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生物化学Soc Trans。作者手稿；2019年10月19日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
生物化学Soc Trans。2018年10月19日；46(5): 1191–1202.
2018年8月28日在线发布。 数字对象标识：10.1042/BST20170574
预防性维修识别码：PMC6581191型
美国国立卫生研究院：NIHMS1030508标准
PMID：30154093

哺乳动物DNA甲基转移酶：新发现和未决问题

胡迈拉·戈沃尔1和阿尔伯特·杰利奇2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

作为表观遗传网络的一部分，DNA甲基化是染色质结构和功能的主要调节因子。在哺乳动物中，它主要发生在回文CpG位点，但在非CpG部位也观察到不对称甲基化。三种酶参与DNA甲基化模式的产生和维持。DNMT1对半甲基化的CpG位点有很高的偏好性，DNMT3A和DNMT3B同样甲基化非甲基化和半甲基化DNA，也引入非CpG甲基化。在这里，我们回顾了对哺乳动物DNMT（DNA甲基转移酶）结构和功能的最新观察和新见解，包括DNMT1和DNMT3A的新结构、其机制、翻译后修饰的调控以及DNMT在细胞中的功能的数据。此外，我们还报道了关于染色质修饰和染色质蛋白对DNMT的变构调控和靶向的新发现。综上所述，本文总结的最新出版物有力地说明了该领域正在进行的研究的强度。它们加深了对DNMT关键机械特性的理解，但也记录了尚未解决的问题，这些问题需要在未来的研究中解决。

介绍

DNA甲基化是哺乳动物染色质结构的主要调节器。它是表观基因组网络的一个组成部分，与其他表观基因组修饰（最显著的是组蛋白尾部修饰）协同作用（综述：[1,2]). 在这篇综述中，我们收集了有关DNA甲基转移酶（DNMT）的结构和功能的新见解，重点关注哺乳动物酶。它是对DNA甲基化早期评论的更新[三,4]以及DNMT的结构和机制[5,6]. 最近发布的数据收集在这里以令人印象深刻的方式记录了这个“古老”领域正在进行的研究的强度。

在哺乳动物中，成年组织中的胞嘧啶残基甲基化水平在3.5%到4.5%之间，具体取决于细胞类型[7,8]. DNA甲基化主要发生在回文CpG位点，它存在于两条DNA链中(图1)，但也观察到非CpG位点的不对称甲基化（综述：[4,9,10]). 复制后，CpG位点的DNA甲基化可由DNMT1维持，DNMT1是一种维持甲基转移酶，对半甲基化的CpG部位有很高的选择性。相比之下，另外两种DNMT，即DNMT3A和DNMT3B，并不偏爱半甲基化靶位点。他们参与了从头开始生殖细胞发育和早期胚胎阶段DNA甲基化模式的产生。与DNMT1不同，DNMT3A和DNMT3B也引入非CpG甲基化。尽管DNA甲基化的建立和维持模型十分优雅，但最近的数据表明，该模型过于简化，所有DNMT与参与DNA去甲基化的TET 5mC羟化酶一起，通过甲基化的位点特异性增益和损失的动态平衡调节DNA甲基化水平（综述：[11]).

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人类细胞和发育过程中的DNA甲基化周期（改编自[11]).

DNA甲基化模式是在发育和生殖细胞分化过程中由从头开始甲基转移酶并通过维持甲基化保持DNA复制。DNA甲基化可以通过被动或主动去甲基化而丢失。通常，Dnmt1被认为是一种维护酶，而Dnmt3a和Dnmt3被认为是从头开始甲基转移酶（TET，十-十一易位酶；TDG，胸腺嘧啶-DNA糖苷酶）。

DNMT1酶的最新发现

DNMT1的结构和机理

与其他哺乳动物DNMT类似，DNMT1包含催化C末端和调节N末端部分(图2A). 催化结构域在所有细菌和真核生物DNA-（胞嘧啶C5）-甲基转移酶中都是保守的，所有这些酶都遵循从AdoMet向靶胞嘧啶碱转移甲基的共同催化机制（综述：[5,6,12]) (图2B). 这种机制涉及靶碱基翻转和胞嘧啶结合到催化囊中，氢结合到保守ENV基序的谷氨酸侧链。甲基化反应是由保守的PCQ基序（在DNMT3酶的情况下为PCN）的Cys残基攻击芳香环的C6位置引发的，该位置由谷氨酸的酸/碱催化支持。这一步骤之后，甲基转移到C5位置，并在未定义的碱（可能是水分子）的酸碱催化下解析共价酶-DNA复合物（综述：[5,12]). 含有这些催化残基的氨基酸基序在早期序列比对中被鉴定，并发现在所有此类酶中都是保守的（综述：[12,13]). 最近用DNMT1进行的动力学同位素效应研究证实了这一一般机制，表明甲基转移确实发生在活性位点Cys残基的攻击之后，甲基转移反应是酶的化学速率限制步骤[14].

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DNMT的一般特征。

（A）哺乳动物DNMT酶的结构域。人类DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白分别由1616、912、853和387个氨基酸残基组成。DMAPD，DNA甲基转移酶相关蛋白1相互作用域；PBD，PCNA-结合域；NLS，核定位信号；复制焦点靶向序列（RFTS）域；CXXC、CXXC域；BAH1和BAH2，溴邻同源结构域1和2；GK公司n个，甘氨酸赖氨酸重复序列；PWWP，PWWP域；ADD，ATRX-DNMT3-DNMT3L域（经[6]).（B）胞嘧啶C5 DNA甲基转移酶的催化机制（改编自[12]). ENV基序（基序IV）中的催化谷氨酸残基为棕色，PCQ基序（模序IV）的催化半胱氨酸残基为绿色，AdoMet为蓝色，甲基为红色。未确定最终质子提取的基础（以橙色显示）；它可能是一个水分子。

DNMT1的不同结构分析为通过自身抑制及其与染色质修饰的相互作用对DNMT1活性进行变构调控提供了有力证据（综述：[6]). 在没有DNA的情况下，DNMT1的结构表明RFTS结构域与催化结构域结合，从而封闭了DNA结合位点(图3A). 这表明DNMT1必须以至少两种不同的构象存在，一种是催化非活性状态，其中RFTS域阻断活性位点，另一种是催化剂活性状态，DNA在活性位点结合[15]. 在生化研究中还观察到RFTS结构域的动态自动抑制[16,17]进一步表明，RFTS结构域与催化结构域结合的减弱增加了DNMT1的活性[18].

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DNMT1结构。

（A）DNMT1脱辅基酶的结构[15]（pdb 3AV4）。RFTS结构域显示为绿色，CXXC显示为红色，BAH结构域显示为橙色和紫色，催化结构域显示为蓝色。（B）DNMT与半甲基化DNA复合物中截短C末端结构域的结构[21]（pdb 4DA4）。SAH显示为黄色，DNA显示为浅绿色。（C）翻转目标碱（Cyt）与DNMT1（C1339、E1369和R1315）活性中心袋中的催化残留物的相互作用。

含有CXXC、BAH和催化结构域的截短DNMT1的结构表明，非甲基化DNA特异性地结合到CXXC结构域，但不结合到催化结构域[19]. 基于这一观察结果，提出了一个额外的自动抑制模型，其中未甲基化的CG位点与CXXC结构域的结合将阻止其甲基化，这得到了动力学数据的支持。然而，CXXC结构域在DNMT1特异性中的作用尚不清楚，因为另一项研究表明，阻断其DNA结合的CXXC结构域突变不会改变全长DNMT1对半甲基化CpG位点的偏好[20].

在缺乏CXXC结构域的DNMT1 C-末端片段的结构中揭示了赋予半甲基化CpG位点特异性的分子相互作用，半甲基化DNA以催化活性构象结合[21] (图3B). 在这个结构中，DNMT1与其甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对的靶序列形成了几个碱基特异性接触，这些碱基对生物化学研究中的催化作用至关重要[22]. 靶胞嘧啶从DNA螺旋中翻转出来并结合到蛋白袋中，蛋白袋中呈现了上述所有DNA-（胞嘧啶C5）-甲基转移酶中保守的活性位点残基(图3C). 来自催化环和识别环的侧链通过两个凹槽插入DNA，填充了碱基翻转所清空的空间。半甲基化CpG位点的5mC甲基接近由催化域残基形成的疏水囊，这解释了DNMT1对半甲基化位点的偏好。这项研究支持了先前的生物化学观察，表明DNMT1催化结构域对半甲基化DNA具有内在的特异性[20]. DNA的其他构象变化被观察到，包括另一个碱基的翻转，尽管这些观察结果没有得到生化研究的支持[22].

有趣的是，DNMT1的各种结构在活性位点环之后的α-螺旋的精确构象上有所不同，活性位点环要么采用扭结构象（在非活性络合物中），要么采用直构象（DNMT1与半甲基化DNA的络合物）。结合MD模拟的突变研究可以确定两个残基，其突变影响这些构象转换并导致催化活性降低[23]展示了DNMT1的动态构象变化对催化的重要性。

DNMT1的UHRF1相互作用

UHRF1属于RING-finger型E3泛素连接酶家族。观察到，UHFR1与DNMT1和PCNA在复制异色区共定位，而DNMT1与染色质的关联在UHRR1敲除（KO）细胞中丢失[24,25]这些关键发现激发了对染色质修饰、其他染色质因子和DNMT1活性之间的串扰的许多后续研究。UHRF1 KO对小鼠具有胚胎致死性，UHRF1缺陷的胚胎显示全基因组DNA甲基化水平显著降低，表明UHRF1在维持DNA甲基化中具有重要作用[24,25]. 这些观察结果导致了一种模型，即UHFR1招募DNMT1复制半甲基化DNA，以促进其有效的再甲基化。PCNA和UHRF1在DNMT1靶向中的合作已经被证明，DNMT1–PCNA融合蛋白的表达可以在没有UHRF1的情况下挽救DNA甲基化[26].

与DNMT1一样，UHRF1也是一种巨大的多域蛋白（综述：[6]). DNMT1–UHRF1相互作用的结构、机制和功能细节已经过密集调查，显示出复杂和多方面的机制。UHRF1通过与DNMT1 RFTS结构域的相互作用刺激DNMT1的催化活性，这似乎打开了自抑制构象[17,27]. UHRF1通过其SET和RING相关结构域与半甲基化DNA结合（综述：[28]). 此外，其串联Tudor结构域（TTD）和植物同源结构域（PHD）在协同反应中结合H3K9me3[29,30]. UHRF1与H3K9me3的结合是UHRF1定位到异染色质和维持DNA甲基化所必需的，因为TTD中的突变阻止了UHRF1和H3K9 me3的连接，从而取消了这两种功能[31,32]. 然而，最近的研究表明，具有突变H3K9me3结合位点的UHRF1基因敲入超高频1缺失细胞导致DNA甲基化几乎完全恢复，表明UHRF1的H3K9me3结合位点对DNA甲基化不是必需的[37]. 破坏UHRF1的PHD结构域中的H3R2结合囊（H3尾部结合所需）也可通过DNMT1消除细胞中的DNA甲基化[33]. 最近，PRMT6（一种在癌症中经常上调的酶）对H3R2的甲基化也被证明可以破坏UHRF1结合并维持DNA甲基化[34]. 当ESCs从血清转化为2i介质时，在DNA整体去甲基化过程中观察到H3K9me2和UHRF1的表达减少，表明这两个过程之间存在联系[35]. Zscan4通过UHRF1–DNMT1轴调控DNA甲基化也与端粒伸长的控制有关[36].

UHRF1环结构域泛素化H3在K14、K18和K23的E3连接酶活性[33,38–40]. 在DNMT1的N末端部分发现了泛素相互作用基序，表明它对DNA甲基化至关重要体内[33]. 最近，两篇论文显示了DNMT1 RFTS结构域的结构，该结构域由来自双泛素化H3尾（K18和K23）的两个泛素部分所丰富[39,40] (图4A). 在全长DNMT1的背景下，这种结合必须导致RFTS结构域的重排，这可能触发DNMT1活性的刺激，再次强调RFTS结构区介导的自身抑制在DNMT1调控中的中心作用。此外，还报道了UHRF1的泛素样结构域与DNMT1的同一位点的直接结合[40].

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DNMT与染色质修饰的相互作用。

（A）DNMT1-RFTS结构域（绿色）与在K18和K23泛素化的H3肽（以黄色显示）的复合物的结构[39]（pdb 5WVO）。泛素部分被染成红色和淡红色。为了说明这一点，RFTS结构域被DNMT1脱辅基酶的结构所覆盖，其颜色和取向如图3A.（B）DNMT3A/3L异四聚体中DNMT3A ADD结构域与催化DNMT3A-结构域（蓝色）的结合[55]（pdb 4U7P和4U7T）。ADD结构域显示为自抑制构象（橙色），结合肽（黄色）显示为催化活性变构构象（红色）。

PTM对DNMT1的调节

除泛素化外，DNMT1上还发现了其他几个PTM（综述：[6]). 例如，DNMT1主要在晚期S期通过SET7/9在K142处单甲基化，以细胞周期依赖的方式促进甲基转移酶的蛋白酶体降解[41]. 最近，有研究表明L3MBTL3蛋白结合K142甲基化DNMT1并触发其泛素化和蛋白水解[42].

细胞周期中DNMT1的丰度也受乙酰转移酶Tip60催化的DNMT1 GK连接子中赖氨酸残基的乙酰化调节[43,44]. GK乙酰化导致UHRF1泛素化DNMT1，导致其在DNA复制结束时蛋白酶体降解。反过来，组蛋白去乙酰化酶1增加DNMT1的稳定性[43,44]. 这种作用是通过GK连接子的去乙酰化，然后USP7氘化酶与DNMT1结合来实现的，这可以防止其泛素化[45]. DNMT1和USP7形成一种稳定的可溶性复合物，与UHRF1以三聚体复合物的形式结合在染色质上[46]. 以CXXC结构域为起始点的人DNMT1片段与USP7复合物的晶体结构表明，这两种蛋白质通过DNMT1的GK连接子和USP7 C末端附近的酸性口袋发生相互作用[45]. USP7中这些酸性残基的突变和DNMT1中GK连接子的乙酰化缺失破坏了DNMT1和USP7之间的相互作用，导致DNMT1的蛋白酶体降解增加[45]. 有趣的是，USP7的结合也能增加DNMT1的活性在体外[46]. 然而，最近的数据显示USP7 KO细胞中DNMT1水平没有变化[47]. 此外，不能乙酰化的GK重复序列突变为GQ，对细胞中DNMT1的稳定性和活性没有影响[47]从而驳斥了USP7和GK重复乙酰化在调节DNMT1活性和稳定性中的重要作用。目前尚不清楚这些差异是否是由于在这些实验中使用不同的细胞类型造成的，鉴于增殖率和细胞周期控制的差异，这一点尤为重要。

DNA复制后维持甲基化的动力学

如上所述，DNMT1是DNA复制后负责DNA甲基化的主要酶。DNMT1在其N末端部分包含一个PCNA相互作用区域，这对于其定位到复制分支至关重要[48]. 过去的研究表明，DNMT1的N末端区域（包括PCNA相互作用区域）的缺失会产生DNMT1亚型变体，导致细胞中整体甲基化水平降低和再甲基化动力学延迟[49]. 在含有野生型DNMT1的HCT116细胞中进行的BrdU脉冲相实验表明，在含有BrdU的30分钟脉冲后，重甲基化几乎完成，但在含有低形态DNMT1细胞中重甲基化明显延迟[49].

最近，有两篇论文利用改良的亚硫酸氢盐转化方法结合深度测序研究了DNA复制后的重甲基化动力学。Charlton等人[50]将BrdU标记和免疫沉淀与全基因组亚硫酸氢盐测序相结合，显示了新生DNA的双相重甲基化动力学。一部分甲基化在复制后的第一个小时内增加，随后是长达4小时的较慢阶段。对DNMT-KO细胞的研究表明，DNNT3酶对复制后DNA甲基化率的影响有限，但具有DNA甲基化的EZH2位点显示出延迟的再甲基化，这取决于DNMT3酶。对单个DNA分子甲基化模式的分析揭示了DNMT1的过程反应机制，与之前的生化研究一致（综述：[5]). 徐和Corces[51]使用了类似的方法，但发现大多数重甲基化在DNA复制后20分钟已经发生。此外，他们报告发现约800个稳定的半甲基化CpG位点富集于CTCF/凝集素位点，但这一结果仅基于亚硫酸氢盐转化与深度测序，未通过独立技术进行验证。

DNMT3酶的最新发现

DNMT3酶的结构与机制

DNMT3家族包括三个直向同源物，DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，所有这些同源物都具有相当大的序列相似性(图2A). DNMT3L缺乏催化活性，但它刺激DNMT3A和DNMT3B并调节它们的多聚化和核定位（综述：[6]). 2007年发表的DNMT3A/3L C末端结构域显示，线性3L–3A–3A-3L异四聚体的形成是通过两个不同的界面介导的，一个3A–AA-中央“RD”界面和两个外围3A–3L“FF”界面[52]. 其他工作表明，所有接口也调节DNMT3A的自我交互（审查：[6]). 线性异四聚体包含两个活性位点（每个DNMT3A亚单位中一个），距离相当于8–10 bp的DNA。甲基化研究证实了DNMT3A对位于该距离的两个CpG位点进行共甲基化的偏好[52,53]. 最近，在ES细胞和神经元中还观察到DNMT3A催化的非CpG甲基化的8–10 bp甲基化模式[54].

含有ADD染色质相互作用域（见下文）的较长DNMT3A片段的不同结构导致发现了该酶催化活性的变构调控[55] (图4B). 一个结构揭示了一种构象，其中ADD结构域与催化结构域的DNA结合区域相互作用，从而自动抑制其活性（抑制结合位点）。在与ADD结构域结合的H3尾肽存在的情况下生成了第二个结构。它表明ADD结构域在另一个位置与催化结构域结合，这不应干扰酶的活性（变构结合位点）。有趣的是，H3肽与ADD结构域的结合是通过与参与自身抑制结合界面的残基相互作用实现的。因此，肽结合只能在活性构象中进行，并且这种构象在H3肽的存在下是稳定的。酶动力学证实H3尾肽与ADD结构域的结合导致释放自身抑制并激活DNMT3A[55]与早些时候发表的生化研究一致[56,57]（审查：[6]).

最近，首次发表了含DNA的DNMT3A/3L异四聚体的结构[58] (图5A). 其中一个实验中，两个短的寡核苷酸与两个活性位点结合，第二个实验中使用了一个DNA，其中一个DNA包含两个CpG位点，距离为14 bp。这些结构是在活性位点Cys残基和在靶胞嘧啶位置引入的修饰碱基之间形成共价键后获得的。因此，尚不清楚双位点结构如何类似于一个复合物，该复合物包含两个CpG位点，距离为8–10 bp，在生化研究中被优先甲基化（综述：[5,6]). 与其他DNMT一样，靶胞嘧啶从DNA螺旋中旋转出来，并放入活性位点囊中，在那里它与上述的催化驻留物相互作用(图5B). 翻转底座后的空腔由目标识别回路中的V716填充。CpG位点的鸟嘌呤碱被R836识别，其丢失导致对CpG部位甲基化的偏好降低在体外和在单元格中[58]. 当与两个活性位点结合的DNA松弛时，双位点底物中连接它们的DNA部分显示出一个急剧弯曲，伴随着主沟的强烈压缩。几个残基与CpG二核苷酸两侧的碱基接触。这解释了之前观察到的DNMT3A强烈的侧翼序列偏好性（综述：[5,6]). 此外，结构表明，人类DNMT3A中的R882残基在AML癌症中经常发生突变（综述：[59])与主干DNA接触有关。这一观察可以解释最近报道的R882H癌突变侧翼序列偏好的强烈转变[60]可能有助于这种突变的致癌作用。

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DNMT3A/3L与DNA复合物的结构[58]（pdb 6BRR）。

（A）结构概述。DNMT3A亚基以蓝色和青色显示，DNMT3L亚基以红色和橙色显示。SAH显示为黄色，DNA显示为绿色。（B）翻转靶碱基（Cyt）与DNMT3A活性位点口袋中的催化残基的相互作用。

最近，发现了DNMT的另一种意想不到的活性，表明不同的DNMT（细菌M.SssI和小鼠DNMT3A催化结构域）产生低水平的3mC作为副产物[61]. 这种修饰的碱基代表DNA的烷基化损伤，细胞中的DNA在氧化过程中由ALKB2家族酶修复。事实上，已经发现ALKB2酶在进化上与许多物种中的活性DNMT密切相关[61]，强调它们之间的功能联系。

DNMT3酶的多聚化和加工性

如前所述，DNMT3A具有两个异多聚和均多聚界面，可以形成二聚体、四聚体和高级低聚物（综述：[6]). DNMT3A的高级蛋白低聚物可以与多条大致平行排列的DNA链结合[62]支持染色质中相邻连接子DNA区域的结合。事实上，最近的不同研究表明，CpG位点的共甲基化在从头开始～180核苷酸范围内的甲基化[63,64]，这大致与核小体分隔的两个连接子区域的距离相吻合，表明DNMT3多聚体可以与相邻的连接子DNA区域结合并使其甲基化。在DNMT3引入的非CpG甲基化中也观察到类似的模式[54]. 两个界面中的大多数残基在DNMT3B中是保守的，这可能会形成类似的多聚体，但这一性质尚未得到证实。DNMT3L仅包含一个界面，将DNMT3A/3L复合物限制为四聚体，无法进一步齐聚[62]. 此外，DNMT3A和DNMT3A/3L复合物在DNA上相互复合[65]. 近年来，这种多重聚合被证明可以通过DNMT3A介导协同DNA结合[66]并通过DNMT3A促进细胞内有效的DNA甲基化[67].

有趣的是，虽然DNMT3A与DNA协同结合并形成蛋白质-DNA复合物阻止DNA甲基化过程[66]最近的研究表明，DNMT3B不与DNA协同结合，并且具有过程甲基化机制[68]与之前的研究一致[69]. 此外，DNMT3B中类似于DNMT3A的R882的精氨酸残基的突变对DNMT3P酶的催化活性或加工性没有影响。本研究还表明，DNMT3A和DNMT3B之间界面残基的差异影响了这两种酶的不同催化机制[68]. 未来表征DNMT3B界面残基的生化研究和/或其晶体结构分析对于理解DNMT3A和DNMT3B的不同靶点和生物功能至关重要。此外，已知这两种酶相互作用并形成混合复合物[70]，这又增加了这个问题的复杂性。

DNMT3酶的染色质相互作用

DNMT3酶的N末端部分包含两个重要的染色质相互作用域，即与H3K36me3结合的PWWP域和与H3尾部N末端结合的ADD域（综述：[6]). K4的甲基化或乙酰化或T3和T6的磷酸化破坏了ADD与H3的结合[56]. 通过设计对K4甲基化或T6磷酸化不再敏感的DNMT3A ADD变体，实验研究了这些染色质标记读出的功能作用[71]. 事实上，这些DNMT3A突变体在细胞中的表达通过在ESC分化期间导致谱系承诺缺陷而扰乱了分化程序。然而，这些细胞中的多能性和自我更新基因与野生型细胞中的减少相似。有趣的是，另一项研究显示，DNMT3A在ESC分化期间多能性基因阻遏所需的多能性增强子甲基化中起着关键作用。这项研究揭示了ADD结构域在DNMT3酶靶向多能性基因增强子中的显著作用，其中LSD1依赖的H3K4去甲基化是局部DNMT3A结合和激活所必需的，从而导致增强子甲基化[72]. 综上所述，这两项研究证明了表观遗传串扰机制的生物学相关性及其在发育过程中的重要性。

最近，结合到含有H3K36me3的H3肽的PWWP结构域（存在于DNMT3A和DNMT3B中）被解决[73]并证实了之前在生化研究中发现的结合囊[74]. 使用DNMT3B KO小鼠ES细胞系，基因内DNA甲基化被DNMT3B沉积[63,75]. DNMT3B的这种活性依赖于SETD2通过PWWP与H3K36甲基化的相互作用沉积的H3K36me3。DNMT3B的基因体甲基化被证明可以防止虚假的转录启动，这与基因体H3K36甲基化的一般功能一致[76]. H3K36me3与PWWP结构域结合的另一个重要作用在一项研究中进行了描述，研究表明DNMT3A和DNMT3B以H3K365me3依赖的方式与表皮干细胞中最活跃的增强子相关，表明这种结合是由PWWP域介导的[77]. 这两种蛋白质对增强子DNA修饰的影响不同。DNMT3B参与增强子体甲基化，而DNMT3A与TET2协同促进增强子DNA羟甲基化。有趣的是，DNMT3A和DNMT3B都是增强子活性和增强子RNA生成所必需的，这说明DNA甲基化对基因抑制和激活具有双重调节潜力。

新基因和亚型的功能

最近的研究表明Dnmt3b型小鼠的基因经历了复制形成Dnmt3c公司是另一个活跃的DNMT基因，在雄性生殖细胞发育过程中对反转录转座子的沉默具有特殊作用[78,79]. 虽然很明显，人类基因组没有编码额外的DNMTs，但看看类似的仔细检查是否也会在其他哺乳动物分支中发现更多的DNMT3同源物，这将是一件有趣的事情。

除了基因复制外，通过灵活使用替代起始位点和剪接亚型，DNMT还有可能实现更大的功能特化。DNMT3A有两种已知的亚型，一种是较长的DNMT3A1，另一种是较短的DNMT5A2，它是从一个内部起始位点表达的[80]. 研究表明，DNMT3A2在胚胎组织中占主导地位，而DNMT3A1在所有组织中都有表达。最近的研究表明，DNMT3A1酶定位于二价CpG岛启动子的岸边，这表明DNMT3A2中缺失的N末端片段与其他蛋白质相互作用，可能在DNMT3A的靶向作用中发挥作用[81].

对于DNMT3B，已鉴定出几种剪接亚型，其中许多由于催化域中的缺失而不具有催化活性，但有些还包含N末端的缺失。有趣的是，一种催化不活跃的剪接变异体（DNMT3B3）是体细胞中表达的DNMT3B的主要亚型[82]. 结果表明，非活性变体仍然与DNMT3A和DNMT3B相互作用，它们可以调节其催化活性[83]. 最近，研究表明，催化失活的DNMT3B亚型也可以与DNMT3A结合，并刺激其在体细胞中的基因体甲基化[84].

DNMT3酶的非CpG甲基化

全基因组研究中非CpG甲基化的量化和分布表明，它在神经元中的基因体和转座子中富集，在额叶皮层和胚胎细胞中富集的胞嘧啶>2%，而在大多数其他细胞类型中含量较低（综述：[10]). 有趣的是，ES细胞和早期发育中的非CpG甲基化主要发生在CAG环境中，而在分化神经元中，主要观察到CAC甲基化（综述：[10]).

生化研究表明，由于DNMT3酶的特异性较低，非CpG甲基化可由其引入（综述：[5,6]). 然而，DNMT1是哺乳动物中最活跃和最重要的DNMT，具有CpG特异性，几乎不能甲基化非CpG位点[20]. 因此，虽然CpG甲基化在每次细胞分裂后都能有效复制，但对于非CpG的甲基化则不是这样，非CpG-甲基化必须产生从头开始每次DNA复制后。有趣的是，尽管CNG位点是回文的，但在哺乳动物中不存在DNMT的意义上，这些位点的DNA甲基化也没有得到“维持”，而DNMT对半甲基化CNG位点具有特异性。DNMT-KO细胞系中的甲基化分析清楚地表明，DNMT3酶负责非CpG甲基化[85]. 因此，非CpG甲基化主要存在于DNMT3酶高表达的组织中，如胚胎组织和神经元。特别是在神经元中，细胞分裂的缺乏也有利于非CpG甲基化的稳定存在。对小鼠的研究表明，在TKO ES细胞中重新表达DNMT3A或DNMT3B后，DNMT3A优先引入CAC甲基化，而DNMT3B在CAG甲基化中更为活跃[54]. 这一发现与一般观察一致，即DNMT3B在早期发育中起作用，DNMT3A在脑组织中高度表达。在大脑中，在长MeCP2抑制基因的基因体中观察到CpG和CpA甲基化[86]. 条件DNMT3A KO对CpA甲基化的破坏表明，CpA的甲基化对MeCP2的结合和长基因的抑制至关重要[87]. 在另一项研究中，发现MeCP2与非CpG甲基化DNA的结合在成年小鼠大脑中双向（上下）调节基因表达[88].

见解

精确控制DNA甲基化模式对人类细胞至关重要。这意味着DNMT活性和稳定性的调节以及它们向基因组靶位点的募集是非常关键的过程。过去的研究导致了DNMT控制的共同主题的出现，如保持DNMT处于非活性的自动抑制基态以避免异常活性，或联合靶向和调节其催化活性。然而，我们刚刚开始了解PTM、染色质修饰和染色质因子的复杂网络，包括控制DNMT调控的非编码RNA。许多细节仍不清楚，还有更多的过程可能尚未发现，这意味着DNMT研究将迎来激动人心的时刻。

缩写

甲基转移酶DNA甲基转移酶
击倒对手淘汰赛
博士植物同源结构域
TTD公司串联都铎域

脚注

竞争性利益

作者声明，与手稿没有任何利益冲突。

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