谷氨酰胺酶C调节小胶质细胞激活和促炎性外体释放：与阿尔茨海默病发病机制的相关性

质粒转染治疗GAC过度表达

商业购买了表达人类KGA和GAC的质粒（Jikai，Inc.）。根据制造商的说明，将培养的小鼠小胶质细胞用表达KGA或GAC的质粒转染Lipofectmine2000（LifeTechnologies，Inc.）48小时，然后收集进行进一步分析。

蛋白质提取和蛋白质印迹

小鼠被安乐死，大脑被移除并用均质器在含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的M-PER蛋白质提取缓冲液（Pierce）中均质。用BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce）测定蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离来自组织裂解物的蛋白质（5–10μg）或来自细胞裂解物的蛋白（20–30μg），并将电泳转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore和Bio-Rad）。膜与CD86（兔子，猫#ab86392，Abcam，1:1000）、GLS1（兔子，猫咪#ab156876，Abcam，1:1000，或β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）在4°C下过夜，然后用辣根过氧化物酶连接的二级抗兔或抗鼠抗体（细胞信号技术，1:10000）孵育。抗原-抗体复合物通过Pierce ECL Western Blotting Substrate（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，United States）进行可视化。为了进行数据量化，使用CanonScan 9950F扫描仪扫描胶片；使用免费公共领域NIH ImageJ程序对采集的图像进行分析¹.

酶联免疫吸附试验（ELISA）

收集培养的原代小鼠小胶质细胞（有/无GAC过度表达）的血清，并根据制造商的协议，使用商用ELISA试剂盒（cat#50349-MNAE，Sino-Biological）测量促炎细胞因子TNF-α。

免疫化学

如前所述进行免疫化学(Ma等人，2019). 简而言之，细胞或组织切片在4%多聚甲醛（Sigma）中在室温（RT）下固定15分钟，用PBS（Thermo Fisher Scientific）洗涤3次，并在室温下用含有5%山羊血清（Vector Laboratories）和0.2%Triton X-100（Bio-Rad）的PBS渗透和封闭缓冲液培养1小时。固定细胞或组织切片与Iba1（山羊，cat#ab5076，Abcam，1:500）、GLS1（兔子，cat#ab156876，Abcan，1:2000）、GFAP（兔子，猫#Z0334，DAKO，1:500，）或神经元特异性III类β-微管蛋白（Tuj1，兔子，猫#T2200，Sigma-Aldrich，1:500。第二天，用PBS清洗细胞或组织切片，并用二级抗体（分子探针）在RT培养1小时。用DAPI（Sigma-Aldrich）对细胞进行反染。使用配备数字成像系统的尼康Eclipse E800显微镜拍摄图像，并导入Image-Pro Plus 7.0版（媒体控制论）进行量化。对每组15个随机选取的区域中的600-1000个免疫染色细胞进行计数。

RNA分离和qPCR分析

用DNase I消化（Qiagen）纯化试剂盒（Fermentas）分离总RNA，去除基因组DNA。信使RNA衍生的cDNA是使用转录因子第一链cDNA合成试剂盒（Roche）通过寡核苷酸启动产生的。RNase抑制剂用于防止降解。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）和特定引物集进行扩增(补充表S1). GAPDH用于所有mRNA表达水平的标准化。

用Amplex红谷氨酸/谷氨酸氧化酶试剂盒分析谷氨酸

根据制造商的说明，使用Amplex红谷氨酸/谷氨酸氧化酶测定试剂盒（Invitrogen，A12221）测定小胶质细胞培养物中的细胞内和细胞外谷氨酸水平。对于细胞内谷氨酸测定，在进入测定之前，将细胞蛋白裂解物稀释至相同的蛋白浓度。对于细胞外谷氨酸测定，在测定前24小时将培养基更换为无酚红培养基，并将相同体积的上清液输入测定。

外显子的分离

如前所述，从无血清小胶质细胞培养物中分离出外显子(Wu等人，2018年). 采用梯度超速离心法分离外泌体。简单地说，将细胞种植在聚鸟氨酸/层粘连蛋白涂层的10 cm培养皿上并培养12 h。首先，将上清液在300×克去除游离细胞10分钟，然后在3000×克20分钟清除碎屑，10000×克30分钟去除细胞器。通过10万倍超速离心收集外显子克2小时。所有离心步骤均在4°C下进行。

纳米粒子跟踪分析（NTA）

外泌体的大小和数量如前所述确定(Wu等人，2018年). 简单地说，将小胶质细胞种植在聚鸟氨酸/层粘连蛋白涂层的10厘米培养皿上并进行培养。12小时后收集培养细胞的上清液，将收集到的外泌体重新悬浮在150μl PBS中，并在PBS中以1:100稀释。使用1毫升溶液进行NanoSight分析。NTA是在NanoSight NS300系统（英国马尔文仪器公司）上使用sCMOS相机完成的。测量条件设置为25°C，1 cP粘度，每个捕获帧25 s，测量时间60 s。为了测量外泌体的大小和浓度，进行了三次单独的测量。

GAC在炎症前小胶质细胞中特异性上调

为了研究在促炎和抗炎状态下GAC的表达是否发生改变，我们用LPS（100 ng/mL）、IL-4（50 ng/mL）或IL-10（50 ng/mL）处理培养的小鼠小胶质细胞，分别诱导小胶质细胞的促炎、抗炎和失活表型。小鼠小胶质细胞的富集通过Iba1与胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物Tuj1的联合免疫染色来验证。几乎所有细胞都表达与Iba1相对应的免疫反应性，但不表达GFAP或Tuj1(补充图S2). LPS、IL-4或IL-10处理后6小时收集总RNA，24小时收集蛋白裂解物。促炎标志物肿瘤坏死因子-αmRNA水平(肿瘤坏死因子-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS系统)LPS治疗后显著升高，但两者均保持不变(肿瘤坏死因子-α)或减少(iNOS系统)IL-4或IL-10治疗后(图2A). 抗炎标志物CD206型和年1LPS处理的小胶质细胞减少，而IL-4处理的小神经胶质细胞增加(图2A). 重要的是通用汽车公司，但不是KGA公司，在LPS处理的小胶质细胞中显著升高，在IL-10处理的小神经胶质细胞中降低(图2B). 根据mRNA结果，蛋白分析显示LPS处理的小胶质细胞中GAC（而非KGA）和CD86增加(图2C、D). IL-10治疗增加了小胶质细胞CD206蛋白的表达，但降低了CD86、KGA和GAC蛋白的表达水平(图2C-E). 这些数据表明，GAC的表达与小胶质细胞的促炎表型之间存在着强烈的相关性，表明GAC可能参与小胶质细胞活化。

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图2

炎症前小鼠小胶质细胞中GAC的上调。（A–E）用LPS（100 ng/mL）、IL-4（50 ng/mL。治疗6小时后收集总RNA（A、B）24小时后收集蛋白裂解物（C–E）mRNA水平肿瘤坏死因子-α,iNOS系统,CD206型、和年1 （A）和KGA公司和通用汽车公司 （B）通过qPCR分析确定。数据标准化为GAPDH公司与对照组小胶质细胞相比呈折叠变化。误差条表示三次测量的标准偏差。CD86、CD206、KGA和GAC蛋白水平的代表性免疫印迹（C）如图所示，CD86、CD206（D）、KGA和GAC（E）蛋白表达水平归一化为β-actin，与对照小胶质细胞相比呈倍数变化。误差条表示三次测量的标准偏差。^*P（P）< 0.05,^∗∗P（P）< 0.01,^∗∗∗P（P）< 0.001,^****P（P）<0.0001，双尾t吨-测试(n个= 3). 实验分三次进行，每组5-7只P1小鼠。

GAC过度表达诱导小胶质细胞活化

为了验证我们的假设，即GAC足以诱导小胶质细胞活化，我们通过质粒转染在原代小鼠小胶质细胞中过度表达GAC。我们首先通过qPCR证实GAC确实在培养细胞中过度表达（增加60倍，图3A)和蛋白印迹（增加2倍，图3D、E). 接下来，我们检测了促炎和抗炎基因的表达，发现促炎基因的mRNA水平肿瘤坏死因子-α和iNOS系统在GAC过度表达的小胶质细胞中升高(图3B). 蛋白质分析显示GAC过度表达的小胶质细胞中TNF-α的释放增加，CD86的表达增加(图3C–E). 与促炎分子升高相反，抗炎分子的mRNA水平CD206型和年1发现在GAC过表达后减少(图3B). 与mRNA减少一致，蛋白分析显示GAC过度表达后小胶质细胞中CD206蛋白水平降低(图3D、E). 有趣的是，小胶质细胞中KGA的过度表达并没有激活小胶质细胞或引起神经炎症(补充图S3). 因此，这些数据表明，升高的GAC水平，而不是KGA水平，足以激活小胶质细胞并诱导小胶质细胞成为促炎表型。

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图3

GAC过度表达诱导小胶质细胞活化。（A–E）用GAC过表达质粒转染原代小鼠小胶质细胞48小时。收集总RNA和蛋白裂解物。mRNA水平通用汽车公司 （A）,肿瘤坏死因子-α,iNOS系统,CD206型、和年1 （B）通过qPCR分析确定。数据标准化为GAPDH公司与对照组小胶质细胞相比呈折叠变化。误差条表示三次测量的标准偏差。ELISA法测定小胶质细胞释放TNF-α的浓度（C）误差条表示三次测量的标准偏差。GAC、CD86和CD206的代表性免疫印迹（D）以及GAC、CD86和CD206蛋白表达水平的量化（E）数据归一化为β-肌动蛋白，并显示为与对照小胶质细胞相比的折叠变化。误差条表示三次测量的标准偏差。^*P（P）< 0.05,^∗∗P（P）< 0.01,^∗∗∗P（P）< 0.001,^****P（P）<0.0001，双尾t吨-测试(n个= 3). 实验分三次进行，每组5-7只P1小鼠在体外扰动。

GAC介导LPS诱导的小胶质细胞活化

为了进一步确定在LPS激活期间GAC活性是否对小胶质细胞的促炎性转化至关重要，我们使用谷氨酰胺酶抑制剂BPTES，在小胶质细胞接受LPS治疗时抑制GAC活性。将BPTES（10μM）添加到小胶质细胞培养物中1 h，然后用LPS（50 ng/mL）处理6 h。正如预期的那样，LPS处理显著增加了促炎标记物的mRNA水平肿瘤坏死因子-α和iNOS系统和BPTES取消了此类增加(图4A、B). 相比之下，LPS治疗显著降低了抗炎标记物的mRNA水平CD206型和年1然而，BPTES未能扭转这种下降(图4C、D). 这些结果表明，LPS通过提高GAC活性诱导小胶质细胞活化。

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图4

谷氨酰胺酶抑制剂治疗逆转LPS诱导的小胶质细胞活化。（A–D）在暴露于LPS（50 ng/mL）6小时之前，用或不用BPTES（10μM）处理小鼠小胶质细胞1小时。收集总RNA用于qPCR分析。mRNA水平肿瘤坏死因子-α （A）,iNOS系统 （B）,CD206型 （C）,年1 （D）通过qPCR分析确定。数据标准化为GAPDH公司与对照组小胶质细胞相比呈折叠变化。误差条表示三次测量的s.d。^∗∗P（P）< 0.01,^∗∗∗P（P）< 0.001,^****P（P）<0.0001，与对照小胶质细胞相比，双尾t吨-测试(n个= 3); 实验分三次进行，每组5-7只P1小鼠。

GAC诱导的小胶质细胞活化并非通过谷氨酸的自分泌

为了确定GAC过度表达是否通过谷氨酸的自分泌诱导小胶质细胞激活，我们首先测量了KGA或GAC过表达后小胶质细胞培养物中的细胞内和细胞外谷氨酸水平。在KGA和GAC过度表达的小胶质细胞培养中发现细胞内谷氨酸增加(图5A)但在KGA或GAC过度表达的小胶质细胞培养物中，细胞外谷氨酸没有显著变化，表明GAC并没有通过升高细胞外谷氨酰胺来调节小胶质细胞的激活(图5B). 为了进一步排除细胞外谷氨酸的影响，我们将不同剂量的谷氨酸直接添加到小胶质细胞培养物中24小时，发现额外的谷氨酸不会促进小胶质细胞的激活，反而会降低小胶质细胞mRNA水平肿瘤坏死因子-α,iNOS系统,CD206型、和年1浓度为100或300μM时(图5C). 蛋白质分析显示，向小胶质细胞培养物中添加谷氨酸后，CD86或CD206表达水平没有变化(图5D). 这些结果表明，尽管GAC过度表达足以诱导小胶质细胞活化，但活化与谷氨酸的自分泌无关。

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图5

GAC过度表达以谷氨酸依赖的方式诱导神经炎症。（A、B）细胞内谷氨酸水平（A）和细胞外谷氨酸水平（B）在对照组中，通过谷氨酸测定试剂盒测定KGA-和GAC-过表达的小胶质细胞培养物。（C）mRNA水平肿瘤坏死因子-α,iNOS系统,CD206型、和年1通过qPCR分析测定了不同剂量谷氨酸处理的小胶质细胞。数据标准化为GAPDH公司与对照组小胶质细胞相比呈折叠变化。（D）不同剂量谷氨酸处理的小胶质细胞中CD86和CD206蛋白水平的代表性印迹和定量。Western blot数据归一化为β-actin，并显示为与对照小胶质细胞相比的折叠变化。误差条表示三次测量的标准偏差。^*P（P）< 0.05,^∗∗P（P）< 0.01,^∗∗∗P（P）< 0.001,^****P（P）<0.0001，与对照小胶质细胞相比，双尾t吨-测试(n个= 3); 实验分三次进行，每组5-7只P1小鼠。

GAC过度表达加速小胶质细胞外显子释放

为了确定GAC介导的小胶质细胞活化的机制，我们研究了GAC过度表达后小胶质细胞的外体分泌。我们以前的研究表明，GLS1调节HIV-1感染的巨噬细胞和BV2小胶质细胞系中的胞外体释放(Wu等人，2018年). 为了研究GAC对原发性小胶质细胞外泌体释放是否具有类似的调节作用，我们检测了相同数量的小胶质细胞释放的外泌体内GAC过表达与否的浓度。首先，我们通过检测外显体标记CD-9和Flotillin-2的表达，验证了从GAC过度表达的小胶质细胞和对照小胶质细胞中分离的外显体(图6A). 这两组蛋白的裂解产物产生了CD-9和Flotillin-2的特异条带，证实了通过超离心成功分离外泌体。CD-9和Flotillin-2的定量分析显示，与对照组相比，GAC过表达组中CD-9与Flotillin2的水平较高，表明GAC对小胶质细胞外体释放有积极作用(图6B). 与外泌体标记物的数据一致，NTA显示，尽管GAC过表达组和对照组的外泌体大小相似(图6C)与对照组相比，GAC过度表达组的外显子浓度显著升高(图6D). 通过外显体的数量除以小胶质细胞板的数量计算每个细胞释放的外显体数量，发现对照小胶质细胞释放约100个外显体，而GAC过表达的小胶质细胞在48小时内释放120个外显体量(图6E). 我们假设培养物中的小胶质细胞数量没有改变，因为当小胶质细胞在0小时和48小时被对照或GAC过表达质粒转染时，没有观察到显著差异(补充图S4). 总之，我们的研究结果表明，GAC过表达增加了原发性小胶质细胞的外泌体释放。

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图6

GAC过表达增加了外泌体的释放。通过梯度超速离心法收集有和无GAC过度表达的小胶质细胞释放的外显子。（A、B）CD-9和Flotillin-2蛋白表达的代表性印迹和定量。（C–E）从培养上清液中分离出小胶质细胞释放的外泌体的大小和浓度，并通过NTA进行可视化（C）.外体浓度的量化（D）和每个细胞释放的外泌体数量（E）通过NTA执行。误差条表示三次测量的标准偏差。^*P（P）< 0.05,^∗∗P（P）<0.01，双尾t吨-测试(n个= 3). 实验分三次进行，每组5-7只P1小鼠在体外实验。

我们感谢李武女士、李玉菊女士、张艳艳女士和叶凌博士对手稿内容的宝贵技术支持、意见和建议。