钙激活蛋白酶钙蛋白酶介导的K-Cl共转运蛋白KCC2的活性依赖性裂解

大脑切片。

从出生后第15-20天的雄性Wistar大鼠制备急性400μm横向和冠状海马切片。在斩首之前，使用氟烷（Sigma）进行麻醉。快速取出大脑并浸入冰镇蔗糖基切割液中，该切割液含有（单位：m米)：87氯化钠，2.5氯化钾，0.5氯化钙₂，25氯化钠_三，1.25 NaH₂人事军官₄，7氯化镁₂，50蔗糖，和25d日-葡萄糖，与95%O平衡₂和5%CO₂使用Campden 7000smz振动切片机（Campden Instruments）切割切片。在实验开始之前，让切片在36°C下在含有（m）的溶液中恢复1 h米)：124氯化钠，3氯化钾，2氯化钙₂，25氯化钠_三，1.1 NaH₂人事军官₄，2百万硫酸镁₄，6氯化镁₂、和10d日-葡萄糖，与95%O平衡₂和5%CO₂.

为了进行质量控制，将来自特定动物的切片子集并行用于蛋白质分析和电生理记录（见讨论）。

定量免疫印迹。

如上所述制备用于免疫印迹的海马切片。在RIPA缓冲液（150 m米氯化钠、1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸、0.1%十二烷基硫酸钠和50 m米Tris-Cl，pH 8.0）与蛋白酶抑制剂混合物（完整的Mini-EDTA无蛋白酶抑制剂混合物；罗氏）。通过SDS-PAGE分离蛋白质。在含有80 m的SDS-PAGE样品缓冲液中进行加载米三重HCl、2%十二烷基硫酸钠、10%甘油、5.3%β-巯基乙醇和2%溴酚蓝。电泳分离后，蛋白质在含有25 m的转移缓冲液中电泳转移至硝化纤维素膜（PerkinElmer）米特里斯，192米米甘氨酸和10%甲醇，pH 8.3。TBST/牛奶中的膜被堵塞（20 m米Tris，150米米NaCl、0.1%吐温20和0.5%脱脂奶粉（pH 7.5）在室温下放置1小时。用TBST/牛奶中稀释的相应抗血清在冰箱中搅拌培养过夜。兔抗人KCC2（1:1000；针对大鼠KCC2的929–1045氨基酸残基饲养；路德维希等人，2003年)和兔抗-NTD-KCC2（1:2000；针对大鼠KCC2的氨基酸残基1-93饲养；Blaesse等人，2006年)用于KCC2和兔抗tubulin（1:2000；Nordic BioSite，目录号PRB-435P），用于神经元III类微管蛋白。

二级抗体，驴抗兔IgG辣根过氧化物酶偶联物（1:3000；GE Healthcare）和山羊抗鼠IgG Horsradish过氧化物酶偶联剂（1:3000，Dako），在室温下在TBST/牛奶中搅拌2–4小时。使用增强化学发光试剂盒（Pierce）和LAS-3000文件系统（Fujifilm）检测免疫反应性。

化学发光信号的定量通过高级图像数据分析软件（Raytest）或ImageJ进行(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/). 所有测量值均在相机灵敏度的线性范围内。量化后，使用Paint Shop Pro X（Corel）对图中包含的代表性图像进行亮度和对比度优化。

体外钙蛋白酶裂解试验。

将大鼠脑匀浆稀释至约1-2 mg/ml蛋白质，最终体积为500μl（通过DC蛋白质检测试剂盒进行评估；Bio-Rad）。在钙蛋白酶分析缓冲液（100 m）中以31.5 U/ml的浓度添加大鼠钙蛋白酶-2（即m-calpain；Calbiochem）米HEPES，50米米氯化钠，0.1%Triton X-100，20 m米氯化钙₂，和20米米二硫苏糖醇）。通过添加0.1，在10、20或30分钟后停止裂解反应米EDTA和蛋白酶抑制剂（完整的无EDTA的迷你蛋白酶抑制剂混合物；罗氏）。在一些实验中，钙蛋白酶-2与100μ米MDL-28170持续5分钟。

钙蛋白酶激活的离子霉素测定。

直接提高细胞内钙²⁺浓度（[Ca²⁺]_我)，用50μ米离子霉素（Ascent Scientific），钙²⁺离子载体，在32°C下放置4小时。用离子霉素和30μ米MDL-28170与MDL-2817030预孵育30分钟。

表面表达分析。

最近开发的蛋白酶方法(Khirug等人，2010年;Ahmad等人，2011年)用于分析KCC2的表面表达。简单地说，用鳕鱼胰蛋白酶（Zmetech）处理横向海马脑片，这种蛋白酶在低温下保持活性，同时阻止膜蛋白的运输。切片在冰上与鳕鱼胰蛋白酶（2 U/ml）孵育60分钟。通过加入胰蛋白酶抑制剂苯基甲基磺酰氟（100μ米; 冰上5分钟）。均质后，在6%丙烯酰胺凝胶上分离30μg蛋白质，并如上所述进行免疫印迹分析。

电生理记录。

使用EPC 10放大器和Pulse软件（HEKA），在32°C下对视觉识别的CA1锥体神经元进行细胞贴附和全细胞斑贴记录。贴片吸管由硼硅酸盐玻璃（哈佛仪器）制成，其电阻范围为4.5至6.5 MΩ。吸管溶液包括（单位：m米): 30N个-甲基-d日-葡聚糖-HCl、95 K-葡萄糖酸盐、1 EGTA、5 HEPES、10d日-葡萄糖、2 Mg-ATP、20蔗糖、0.1 Alexa Fluor 488、2 NaOH和5.4 KOH，pH 7.3。对于记录，将切片放置在浸没式记录室中，并以3.5ml/min的速率用含有（单位：米)：124氯化钠，3.5氯化钾，2氯化钙₂，25氯化钠_三，1.1 NaH₂人事军官₄，2百万硫酸镁₄、和10d日-葡萄糖，与95%O平衡₂和5%CO₂pH值7.4。根据计算的液结电位校正膜电位值(巴里，1994年). 省略镁可诱导类干预活性²⁺在恢复后和录音期间从细胞外溶液中提取(安德森等人，1986年;Mody等人，1987年;Rivera等人，2004年). 一些切片在0-Mg条件下未能产生类发作间期活性²⁺因此，在使用电流灯进行全细胞记录和免疫印迹之前，活性得到了验证我=10μ存在时，电池连接模式下的0配置米布美他尼和1μ米CGP 55845。在大多数情况下，KCC2介导的Cl⁻挤压（见下文）是在0-Mg条件下每片一个细胞中测量的²⁺条件，当记录两个细胞时，仅在第一个细胞中评估网络活动。使用WinEDR软件分析峰值频率（英国格拉斯哥斯特拉斯克莱德大学John Dempster博士）。在使用钙蛋白酶抑制剂MDL-28170的实验中，用30μ米MDL-28170在Mg之前完成²⁺被省略。暴露于30μ米MDL-28170或100μ米环己酰亚胺在整个实验中保持不变。在0.5μ米TTX（Ascent Scientific），10μ米CNQX（Ascent Scientific），10μ米布美他奈和1μ米CGP 55845。密封破裂后，让每个神经元与移液管溶液平衡至少5-10分钟。接受接触电阻稳定在10-20 MΩ之间、静息膜电位低于−55 mV的细胞进行分析。KCC2介导的Cl的疗效⁻根据Δ量化挤压E类_GABA公司，它被测量为GABA反转电位之间的差值_一-介导电流(E类_GABA公司)在胞体和沿顶端树突50μm处(Khirug等人，2010年). 将膜电位保持在−50 mV，以减少向外泄漏Cl的驱动力⁻电导，并将其对测量Cl的贡献降至最低⁻挤压。在当前条件下，Cl⁻30m荷载米将生成E类_GABA公司根据Goldman-Hodgkin–Katz电压方程计算得出的−39.5 mV(Farrant和Kaila，2007年). 事实上，体细胞的对照测量E类_GABA公司产生−40.7±0.41 mV的值(n个=26），证明体细胞[Cl⁻]_我的CA1锥体神经元被钳制在[Cl⁻]移液管。因此，在这些条件下，枝晶的负偏差E类_GABA公司从体值（即ΔE类_GABA公司)是Cl功效的定量测量⁻挤压(Jarolimek等人，1999年;Khirug等人，2005年). 体细胞和树突状细胞E类_GABA公司通过以5 mV的增量和10 s的步长间隔在不同的保持电位下依次夹紧膜电位，从电流-电压关系中确定值。在每个电压阶跃开始后50 ms，对笼状GABA进行光解，以激发局部GABA_一接收器介导电流(Khirug等人，2005年). 至此，1米米通过配备注射器和100μm内径石英针（WPI）的UltraMicroPump II以1–2μl/min的流速输送溶解在细胞外溶液中的DPNI标记GABA，并使用连续发射二极管激光器（Excelsior 375；光谱物理）的375 nm输出进行局部光解。使用电子快门（AA光电）将激光脉冲的持续时间设置为10 ms，使用LUMPlanFI 60×浸水物镜（Olympus）将～10μm的非老化点聚焦在胞体或50μm以外的顶端树突上。为了准确测量与躯体的距离，使用贴片吸管对Alexa Fluor 488（生命科技）进行透析，并使用Radiance 2100共焦显微镜（Bio-Rad）追踪树突。