia和Bourne，2008年)在P14和成年时，在7天前进行过示踪剂注射的动物在黑暗中适应16小时，然后在实验室用150瓦的灯直接照射在笼子上，暴露45分钟，然后服药过量并经心灌注（见下面的组织学和免疫组化）。为了辨别真正的cFos蛋白上调，将受光刺激的动物与在黑暗适应后立即死亡的年龄匹配的动物进行比较。

组织学和免疫组织化学。

允许7天的示踪剂转运，随后给动物服用过量的戊巴比妥钠（100 mg·kg⁻¹)经心灌注0.1米肝素化PB，pH 7.2，然后在0.1中加入4%多聚甲醛米PB。在40μm的低温恒温器上对5个系列的大脑进行冠状切片。立即安装系列3，并使用Dako荧光安装介质盖住盖子。该系列用于绘制注射部位（MT区）、V1、LGN和髓核的CTb和FB荧光标记。绘图完成后，取下盖玻片，晾干切片，然后使用0.1%甲酚紫溶液对系列进行尼塞尔物质染色。系列5使用改良的加利亚斯（1979）滑动安装部分的银浸渍技术。尼塞尔物质和髓磷脂染色都有助于划分视觉皮层区域和层。

通过髓磷脂染色确定MT区（成人，重度髓鞘化区域；参见图2C′)或通过非磷酸化神经丝H（NNF；单克隆小鼠抗SMI-32；Sternberger单克隆；1:2000）标记（年轻大脑；参见图2C类). 使用参考点，如相应的血管和在进一步操作之前确定的MT区域内的位置，将其位置转移到FB注射部位的荧光显微照片上。为了标定髓核的亚核，根据我们先前描述的方案（参见图2B类) (华纳等人，2010年). LGN层（参见图2A类)，V1中的新皮质层（参见图5B类)以及区域MT、V1/V2边界和V1的层3C（参见图5A类)使用系列3 Nissl物质染色切片进行鉴定。系列4标记了出生后发育期间V1和MT区的parvalbumin（PV；多克隆兔抗parvalbumin；Swant；1:3000）表达(Bourne等人，2007年).

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图5。

在V1离散性视网膜异位区的3C层观察到快速的蓝色标记细胞投射到MT区。A类，P18动物V1（阴影区）冠状切面的数字化线条图，显示了FB标记区域的MT投射细胞（黑色三角形）的位置。B类，为了确认层流分布，使用了相邻的Nissl物质染色切片（图中的轮廓区域A类).C类，这使我们能够验证FB标记区域的MT投射细胞是否专门定位于层3C。中左下角的数字A类表示从尾极开始计数的节数。钙，钙质沟；WM，白质。比例尺：A类，1毫米；C类（用于B类,C类)，100微米。

细胞表型和视觉活动。

为了确定区域MT输入神经元是否为cFos（即刻早期基因蛋白产物）阳性，以及确定其神经元表型，我们进行了三重标记。对于PIm而言，这是FB-CalB-cFos和FB-PV-cFos，对于V1而言，这就是FB-NNF-cFos。在LGN中对FB-CalB、FB-PV和FB-cFos进行双重标记。在PBS中充分冲洗后，在室温下将切片在封闭溶液中培养1小时（7%正常山羊血清在0.3%Triton X-100清洁剂和PBS中）。将所有需要三重标记的切片（PIm和V1）与cFos（1:15000；Calbiochem）和CalB、PV或NNF抗体的混合物在4°C的封闭溶液中在摇床上培养16小时。在充分冲洗后，在室温下用山羊抗兔Alexa Fluor 594（1:800）混合液培养Fos和山羊抗鼠Alexa Fluor 488（1:800；冲洗；安装；和盖玻片。LGN切片与抗PV、CalB或cFos在4°C的封闭溶液中在摇床上孵育16小时，在充分冲洗后，在室温下在山羊抗兔Alexa Fluor 594（1:800）中孵育1小时，冲洗、安装并盖上盖子。

对于所有免疫组化分析，常规进行阴性（遗漏一级抗体）和阳性对照（V1/V2水平的成人组织），以确保免疫组化检测之间标记的一致性。

数据和图像收集。

使用蔡司Axioplan 2荧光显微镜检查荧光标记切片。使用20×或40×干物镜识别标记的神经元和视网膜终末，并使用数字化系统（MDPlot3；AccuStage）绘制其位置图。在明亮视野显微镜下拍摄丘脑背侧视觉核团和皮层的尼塞尔物质和髓磷脂染色切片。使用蔡司2.5×和5×Plan-Neofluar物镜获得显微照片（1300×1030 dpi），并使用连接至AxioVision软件（4.2版；蔡司）的蔡司AxioCam数码相机获得数字图像。在对PIm、LGN和V1进行标定后，将感兴趣区域的切片数字化图像与Illustrator（Adobe Creative Suite 4）中MDplot的结果进行对齐，以确定FB标记细胞的位置（参见图2B′)和视网膜输入，然后使用MDplot进行量化。表观荧光z（z）-使用Axio图像采集堆叠（10至20μm厚的堆叠，间隔0.5μm）。配备Plan Apochro Oil 63×/1.4透镜的Z1（蔡司）显微镜，由每个组合/动物的两个切片的三重和双标记细胞和终端组成。使用Axio图像对PIm中逆行标记的FB阳性细胞体周围视网膜传入纤维的结直肠化进行三维分析。Z1 Apotome显微镜（蔡司）。在整个光学平面上评估了颜色化z（z）-每个单元格的轴。所有图像都是使用Adobe Photoshop和Illustrator裁剪和调整大小的。

对区域MT输入的新的定量分析：区域MT中继细胞。

由于晶体的大小因动物而异，因此无法直接比较所有年龄段标记在感兴趣区域的细胞的绝对数量，而且我们没有关于不同年龄段PIm、V1或LGN中MT投射神经元区域终末密度的信息。我们假设MT区域所有层中的所有端子都占据了FB，因为FB注入芯和晕都会影响每个个体中的所有层。我们计算了每个感兴趣传入区（ROI）投射到MT区的神经元比例。例如，对于某一年龄段，PIm输入到MT区域的比例将由PIm/（PIm+V1+LGN）给出。利用这个比率，我们确定了每个地区在发展时期对MT面积的贡献。根据这些结果，我们通过合并P90之前（包括P90）和P90之后的受试者，比较了PIm和V1（V1/PIm）以及LGN（LGN/PIm）在P90之前和之后的输入与面积MT的比值。使用双尾Mann–Whitney进行统计比较U型测试，值为第页<0.05被认为是显著的。所有数据均以平均值±SEM表示。