人类小胶质细胞阿尔茨海默菌斑诱导神经元杀伤中β-淀粉样蛋白的特异性结构域

摘要

阿尔茨海默病（AD）是导致老年痴呆症的最常见原因，在世界范围内占1500多万例。这种疾病的神经病理学特征包括神经炎和核心老年斑(Selkoe，1991年;Terry等人，1994年，b），主要由独特的肽β-淀粉样蛋白（aβ）组成的蛋白质的复杂聚集。一般认为Aβ在某种程度上负责与痴呆相关的突触和神经元丢失(Selkoe，1991年;Yankner和Mesulam，1991年;普莱斯等人，1992年;Younkin，1995年). 在AD患者的灰质中发现Aβ是神经炎和核心斑块的组成部分，与反应性小胶质细胞、星形胶质细胞增生和神经元丢失有关。在AD和老年正常大脑中发现的第二种Aβ积聚类型包括弥漫性斑块（直径70–100μm的离散网状结构，通过银染色、硫黄素S或免疫组织化学观察），这些斑块与营养不良性神经炎或认知功能下降等病理变化无关(山口等，1988年;Masliah等人，1990年,1993). 最后，只有免疫组织化学才能证明Aβ的弥散无定形沉积在老年大脑中，并被描述为唐氏综合征AD样病理的早期表现(Giaccone等人，1989年;Verga等人，1989年). 虽然神经炎和核心斑块与痴呆症之间的联系机制仍未解决，但已经提出了两个主要假设：（1）Aβ是一种强效和直接的神经毒剂(Yankner等人，1990年)或（2）神经炎/核心斑块引发一连串细胞事件，导致神经元病理学(戴维斯，1994;朱利安等人，1995年). 对第一个假设的支持来自在体外合成Aβ肽对丰富的神经元培养物有毒的观察(Pike等人，1991年;Cotman等人，1992年)或各种非神经元细胞系(Behl等人，1994年;Pollack等人，1995年). 支持第二个假设的证据来自于神经炎/核心斑块没有直接的神经毒性，这一事实表明神经元可以在Aβ肽上成功生长(Koo等人，1993年;Wujek等人，1996年)直接添加到神经元的神经炎/核心斑块不会导致神经元损伤(朱利安等人，1995年)，并且注入大脑的Aβ肽不会引起组织损伤(Games等人，1992年;Podlisny等人，1992年;斯蒂芬森和克莱门斯，1992年).

Aβ诱导的神经元损伤的一种途径可能涉及炎症细胞，因为人们早就认识到反应性小胶质细胞（活化的脑单核吞噬细胞）与AD神经炎斑块密切相关(博尔西，1927年;McGeer等人，1987年;Rogers等人，1988年;朱利安，1992年1995年a；Perlmutter等人，1992年). 在正常成人大脑中发现的小胶质细胞是高度分枝的静止细胞，在中枢神经系统损伤时收缩进程并产生反应(里奥·霍特加，1932年). 在AD中，定量组织病理学已经确定，80%以上的核心斑块与成簇的反应性小胶质细胞相关，而<2%的弥漫性Aβ沉积显示出这种关联(朱利安等人，1995年). 这些观察结果表明，大脑炎症反应可能是针对神经炎和核心斑块的成分。作为大脑的主要免疫效应细胞，活化的小胶质细胞能够释放诸如蛋白水解酶、细胞因子、补体蛋白、活性氧中间体、NMDA样毒素和一氧化氮等细胞毒因子(Thery等人，1991年;朱利安，1992年;Rogers等人，1992年;Lees，1993年). 为了探讨AD的免疫病理学，我们最近测试了小胶质细胞与神经炎/核心斑块的相互作用在体外并发现斑块碎片刺激反应性小胶质细胞和神经毒素的分泌(朱利安等人，1995年)从而将反应性微胶质增生症与神经病理学联系起来。在这里，我们证明Aβ1-42是引起小胶质细胞神经毒性反应的斑源性成分。重要的是，人类Aβ的N末端为启动这一神经毒性级联反应提供了必要的锚定位点。我们的数据指出了可能阻止神经毒性小胶质细胞激活的策略，因此，可以作为AD痴呆的治疗方法。

材料和方法

小胶质细胞的分离。通过以下方法从新生动物中分离大鼠小胶质细胞朱利安和贝克（1986）回收率为～0.5×10⁶每个脑的阿米巴样小胶质细胞纯度>99%。用于鉴定单核吞噬细胞的标准包括结合荧光探针（用1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁[DiI-ac-LDL]标记的乙酰化低密度脂蛋白）显示存在清道夫受体，CR3补体受体存在（用OX-42抗体标记），扫描电镜观察到的特征性含棘细胞表面形态(朱利安等人，1995年b). 如前所述，在尸检间隔6小时内，从50至100克正常成人皮层灰质中分离出人类小胶质细胞(朱利安等人，1995年b). 我们获得了高度纯度的细胞（>98%，～0.5×10⁶细胞/gm组织湿重），是活跃的吞噬细胞，表现出CD4的存在、脊椎表面形态、清道夫受体和II类标记HLA-DR(朱利安等人，1995年b).

斑块蛋白的分离、纯化和表征。AD大脑是从有临床病史和病理特征的患者身上获得的，以满足阿尔茨海默病注册协会（CERAD；米拉和海曼，1993年). 利用不连续蔗糖梯度（in米)：1.2、1.3、1.4、1.7和2.0(Roher等人，1993年a，b）。淀粉样核从1.4/1.7中回收米蔗糖界面呈离散的致密颗粒（直径15-25μm），被发现为硫黄素S（+）和6E10抗淀粉样抗体（+）（来自纽约州斯塔顿岛基础研究所）。这些纯化的核心在80%甲酸中溶解，通过Superose 12 FPLC进行分级，并在20 m处透析（1000 Da截止值）米含0.7%两性离子甜菜碱的碳酸氢铵(Roher等人，1993年a). 透析前各组分的蛋白质含量通过氨基酸分析测定(Roher等人，1993年a)透射电镜（TEM；Roher等人，1988年). 从汇集的大脑样本中获得的五个组分在含量和数量上都具有高度的重复性，如其他地方详细描述的那样(Roher等人，1988年,1993年a，b）。斑块部分中Aβ1-40和Aβ1-42含量的估计基于ELISA方法，该方法类似于Kuo等人（1996）使用合成肽作为标准。在本报告中，捕获抗体为鼠单克隆468（马里兰州塞内特克），报告兔识别特定肽的多克隆抗体为生物素化S40和S42（日本群马大学M.Shoki赠送）。斑块部分的淀粉样成分也通过Tris-tricine PAGE和Western blots进行表征。采用胶体金技术，通过TEM免疫染色证实组分中存在α-1抗胸腺蛋白酶（ACT）和载脂蛋白E（apoE）(Roher等人，1993年b).

从无痴呆临床病史的患者死后富含弥散斑块的大脑中分离出弥散斑块蛋白（硫黄素S染色切片显示弥散沉积物>85%）。使用相同的方法回收弥散斑块聚集物，以获得神经炎/核心斑块碎片，但从1.4米/1.7米蔗糖梯度界面。然后在室温下将该材料溶解在80%甲酸中30分钟，在250000×克持续30分钟，然后对40米进行连续透析（1000 Da截止值）米碳酸氢铵，6%甜菜碱，pH 7.8；对40米米碳酸氢铵，2%甜菜碱，pH 7.8；和20米米碳酸氢铵、0.7%甜菜碱、pH 7.8。透析前的蛋白质含量通过测定总胺含量来估算，使用酸水解物（6N HCl；24小时；105°C）的荧光胺测定法。将来自弥漫性或神经炎/核心斑块的可溶性蛋白质添加到浓度为400μ米总胺。所有合成肽均购自加州肽（Napa，CA）或巴赫姆（Bachem，King of Prussia，PA）。

Aβ偶联到珠子和细胞粘附分析。合成的Aβ肽在偶联缓冲液（0.1）中与Sepharose珠（Pharmacia，Piscataway，NJ）相连米氯化钠_三和0.5米NaCl，pH 8.3），含10%二甲基亚砜。将该溶液与适量的CNBr活化的Sepharose 4B（10 mg蛋白质/ml珠；Pharmacia协议）结合，并在室温下在平台混合器上混合过夜。珠子上剩余的活性组被1.0阻隔米甘氨酸；通过三个交替pH值（0.1）的循环洗涤，从这个珠-肽复合物中去除多余的未偶联肽米醋酸盐缓冲液，pH 4.0，然后0.1米Tris-HCl缓冲液，pH 8.0，每个缓冲液含0.5米氯化钠）。耦合珠子（10⁴/ml）置于35 mm培养皿中，培养皿上覆盖有250000个粘附小胶质细胞，37°C，1.5 ml N2培养基中(朱利安等人，1995年). 在6小时孵育期结束时，通过反相显微镜测定从平板上分离并结合到偶联珠上的小胶质细胞的数量，从三个姐妹培养物中的每一个培养物中获得100个珠。甘氨酸和牛血清白蛋白（BSA）偶联微球作为对照。

萤石羧酸盐微球（YG 1.0μm，Polysciences，Warrington，PA；0.5 ml 2.5%悬浮液）在0.1米碳酸缓冲液，pH 9.6，0.02中三次米磷酸钠，pH 4.5。然后逐滴添加碳二亚胺至最终浓度1%，并在室温下混合悬浮液4小时。在0.02中再洗三次后米磷酸钠，将颗粒重新悬浮在1.2 ml的0.2中米添加pH 8.5的硼酸盐缓冲液和6%二甲基亚砜中300μg Aβ（或对照肽）。在室温下混合过夜后，微球被1米甘氨酸，pH 8.0，30分钟，在硼酸盐缓冲液中用10 mg/ml BSA洗涤。分离的小胶质细胞（1000/mm²)放置在24孔培养皿中16 mm玻璃盖玻片上。然后，每个孔接收250000个微球，并在37°C下进行结合分析。4小时后，将盖玻片在PBS中浸泡10次，并用4%的缓冲多聚甲醛固定过夜。用相位/荧光显微镜在200倍放大率下对微球粘附细胞进行评分。减去与姊妹培养物结合的甘氨酸偶联球估计的背景值后，数据表示为平均每场微球数±SE。

神经元培养和毒性分析。用大鼠海马培养的神经元检测神经毒素(Giulian等人，1995a). 简单地说，将从胚胎期（E）18只大鼠胎儿中获得的海马细胞在0.083%胰蛋白酶的存在下机械分散，并将其镀在聚乳酸-我-赖氨酸涂层玻璃盖玻片在24孔板中，250000个细胞/孔（导致粘附细胞密度为～1250个细胞/mm²)在含有5%胎牛血清的化学定义的N2培养基中。血清在第10天开始逐渐减少在体外每天用化学定义的培养基进行1:1体积的置换，直到达到0.6%血清的最终浓度。成熟培养物由在星形胶质细胞（>75%）和小胶质细胞（3-8%；见图。​图1）。1). 为了消除小胶质细胞，培养物暴露于皂苷（saporin，一种核糖体激活蛋白；Davis and Wiley，1989年)以10μg/ml的浓度与乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）偶联12小时。Saporin-ac-LDL选择性地与清道夫受体结合，将小胶质细胞数量减少到总人口的0.1%以下，但对神经元或星形胶质细胞的数量或生存能力没有影响（见图。​图1）。1). 然后，在存在或不存在外源性小胶质细胞（100000个细胞/培养物）的情况下，将耗尽的小胶质细胞培养物暴露于试验物质中。通常，在分析时，小胶质细胞/神经元比率为～3:1，星形胶质细胞/神经细胞比率为～6:1。对照组包括未经皂苷处理的培养物、未经试验物质的培养物和含有试验物质但缺乏小胶质细胞的培养物。

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图1。

从混合海马培养物中选择性消除小胶质细胞。A、 C、E，对照培养物显示MAP-2/NF免疫染色显示的复杂神经网络(A类)，DiI ac LDL（+）小胶质细胞的存在(C类)和GFAP（+）星形胶质细胞的近汇合饲养层(E类).B、 D、F，用与乙酰化低密度脂蛋白偶联的皂苷处理培养物后，小胶质细胞被消除(D类)对两个神经元的存活没有影响(B类)或星形胶质细胞(F类). 比例尺，25μm。克，经和未经Sap-ac-LDL治疗的特定细胞群计数证实了小胶质细胞的特定耗竭。数据表示为平均值±SE，从至少五个独立培养物的九个随机选择的区域中获得，放大200倍观察。

在培养的第14天，在皂苷治疗后立即向海马培养物中添加试验物质。合成肽供应量为1 m米0.1的储备溶液米PBS，pH 7.2，使用前在4°C下储存至少1周。培养72小时后，在室温下将培养物固定在4%的多聚甲醛中18小时，并用抗神经丝（NF）抗体（SMI-311，1:600；Sternberger单克隆抗体）和抗MAP-2（184959，1:600，印第安纳波利斯Boehringer Mannheim）的混合物隔夜培养进行免疫染色在4°C条件下，加入2%马血清和0.3%Triton X-100，以描绘神经元细胞体和轴突。如前所述，用兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP，DAKO）观察星形胶质细胞(朱利安等人，1989年). 最后，为了标记所有细胞核，将盖玻片暴露于0.01%的双苯甲酰亚胺（Hoechst 33258，Sigma，St.Louis，MO）中米磷酸盐缓冲液，pH 6.9，在蒸馏水中漂洗，并在甘油中固定。用荧光显微镜在200倍放大倍数下对每个场的免疫标记细胞和每个场的细胞核进行评分。在对三张盖玻片中的每一张进行至少20个随机选择的区域进行评分后，数据表示为以平行未经处理的对照培养物表示的平均存活率百分比。

从出生后第7天的大鼠视神经制备无神经元培养物。在补充有5%胎牛血清的N2培养基中培养3天后，细胞在无血清N2培养液中再维持4天。然后固定培养物，并对神经元和星形胶质细胞标记物进行免疫染色，如海马细胞所述。此外，用单克隆抗体O1对含有半乳糖脑苷脂的少突胶质进行免疫染色(Sommer和Schachner，1981年;Bansal等人，1989年; 由肯塔基大学Pamela Knapp提供）。在4°C下用1:2000稀释的兔抗鼠多克隆抗体（Polysciences）在50 m冲洗后过夜，对神经元特异性烯醇化酶进行免疫染色米甘氨酸、0.3%Triton X-100和10%马血清。

E9鸡胚的纤毛神经元被镀到聚乳酸-我-24孔板中的赖氨酸涂层盖玻片，每孔2个神经节，在N2介质中（稀释至90%），并补充30 m米KCl加0.6%马血清（改自朱利安等人，1993b). 培养物由～50%的NF（+）神经元与雪旺细胞混合组成，不含单核吞噬细胞和星形胶质细胞。睫状体神经元对NMDA和喹啉酸的毒性作用敏感(朱利安等人，1993a，b）。如前所述，48小时后测量神经毒性活性(Giulian等人，1993a). 神经元杀伤分数百分比计算为[1-（治疗组每场神经元数/未治疗对照组每场神经数）]×100%。数据表示为平均值±SE，每组至少使用六个盖玻片，每个值从每个盖玻片的18个字段中获得。

有毒物质的生物化学研究。之前已经描述过从活化小胶质细胞条件培养基中纯化神经元杀伤活性(朱利安等人，1995年)通过YM-30膜和YM-1膜进行超滤。然后在pH 4.0的酸性条件下用等量的乙酸乙酯清洗超滤液，并在pH 10.5的碱性条件下将其萃取到乙酸乙酯中。所有神经毒性活性都恢复到该碱性有机相中。将材料重新萃取到pH 2.0的酸性水相中，在真空下干燥，用氮气冲洗，并进行酸水解（在105°C的6N HCl中24小时）。然后将水解产物萃取到碱性乙酸乙酯中，并用C18 RP-HPLC（3.9×150 mm Nova-Pak，Waters，Milford，MA）用0–20%的乙腈梯度洗脱两次（溶剂a，0.1%三氟乙酸，dH₂O；溶剂B，0.1%三氟乙酸（dH）₂O/乙腈5:95，vol/vol）。AD新皮质神经毒性活性的纯化涉及从1kg冷冻人脑灰质中提取的水提物（每组织重量10 vol无菌蒸馏水），该灰质通过超滤、有机萃取、酸水解和RP-HPLC进行了上述相同的分馏(朱利安等人，1995年). 酚和胺含量用于评估在高纯度HPLC馏分中发现的神经毒素浓度。指定UV_最大值265 nm（0.1%三氟乙酸，14%乙腈，dH₂O） ，将从C18-HPLC洗脱的活性峰与用多波长检测器（Rainin Dynamax UV-M）测量的在相同条件下洗脱的酪胺的标准曲线进行比较。以酪胺为标准，用荧光胺法测定胺含量。这些检测方法对给定的毒素制剂给出了类似的值；毒素浓度的估计假定每个分子有一个胺环和一个酚环(朱利安等人，1995年).

神经毒素的酸催化酯化是用3N HCl在n个-丁醇（Regis Chemical，Morton Grove，IL）在80°C下60分钟，在甲醇（1:3 vol/vol；Sigma）中的醋酸酐中短乙酰化在25°C下1分钟；室温下添加过量甘氨酸终止反应。神经毒素也被过量的五氟丙酸酐（PFPA；瑞士Fluka Chemie AG）在60°C下修饰60分钟，在25°C下用100 U/ml血浆胺氧化酶（胺：氧化还原酶；1.4.3.6；新泽西州弗里霍尔德沃辛顿生化）在1 ml 10 m米PBS，pH 7.0，在25°C条件下，在2 ml 10 m溶液中加入390单位的多酚氧化酶（单酚、二羟基苯丙氨酸：氧化还原酶；1.14.18.1，沃辛顿）4小时米PBS，pH 7.0，持续2小时。在所有情况下，通过煮沸15分钟终止酶反应。灭活酶对照品在与神经毒素孵育前通过煮沸制备。

亚硝酸盐和硝酸盐是一氧化氮合成酶（NOS）的稳定副产物，是一氧化氮（NO）合成的标志物(伊格纳罗，1990年). 由分离的人类小胶质细胞调节的培养基中的亚硝酸盐/硝酸盐浓度（10⁶细胞/ml；在存在神经炎/核心斑块或Aβ肽的情况下孵育24–72小时），用Griess方法进行测量(贝克曼等人，1990年)根据0.1至50.0μ的标准曲线米硝酸盐。

结果

老年斑与神经元的小胶质细胞杀伤

如前所述，与神经炎/核心斑块碎片孵育的培养小胶质细胞释放神经杀伤因子(朱利安等人，1995年). 为了研究斑块-小胶质细胞相互作用的特异性，分离、溶解AD脑中的神经炎/核心斑块和正常老年脑中的弥漫性斑块，并将其应用于有或无小胶质细胞的培养海马神经元。如图所示​图22A类溶解的神经炎/核心斑块蛋白刺激小胶质细胞释放神经毒素，而弥散斑块的溶解成分没有。为了阐明信号传导机制，接下来通过分级色谱将溶解的神经炎/核心斑块物质分为五个主峰（图。​（图22B类)，如前所述Roher等人（1993年a，b）。在这些斑块组分中发现的主要成分包括S1峰中的糖蛋白和ACT，S2中的apoE，以及S3、S4和S5峰中的大量Aβ-淀粉样蛋白（主要是Aβ1-42），分别作为三聚体、二聚体和单体（表​（表1）。1). 添加到小胶质细胞培养物中的菌斑组分S3、S4或S5导致细胞进程的急剧收缩和淀粉样聚集体的吞噬（图。​（图3三B、 D类)而组分S1和S2对小胶质细胞行为影响不大（图。​（图22C类,​,3三A、 C类). 将斑块部分S3、S4和S5添加到海马培养物中会导致神经元严重丢失，但仅在存在小胶质细胞的情况下（图。​（图22D类). 这些数据表明斑块衍生组分S3、S4和S5含有能够诱导神经毒性小胶质细胞的因子。如表所示​表1，1Aβ1-40或Aβ1-42肽在这三个组分中很常见，因此很可能是小胶质细胞活化剂。

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图2。

溶解的天然老年斑的成分会引起神经元死亡。A类从皮层灰质中分离出神经炎/核心或弥漫性斑块，溶解在甲酸中，并用甜菜碱缓冲液透析。等量的斑块蛋白（归一化为400μm时的总胺含量米)在存在（100000个细胞/培养物）或不存在大鼠小胶质细胞的情况下将其添加到神经元培养物中。如图所示，可溶性神经炎/核心斑块蛋白(神经炎/核心菌斑)导致神经元大量死亡，但仅在小胶质细胞存在的情况下。溶解的弥散斑块蛋白(扩散菌斑)也不是甜菜碱缓冲液(缓冲区控制)引发神经毒性活动。B类，使用两个串联的Superose 12柱（300 mm×10 mm×2；珠状物，10μm直径）对神经炎/核心斑块蛋白质进行尺寸排除色谱分析。使用80%的玻璃蒸馏甲酸以0.3 ml/min的流速绘制色谱图，并在280 nm下进行监测。这些组分的近似分子质量包括：S1，200；S2，45；S3，15；S4、10；和S5，5 kDa（见表​表11对于分数组成）。C类直方图显示，暴露于峰值S3、S4和S5都会导致形态学标准定义的反应性小胶质细胞百分比显著增加（见材料和方法），而峰值S1和S2则不会。D类，将部分溶解的神经炎/核心斑块应用于海马培养物中是否存在小胶质细胞。在不含小胶质细胞的培养物中未检测到神经元杀伤。然而，在暴露于S3、S4和S5峰的含有小胶质细胞的培养物中出现神经元损失，所有这些峰都含有Aβ（见表​表11).

表1。

神经炎/核心斑块蛋白质组分的特征

分数	主要成分	添加到培养物中的Aβ浓度（n米; Aβ1-40，Aβ1-42）
S1（第一阶段）	ACT公司，一载脂蛋白E，b条	0.1, 0.1
	糖蛋白类
S2系列	载脂蛋白E，糖蛋白	0.1, 3.2
第3章	Aβ三聚体，一	2.0, 54.5
	糖蛋白类
S4系列	Aβ二聚体一	1.4, 220*
第5章	Aβ单体一	1.0, 250*

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主要成分估计≥总蛋白质的30%。神经元培养分析中使用的最终Aβ浓度基于材料和方法中所述的ELISA测量。由于S4和S5峰中的物质聚集，使用氨基酸分析和ELISA对Aβ1-40和Aβ1-42肽估计Aβ浓度（*）。ACT，α-1-抗糜蛋白酶；载脂蛋白E。

^一,Roher等人，1993年b.

^F1（b）Roher，未发布数据。

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图3。

天然斑块的可溶部分诱导小胶质细胞反应。暴露于S1峰的大鼠小胶质细胞培养物的亮场显微照片(A类)或峰值S5(B类)并对Aβ的存在进行免疫染色。如图所示，在与峰值S5孵育的培养物中发现Aβ聚集体。比例尺，25μm。相显微照片显示，培养的小胶质细胞是具有棘状表面的过程承载细胞，是典型的非反应细胞，尽管暴露于S1峰值(C类). 相反，暴露于峰值S5的小胶质细胞收缩过程，呈现出与AD大脑相似的反应性细胞形态(D类). 比例尺，5μm。

β-淀粉样肽与小胶质细胞杀伤神经元

为了测试Aβ单独是否能驱动神经毒性小胶质细胞，接下来我们检查了合成肽的作用（表​（表2）。2). 通常，Aβ肽应用于μ米浓度对在无小胶质细胞培养基中生长的神经元没有损伤作用（图。​（图44A、 C). 然而，当将小胶质细胞添加到该培养系统中并与人类Aβ1-40或Aβ1-42孵育时，神经元广泛缺失（图。​（图44C类,​,5).5). 在1μ米Aβ1-42，最大神经元杀伤所需的小胶质细胞密度为～150个细胞/mm²（小胶质细胞/神经元比率为0.8:1；图。​图44D类)尽管我们注意到小于50个小胶质细胞/mm时神经元死亡²未经皂素ac-LDL预处理，这些培养物中通常发现的内源性小胶质细胞数量为40-80个/mm².含有内源性小胶质细胞的制剂（与1μ米Aβ1-42）高于通过添加外源性胶质细胞构建的细胞密度曲线预测的值（图。​（图44D类)表明接种了原始E18培养物的天然小胶质细胞作为神经元杀伤细胞特别有效。显然，从混合神经元-胶质细胞培养物中去除小胶质细胞对于证明Aβ激活的炎症细胞的杀伤作用是必要的。

表2。

Aβ肽的性质

	主要位置	溶解度	诱发神经毒性小胶质细胞
Aβ1-28	合成	可溶的	−
Aβ12-28	合成	可溶的	−
Aβ17-42	弥散沉积物	非常不溶	−
Aβ25-35	合成	可溶的	−
Aβ1-40	正常大脑	中等溶解性	+
Aβ1-42	正常CSF	非常不溶	+
	血管沉积物
	神经炎/核心斑块
	神经炎/核心斑块

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淀粉样肽的性质和来源。已知脑组织中存在三种主要的Aβ形式，即Aβ17-42、Aβ1-40和Aβ1-42。描述了肽在37°C下在化学定义的培养基中的溶解度。Aβ1-42是对神经毒性小胶质细胞最有效的刺激（见图。​图44E类)并且代表神经炎斑块和核心斑块的主要不溶性成分。

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图4。

合成Aβ肽对神经元的毒性作用。A、 B类，在含有神经元和星形胶质细胞的海马培养物中放置高浓度的大多数Aβ肽（但缺乏小胶质细胞）几乎没有效果。然而，aβ25-35在≥30μ米在两个神经元上(A类)和星形胶质细胞(B类). 在没有小胶质细胞的情况下，Aβ肽（在1μ米)会破坏神经元。然而，当将大鼠小胶质细胞添加到神经元培养物中时，只有Aβ1-40和Aβ1-42引发神经元杀伤(C类).D类增加越来越多的小胶质细胞，在150个小胶质细胞/mm的密度下显示出饱和的神经元杀伤反应²与1μ米Aβ1-42；电镀时E18培养物中发现小胶质细胞(内源性小胶质细胞)在Aβ的存在下也显示出有效的杀灭能力。这些观察结果表明，在评估Aβ毒性机制时，需要耗尽小胶质细胞的神经元培养物。E类，剂量-反应曲线显示Aβ1-42是最有效的小胶质细胞刺激，估计ED₅₀共10个米，与80 n相比米对于Aβ1-40（500小胶质细胞/mm²).

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图5。

暴露于合成Aβ肽的细胞反应。相位显微镜显示，培养的大鼠小胶质细胞在暴露于1μ米Aβ1-42(E类); 相比之下，1μ米Aβ17-43(C类)不会改变小胶质细胞的形态，这与在对照条件下生长的未经处理的细胞相同(A类). 神经元和小胶质细胞培养物的荧光显微镜显示出强大的NF（+）MAP2（+）海马神经元(B类)加入1μ米Aβ17-43(D类). 然而，如果海马培养物暴露于1μ米Aβ1-42(F类). 比例尺，25μm。

当500小胶质细胞/mm²添加到神经元培养物中，Aβ1-42和Aβ1-40显示ED₅₀约10和80牛米，分别（图。​（图44E类). 因此，在斑块部分S3、S4和S5中发现的Aβ1-42的量（表​（表1），1)以及AD脑中估计存在的Aβ1-42的数量（在ng/gm组织范围内；Kuo等人，1996年)，足以诱发神经毒性胶质细胞。大多数情况下，小Aβ肽（Aβ1-16，Aβ1-28，Aβ17-43；表​表2）2)无论有无小胶质细胞，都不会产生神经毒性。然而，Aβ25-35是一个例外，它通常是细胞毒性的高浓度（≥30μ米)几乎90%的神经元都被破坏和100μ时给予胶质细胞米（图。​（图44A、 B类). 高浓度Aβ25-35缺乏神经元特异性，这与其他人注意到的对HeLa等非神经元细胞系的损伤作用一致(Pollack等人，1995年)或星形胶质细胞的原代培养(Harris等人，1995年). 然而，由于Aβ25-35不是一种天然的生物产物，它不太可能参与AD的病理过程(Roher等人，1993年a，b）。

许多报告表明，Aβ的神经毒性与特定的结构特征有关，例如聚集或纤维形成(Pike等人，1991年,1993)例如，Pike等人（1991年）描述了Aβ1-42在37°C下储存数天，以增加蒸馏水中聚集物的外观后，神经元损失更大。然而，我们发现，新鲜和“老化”的Aβ1-42肽的制备方法如下Pike等人（1993）同样有效地刺激神经毒性小胶质细胞（分别为75.1±5.8%和77.5±2.6%）。有人认为，Aβ1-42在溶液中形成纤维是其神经毒性的一个关键特征(Lorenzo和Yankner，1994年;Simmons等人，1994年;Howlett等人，1995年). 为了确定聚集等构象状态是否与小胶质细胞依赖性神经元杀伤有关，我们将各种Aβ形式共价偶联到1μm荧光微球。在E18培养物中，Aβ1-42偶联微球很容易被小胶质细胞摄取（图。​（图66A、 B类)类似于神经炎/核心斑块碎片的快速细胞识别(朱利安等人，1995年)和天然Aβ聚集体（图。​（图3）。三). 相反，β17-43偶联的微球没有被小胶质细胞吞噬（图。​（图66C、 D类). 重要的是，微球偶联的Aβ1-42和Aβ1-40，以及溶液中未结合的形式，激活了神经毒性小胶质细胞，而Aβ1-16或Aβ17-43在溶液中测试或与微球连接时均无效（图。​（图66E类). 这些观察结果表明，Aβ1-42肽的一级结构，而不是聚集或β片形成等复杂特征，足以诱导神经毒性胶质细胞。

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图6。

Aβ与微球偶联后激活小胶质细胞。荧光标记微球与Aβ1-42共价偶联，并放置在含有大鼠小胶质细胞（500细胞/mm）的海马培养物中²). 72小时后，Aβ1-42球体(A类)特异性定位于DiI-ac-LDL（+）小胶质细胞(B类; 共定位由箭头). 相反，Aβ17-43微球(C类)与小胶质细胞没有一致的联系(D类). 比例尺，20μm。E类Aβ在溶液中或与微球耦合时的容量比较(珠子装订)诱导神经毒性小胶质细胞（250000个微球/培养；100000个小胶质细胞/培养；72小时培养）。无论Aβ肽是在溶液中还是结合在小球上，神经元的丢失都是相似的，这表明纤维的形成或三级结构的其他变化对于刺激神经毒性小胶质细胞是不必要的。

Aβ作为一种直接神经毒素的效力有多大？

如上所述，在100μ米在无小胶质细胞的培养物中（图。​（图77B类)，而100 n米Aβ在小胶质细胞的存在下导致了显著的神经元丢失（图。​（图77C类). 因为以前的报告(Pike等人，1991年,1993;Cotman等人，1992年)描述了Aβ1-42对神经元的直接作用在体外，我们试图确定可能导致神经元死亡的培养条件，而不是小胶质细胞的存在。由于星形胶质细胞可能参与神经元损伤的AD机制，接下来我们检查无星形胶质细胞培养的睫状神经节（约50%的神经元和50%的雪旺细胞）是否对Aβ敏感。再次直接应用Aβ1-42对睫状细胞的存活没有明显影响，而Aβ1-43刺激小胶质细胞分泌毒素破坏睫状神经元（图。​（图77H（H）). 类似地，已经发现斑刺激小胶质细胞破坏睫状神经细胞(朱利安等人，1995年).

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图7。

暴露于Aβ1-42后海马培养物的荧光显微照片。A类，对照培养物显示NF（+）MAP-2（+）神经元的复杂网络。B类，将培养物暴露于100μ米在没有小胶质细胞的情况下，Aβ1-42对神经元数量没有影响，而(C类)添加100 n米大鼠小胶质细胞存在时的Aβ1-42（500个细胞/mm²)几乎摧毁了所有神经元。D–G型，神经元特异性烯醇化酶（NSE）的免疫染色对中枢神经系统培养物中的神经元没有特异性，如无神经元视神经培养物中神经胶质细胞的免疫荧光显像所示，包括半乳糖脑苷（+）少突胶质细胞(D类)和GFAP（+）星形胶质细胞(F类)，均为NSE（+）(E类和克）。比例尺，10μm。H（H）睫状体神经元培养显示，在没有脑胶质细胞的情况下（仅Aβ1-42），暴露48小时后，Aβ1-52对神经元没有毒性。来自Aβ1-42刺激的小胶质细胞的条件培养基(小胶质细胞+Aβ1-42)然而，确实杀死了神经元，这表明星形胶质细胞对小胶质细胞的神经毒性不是必需的。

作为评估星形胶质细胞在Aβ与小胶质细胞相互作用中的作用的另一种策略，我们试图通过使用有丝分裂抑制剂从分离的E18海马细胞中消除胶质细胞，如下所述Koh等人（1990年）和Pike等人（1993）然而，我们发现，这种培养系统并不能提供监测神经元杀伤的可靠方法，因为这些细胞制剂本身就不稳定，神经元存活率在48小时内下降到<80%。此外，使用化学定义的培养基或有丝分裂抑制剂实际上并没有消除非神经元细胞[如胶质前体细胞、清道夫受体（+）小胶质细胞或GFAP（+）星形胶质细胞]，只是减缓了胶质细胞的分化和抗原表达的程度。此外，在这种边缘培养条件下生长的星形胶质细胞具有类似神经元的长而细的反应性形态。尽管有其他人的报告(Whitson等人，1989年;Koh等人，1990年;Pike等人，1991年,1993;Cotman等人，1992年)，我们无法通过相位显微镜获得此类制剂中可靠的神经元计数。将胎牛血清引入中毒培养物中，刺激具有神经元样形态的细胞发育为GFAP（+）星形胶质细胞。尽管NF（+）MAP2（+）神经元占海马细胞总数的20%以下，但发现90%以上的细胞是神经元特异性烯醇化酶（+）。然而，发育中的视神经的无神经元培养物也含有>85%的神经元特异性烯醇化酶（+）细胞，包括加工产生的半乳糖脑苷（+）寡突胶质细胞（图。​（图77D、 E类)和GFAP（+）星形胶质细胞（图。​（图77F、 G公司). 总的来说，我们既不能使用其他实验室描述的方法建立高度富集的海马神经元的健康培养物，也不能可靠地解释此类制剂中的Aβ毒性。因此，我们无法评估Aβ对无胶质脑神经元原代培养物的直接作用。

特定斑块蛋白激活人类小胶质细胞

人类小胶质细胞对Aβ以及其他刺激物的反应可能与啮齿动物小胶质细胞的反应不同。例如，活化的啮齿动物巨噬细胞富含诱导型一氧化氮合酶（iNOS），并产生细胞毒性水平的NO(Lees，1993年). 我们发现，在这里使用的海马培养系统中，脂多糖（≥100 ng/ml）诱导大鼠小胶质细胞iNOS，导致神经元的NO-依赖性杀伤。在该培养体系中，培养基中的硝酸盐/亚硝酸盐水平与神经元丢失呈剂量依赖关系，在15μ米硝酸盐/亚硝酸盐及以上（数据未显示）。另一方面，人类巨噬细胞被认为含有很少的iNOS，产生的NO量可以忽略不计(丹尼斯，1994年). 因此，iNOS参与AD病理，正如最近由Meda等人（1995年），仍不确定。为了比较人类细胞与大鼠的反应，我们从尸检时迅速恢复的正常成人大脑中分离出人类小胶质细胞(朱利安等人，1995年，b）。这些人脑单核细胞的行为与大鼠小胶质细胞一样，吞噬神经炎/核心斑块和收缩过程(朱利安等人，1995年). 合成的Aβ肽和天然斑块组分S3、S4和S5均诱导人类小胶质细胞产生神经毒性（图。​（图88A、 B类)与大鼠小胶质细胞的模式相同。虽然Aβ1-40和Aβ1-42是神经毒性人类小胶质细胞的有效诱导剂，但这些肽不会导致硝酸盐或亚硝酸盐的释放（图。​（图88C、 D类). Aβ暴露于大鼠小胶质细胞（数据未显示）和LPS暴露于人类小胶质细胞均未导致硝酸盐或亚硝酸盐水平高于1.5μ米这些观察结果反对小胶质细胞iNOS参与AD的神经元病理。总体而言，人类和大鼠小胶质细胞对Aβ的反应相同，在与完整的人类Aβ1-42或Aβ1-40肽培养时均表现出神经毒性（图。​（图88E类).

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图8。

人类小胶质细胞与神经元杀伤。A类，只有溶解的神经炎/核心斑块中含有Aβ的部分[峰值S3（54 n米)，S4（220牛顿米)和S5（250 n米)]诱导人类小胶质细胞参与神经毒性行为。B类，当在1μ米浓度、合成的Aβ1-40和Aβ1-42也能刺激人小胶质细胞释放神经毒素，而较小的Aβ片段则无作用。尽管神经元被杀死，但没有证据表明人类细胞受到天然或天然硝酸盐刺激后会增加硝酸盐或亚硝酸盐的生成(C类)或合成的(D类)Aβ。E类，暴露于1μ米Aβ1-42或Aβ1-40的人类形态。然而，啮齿动物型Aβ1-40和人类Aβ片段（包括1-28、12-28和17-43）都是不活跃的。

Aβ作为间接神经毒素

据报道，许多细胞毒性因子参与了Aβ神经毒性，包括自由基(Behl等人，1994年)，否(Meda等人，1995年)，细胞因子(Mrak等人，1995年)和NMDA类分子(朱利安等人，1995年). 为了确定短寿命因子是否在aβ诱导的小胶质细胞杀伤神经元中发挥作用，我们比较了当小胶质细胞在神经元之间混合（接触）或通过放置在滤过底部的Millex细胞室（无接触）与神经元分离时的神经元丢失。Aβ1-40和1-42以及天然斑块部分刺激小胶质细胞破坏神经元，尽管小胶质细胞和神经元分离（数据未显示）。这些观察结果排除了短寿命自由基中间体的参与，因为这些试剂需要分泌细胞和靶细胞之间的紧密联系。此外，在与维生素E、过氧化氢酶或谷胱甘肽等自由基清除剂或iNOS的有效抑制剂如二苯碘（DPI）或我-N个-5-（1-亚氨基乙基）鸟氨酸盐酸盐(我-NIO；图。​图99A类). 虽然作用于非NMDA受体位点的谷氨酸拮抗剂不能保护神经元，但NMDA受体拮抗剂（图。​（图99B类)包括AP5、AP7、MK-801和ifenprodil，在低浓度（10μ米).

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图9。

药物阻断大鼠和人小胶质细胞Aβ诱导的神经元杀伤。为了研究细胞杀伤的机制，我们用1μ米Aβ1-42(大鼠/Aβ1-42)和含有S5组分（含250 n）的人类细胞米来自可溶性神经炎/核心斑块的天然Aβ1-42）(人/S5峰值).A类，作为自由基清除剂的药物（维生素E，100μ米; 过氧化氢酶，25 U/ml；谷胱甘肽，100μ米)不阻断小胶质细胞对神经元的杀伤。一氧化氮合成酶抑制剂没有观察到保护作用我-N个-5-（1-亚氨基乙基）鸟氨酸盐酸盐(我-NIO；10 μ米)或二苯基碘（DPI；300 n米)尽管NMDA拮抗剂AP5可以防止神经元死亡。B类、作用于受体部位的其他NMDA拮抗剂(AP7（AP7）)，在多胺监管场所(伊芬诺地尔)或离子通道(MK801型)所有这些都阻止了神经元死亡，而非NMDA谷氨酸拮抗剂(GAMS游戏,BNQX公司)没有。所有药物均在10μ米.C类从Aβ刺激的大鼠小胶质细胞条件培养基中分离神经毒素(Aβ1-42/小胶质细胞)或来自冰冻AD灰质(AD大脑)涉及在pH 10.5的乙酸乙酯中萃取、酸水解和顺序梯度RP-HPLC（C18柱，在dH中使用0–20%乙腈梯度₂O和0.1%三氟乙酸）。小胶质条件培养基中的神经毒素活性与AD脑组织中的神经毒性活性通过使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）在～14%乙腈条件下进行共净化。对照组脑提取物或非刺激小胶质细胞培养液中未发现神经毒性（数据未显示）。

从Aβ1-40或Aβ1-42刺激的人类小胶质细胞中回收的神经毒素经煮沸后显示出低分子量（<1000 Da(朱利安等人，1995年). 这些特性中的每一个都与神经毒性酚胺相同，酚胺可以从AD大脑中提取。PFPA、荧光胺和血浆胺氧化酶对小胶质细胞源性和脑源性神经毒素的灭活表明活性部位存在末端胺基，而对酸化丁醇酯化反应不敏感则表明缺乏羧基(朱利安等人，1995年). 总的来说，来自Aβ刺激的小胶质细胞的活性主体表现出与从AD灰质或斑块刺激的小胶质细胞培养基中回收的神经毒素相同的特性(朱利安等人，1995年). 神经毒素的蛋白酶不敏感性和耐酸水解性（6N HCl，105°C，24小时）排除了肽因子，包括细胞因子和Aβ本身。串联离子交换柱上的共沉淀证实了小胶质细胞源性和AD脑源性亲脂性杀伤因子的相同特性。如图所示​图99C类aβ刺激的小胶质细胞的一个生物活性单峰与反相高效液相色谱法从AD脑中提取的毒素共存。先前的研究表明，这种纯化剂是一种对海马神经元有效的毒素在体外或体内在微微极范围内(朱利安等人，1995年).

特异性Aβ结构域与小胶质细胞结合

接下来我们讨论了Aβ肽如何激活小胶质细胞的问题。因为粘附斑块可能是反应性胶质细胞募集的重要第一步，所以有理由将Aβ视为斑块表面小胶质细胞的潜在锚定位点。为了验证这一假设，将合成的Aβ肽或天然斑块衍生蛋白共价偶联到90μm Sepharose珠。然后将这些珠子漂浮在附着在塑料培养皿上的培养小胶质细胞上。在30分钟内，小胶质细胞开始从培养皿上脱落，并固定在与天然斑块蛋白或合成Aβ1-42共价偶联的珠上（图。​（图1010A、 B类). 在6小时内，粘附在斑块蛋白包衣珠上的小胶质细胞数量比粘附在与甘氨酸或BSA偶联的对照珠上的细胞数量增加了五倍（图。​（图1010C类). 有趣的是，含有N端残基（如Aβ1-28）的Aβ肽也能促进细胞结合，而C端部分（Aβ17-43）则不能（图。​（图1010C类).

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图10。

Aβ结构域和与小胶质细胞的相互作用。A类，大鼠小胶质细胞粘附于与人Aβ1-42肽偶联的Sepharose珠的相显微照片。B类，同一珠子的荧光显微照片显示贴壁细胞被荧光小胶质标记物DiI-ac-LDL标记。比例尺，20μm。C类，大鼠小胶质细胞在6小时后粘附到Sepharose-coupled珠。源于神经炎/核心斑块的斑块蛋白为小胶质细胞提供了锚定位点，Aβ1-42也是如此。重要的是，Aβ1-28也促进了珠子结合，而Aβ17-43则没有。对照组包括与甘氨酸偶联的珠子(对照甘氨酸)和牛血清白蛋白(控制-BSA). 所示数据表示为37°C下孵育6小时后，每100个随机选择的珠子的粘附细胞数±SE。

为了进一步描述Aβ肽的哪些部分作为小胶质细胞结合位点，我们接下来比较了各种与直径为1μm的微球耦合的合成肽。我们发现，在孵育4小时内，发生了与Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-16或Aβ12-28偶联的微球的明显胶质结合（图。​（图1111A–F)与Aβ17-43、Aβ25-35、Aβ36-42或啮齿动物Aβ1-40（5_{精氨酸→甘氨酸}, 10_Tyr→Phe, 13_{他的→阿格}). 由于人类和啮齿动物形式的Aβ的结构差异发生在N末端的残基5和13之间，因此我们接下来重点研究这个特定结构域的特性。如图所示​图1111克，Aβ12-28微球为细胞提供了锚定底物，而Aβ1-11没有。七肽的检测证实了残基10和16之间的小胶质细胞结合域（图。11克).

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图11。

激活神经毒性小胶质细胞需要β细胞结合域。荧光显微照片显示微球与大鼠小胶质细胞（500/mm）富集培养物结合²)在37°C下孵育4小时后。Aβ肽与荧光微球的偶联显示Aβ1-42(A类)，Aβ12-28(D类)和Aβ10-16(E类)容易结合，而肽Aβ17-43(B类)，Aβ1-11(C类)和Aβ1-5(F类)没有。结合模式的定量(克)表明含有氨基酸残基10–16的N末端区域是Aβ与小胶质细胞结合所必需的。在200倍放大率下观察时，数据表示为平均值±SE。

Aβ17-43和Aβ1-40都不支持N末端细胞结合域对Aβ-小胶质细胞相互作用的重要性_啮齿动物尽管测试浓度高于人类Aβ1-40所需浓度的100倍（图。​（图44E类,​,88E类). 结合和毒性模式预测，10–16结合区是激活神经元杀伤小胶质细胞的必要成分。为了验证这一假设，我们接下来以越来越高的浓度孵育Aβ10-42，发现它在诱导小胶质细胞依赖性杀伤细胞方面几乎与Aβ1-42一样有效（图。​（图44E类,​,1212A类). 然而，Aβ10-16结合域或17-43区域本身并没有损伤神经元（图。​（图1212A类). 因此，人类Aβ的N末端（尤其是残基10–16）对于诱导神经毒性小胶质细胞是必要的，尽管还不够（图。​（图1212B类).

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图12。

Aβ对小胶质细胞作用的比较。A类，剂量-反应曲线显示，尽管Aβ10-16能够与小胶质细胞结合，但它并没有引发神经毒性小胶质细胞。将该小胶质结合域添加到Aβ17-42（既不与小胶质结合也不引起毒性）中，产生了一种肽Aβ10-42，它既与小胶质相结合，又刺激小胶质杀死神经元。B类，图表比较了正在研究的合成肽的结构和功能。阴影区域说明了Aβ的N-末端部分，其在人类和大鼠形式之间不同，是小胶质细胞粘附所必需的。

讨论

自描述以来博尔西（1927）对于AD脑斑块附近的反应性小胶质细胞，尚不确定这些反应性非神经元细胞是否真的参与了疾病过程，还是仅仅反映了正在进行的病理学。然而，最近已经清楚的是，反应性小胶质细胞仅围绕大脑中某些类型的淀粉样沉积（神经炎和核心斑块），而忽略了附近其他类型的沉积，包括弥漫性斑块(Perlmutter等人，1992年;朱利安等人，1995年). 反应性胶质细胞分布的这种选择性表明，神经炎和核心斑块内的特定信号会导致脑炎症。随着人们越来越认识到反应性小胶质细胞可以通过释放细胞毒因子介导神经元损伤(Banati等人，1993年;朱利安等人，1993a)关于小胶质细胞参与AD的推测包括补体蛋白的释放(Rogers等人，1988年,1992)，细胞因子(Meda等人，1995年;Mrak等人，1995年)、NMDA类毒素(Piani等人，1991年;朱利安等人，1993a、b）和自由基(Thery等人，1991年;Hensley等人，1994年). 最近，我们的实验室表明，暴露于神经炎/核心斑块片段的培养的人类小胶质细胞分泌一种高度神经毒性的酚胺(朱利安等人，1995年). 这种酚胺似乎通过与NMDA受体复合体的直接相互作用发挥其毒性作用，因为其作用被NMDA受体拮抗剂阻断。此外，这种小胶质细胞衍生的神经毒素也从斑块状AD灰质中分离出来。神经毒素的组织浓度与反应性小胶质细胞簇的组织密度之间的强相关性(朱利安等人，1995年)为斑块-小胶质细胞相互作用与神经元病理学之间的联系提供了进一步证据。

如本文所述，小胶质细胞神经毒性斑块诱导的主要信号是Aβ肽。AD脑中的斑块碎片诱导小胶质细胞产生神经毒性；然而，只有那些含有Aβ1-42（或Aβ1-40）的可溶性斑块组分刺激大鼠和人类小胶质细胞呈现反应性形态并产生神经毒性。用合成肽进行的测试证实，全长1–42肽是一种有效的神经杀伤小胶质细胞诱导剂，而截短的aβ1-40稍逊于此。其他形式的aβ，包括肽aβ1-28、aβ12-28和aβ17-43，都是不活跃的。一些证据表明，β淀粉样蛋白的二级或三级结构对小胶质细胞的激活并不重要。例如，啮齿类动物Aβ1-42不会引起毒性，也会形成β折叠片，与人类肽一样(弗雷泽等人，1992年). 此外，Aβ17-42比Aβ1-42更容易聚集(Gowing等人，1994年; 表​表2），2)也不能诱导毒性。事实上，通过测试各种肽片段，我们发现N端和C端区域似乎在小胶质细胞激活中发挥着独立和必要的作用。小胶质细胞与肽偶联珠的相互作用表明，N末端区域是肽锚定到细胞所必需的。这一发现可能解释了啮齿类动物Aβ不能诱导神经毒性，因为啮齿类植物Aβ的前16个氨基酸与人类Aβ结构域不同。有趣的是，残基1-16构成了分子的亲水部分，因此可以用于小胶质细胞与斑块的连接。没有这个连接域，Aβ就不能诱导毒性，如Aβ17-42不能激活小胶质细胞所示。然而，Aβ的C末端仍然是诱导毒性所必需的，因为仅N末端（1–16）无法诱导小胶质细胞神经毒性。总的来说，残留物邻近13_伊斯在指导Aβ与小胶质细胞的相互作用中发挥重要作用（Giulian等人，1996年）。

值得注意的是，此处报道的Aβ对小胶质细胞神经毒性的影响与直接的其他实验室描述的Aβ的神经元杀伤作用（Yankner，1990；Pike等人，1991年,1993;Cotman等人，1992年). 大多数探索直接毒性的实验室都仔细描述了那些特定的细胞培养条件，或aβ肽制备的特定方案，这些对创造细胞杀伤环境至关重要(Pike等人，1991年,1993;Mattson等人，1992年;Howlett等人，1995年;Pollack等人，1995年). 例如，低细胞数似乎是证明Aβ直接杀伤的必要条件，细胞密度通常<100/mm²(Mattson和Rydel，1992年). 此外，一些研究小组报告说，只有当培养物在规定的孵育期后暴露于肽中，才会出现毒性作用在体外(Yankner等人，1990年)只有当胶质细胞中毒(派克等人，1995年)，仅当考虑合成肽之间的批间差异时(May等人，1992年)，仅当合成肽“老化”时(Pike等人，1991年,1993)或仅当存在谷氨酸或其他谷氨酸受体激动剂时(Koh等人，1990年;Mattson等人，1992年). 不幸的是，小胶质细胞（在胚胎大鼠海马培养物中可能占5%至10%的细胞）的特异性标记很少使用，因此无法评估神经毒性小胶质细胞对这些其他培养系统的贡献。

我们的在体外对系统进行了优化，以维持健康长寿的神经元/星形胶质细胞培养，并对其进行了控制，以检查小胶质细胞与神经元的相互作用。这些培养物在几个重要方面与其他研究人员描述的分析不同。首先，我们的神经毒性试验使用高密度培养物，比上述低密度培养物大一个数量级。在这种情况下，我们发现Mattson和Rydel（1992），Aβ无直接毒性作用。第二，这里使用的培养系统非常支持神经元的生长，如广泛的神经炎投射和测试期后数周的生存能力所示。在用有丝分裂抑制剂中毒的培养制剂中或在非常低密度的培养中，神经元存活率自发下降至少50%(Mattson和Rydel，1992年)这使得很难监测和解释任何细胞毒性试剂的作用。第三，必须清楚地证明培养系统中的小胶质细胞含量，因为原代海马培养物中存在的内源性小胶质细胞群在暴露于Aβ1-42时具有完全的神经毒性。最后，我们使用神经元特异性标记物（MAP-2和NF）的组合来准确监测混合细胞群中的神经元。相反，相位显微镜（在发育中的脑细胞培养中很难解释）、乳酸脱氢酶释放到培养液中（发生任何细胞损伤后）或神经元特异性烯醇化酶（+）细胞（包括胚胎培养中的神经元和胶质细胞）减少不能区分神经元和非神经元细胞的存活。显然，在体外模型必须谨慎解释，因为它们只代表AD病理学的近似值，而且都容易出现细胞培养的伪影。虽然Aβ的直接和间接神经毒性作用可能在AD的神经病理学中起作用，但Aβ诱导神经毒性小胶质细胞的显著效力表明，间接免疫介导的途径可能是重要的。

这里描述的观察结果指出了干预AD中神经毒性小胶质细胞引起的病理学的策略；这些包括：（1）抑制信号通路，使神经炎/核心斑块将静止的小胶质细胞转变为反应性小胶质细胞；（2）抑制小胶质细胞合成和分泌神经毒素；（3）阻断神经毒素对神经元的攻击。为了寻求第一种策略，目前正在进行实验，以确定和操纵Aβ的特定结构域，该结构域负责Aβ诱导的细胞级联反应中的各个步骤，从而导致神经毒性小胶质细胞。由于AβN末端部分的细胞附着域本身没有毒性，因此可能通过与小Aβ肽竞争来选择性阻断神经毒性小胶质细胞的诱导。包括第二种策略的治疗反映在几项回顾性研究中，这些研究表明抗炎药对AD有益，并根据这些数据建议进行治疗试验(Breitner等人，1990年;McGeer等人，1990年;施纳贝尔，1993年;Eikelenboom等人，1994年;Lucca等人，1994年). 然而，由于常用的免疫抑制剂（包括糖皮质激素）不能降低大脑单核吞噬细胞的神经毒性活动(朱利安，1992年)，需要进一步研究氯喹等小胶质细胞抑制剂(朱利安等人，1989年;朱利安和罗伯逊，1990年). 最后，如图所示​图99B类NMDA受体拮抗剂可以阻断斑活化小胶质细胞分泌的神经毒素。也许NMDA受体拮抗剂目前正在中风、创伤和癫痫的临床试验中，可能对AD患者有益。我们认为，抑制神经毒性小胶质细胞提供了许多治疗策略，可以减缓阿尔茨海默病中的神经元丢失。

脚注

参考文献