认知心理学研究表明,记忆具有阶段性,通常分为至少两个不同的时间阶段:短期记忆,持续数分钟到数小时;长期记忆,可以持续数天、数周甚至更长时间(有关综述,请参阅Polster等人,1991年). 短暂应用mRNA和蛋白质合成抑制剂可选择性阻断长期记忆的诱导,而不会影响短期记忆(戴维斯和乡绅,1984年;Castellucci等人,1989年;Crow和Forrester,1990年;Tully等人,1994年). 与诱导相反,长期记忆一旦建立,就不需要大分子合成来维持(Davis和Squire,1984年). 对内隐记忆和外显记忆存储的分子研究表明,在这两种情况下,从短期记忆到长期记忆的巩固或转换都涉及基因和蛋白质的诱导。
对无脊椎动物从短期记忆向长期记忆转变的研究提供了证据,证明这种转变可以在分子水平上定义。在海螺中,海兔属对鳃反射和虹吸反射致敏记忆的研究揭示了细胞水平上的机制差异。感觉细胞和运动细胞之间的联系显示了突触前促进的短期和长期保持(一种有助于敏化的机制)之间的区别。突触强度的短期增强是通过预先存在的蛋白质的翻译后修饰实现的,并由cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)和蛋白激酶C(PKC)介导(Castellucci等人,1980年;Montarlo等人,1986年;Ghirardi等人,1992年;Byrne等人,1993年). 长期过程需要新的蛋白质合成和cAMP介导的基因表达,通过激活CREB-1和缓解CREB-2的抑制(Montarlo等人,1986年;Dash等人,1990年;Alberini等人,1994年;Bartsch等人,1995年)并导致新突触连接的生长(格兰兹曼等人,1990年;Nazif等人,1991年). 同样,关于果蝇属表明学习和短期记忆需要PKA,长期记忆需要CREB启动的基因表达(Tully等人,1994年;Yin等人,1994年).
最近的实验表明,哺乳动物大脑中的外显记忆存储可能涉及类似的机制。显性学习包括获取关于人、地点和事物的信息,并且严重依赖于颞叶内的结构,包括海马体。在海马体内,有三条显著的串联突触通路和几个次要的通路(Andersen等人,1971年;阿马拉,1993年). 海马的输入来自内嗅皮层的神经元,通过穿孔通路(外侧和内侧)与齿状回的颗粒细胞突触。颗粒细胞将轴突(苔藓纤维)发送到CA3区锥体细胞上的突触。最后,CA3锥体细胞将轴突(Schaffer侧支)发送到CA1区的其他锥体细胞。人们认为,这三条连续通路中的任何一条受损都足以导致人类记忆受损(Zola-Morgan等人,1986年).
已知海马神经元在短暂高频刺激三条主要通路中的任何一条后,突触强度会持续增加(布利斯和勒莫,1973年)(有关审查,请参阅Bliss和Collingridge,1993年). 在自由运动的动物中,突触强度的活动依赖性增加可以持续数小时甚至数天,这被称为长期增强(LTP)。
LTP在海马切片中的研究最为广泛(Andersen等人,1977年). 这些研究揭示了三种途径中LTP诱导机制的重要差异(有关综述,请参阅Bliss和Collingridge,1993年). 与行为记忆一样,CA1和CA3区域的LTP由两个生物化学上不同的时间阶段组成。有一个早期阶段,持续1至3小时,与蛋白质和RNA合成无关,还有一个后期,更持久的阶段,需要新的蛋白质和RNA的合成,并由cAMP介导(Frey等人,1993年;马蒂斯和雷曼,1993年;Huang和Kandel,1994年;Huang等人,1994年;Nguyen等人,1994年).
海马脑片的穿孔通路中是否也存在LTP的晚期?这样的晚期还需要cAMP的参与、蛋白质的合成和基因的诱导吗?与苔藓纤维和Schaffer侧支通路中的LTP不同,对贯穿通路中LTP的研究大多是在麻醉或自由运动的动物中进行的。相对较少的研究检测了急性海马脑片穿孔通路中的LTP(有关例外,请参见汉斯和古斯塔夫森,1992年,b,1994年;Colino和Malenka,1993年),这些研究没有涉及后期阶段(诱导后>1小时),也没有探索蛋白质合成和基因诱导在这些阶段的可能参与(但对于体内数据参见Krug等人,1984年;科尔等人,1989年;Otani等人,1989年;钱等人,1993年).
在本研究中,我们检测了大鼠海马脑片中的内侧穿孔通路(MPP),发现在细胞外镁含量降低的情况下,该通路的反复强强韧化可以诱导突触传递的长时程增强(L-LTP)。这种L-LTP被蛋白质和RNA合成抑制剂选择性阻断,而LTP的早期、短暂阶段仍然不受这些抑制剂的影响。我们还发现,PKA的抑制阻断了LTP的后期,而不影响早期。我们的结果,加上来自海马CA1和CA3区以及来自海兔属(Frey等人,1993年;Alberini等人,1994年;Huang和Kandel,1994年;Huang等人,1994年;Nguyen等人,1994年)支持长期突触促进的共同机制,包括cAMP和新蛋白质和mRNA的合成,可能是脊椎动物和无脊椎动物几种不同学习形式的短期记忆转换为长期记忆的细胞表征的基础。
结果
低镁中的反复强韧化诱导MPP中的L-LTP
作为确定在MPP中成功诱导L-LTP的条件的第一步,我们尝试在50μ米苦毒毒素,一种GABAA类敌手。以前的一项研究表明,在缺乏药物去抑制(通过苦毒毒素)的情况下,在穿孔途径中几乎不能可靠地诱导增强作用(维格斯特罗姆和古斯塔夫森,1983年,b)。仅用两列100赫兹的测试强度(间隔20秒),我们就能够在苦曲霉毒素存在的情况下诱导持续3小时的LTP。然而,样本场EPSP扫描显示多个诱发后放电(图。A类)LTP维护期间的所有时间。我们的实验旨在测试L-LTP表达中翻译和转录的关键要求,但这种癫痫样活动并不令人满意。由于神经元中的电活动可以调节和激活大分子合成,因此苦毒毒素持续的癫痫样后放电排除了进一步使用这种强有力的GABA拮抗剂的可能性。
重复强直作用可诱导MPP中的短时间或长时间增强(L-LTP)。A类,在50μ米苦毒毒素,两个100Hz序列(间隔20秒)诱发L-LTP,但也诱发诱发场EPSP后的重复性后放电。在指定的时间从切片中记录样本痕迹。校准条:2 mV,4 msec。B类,从图形上的“0 min”开始,每分钟施加一次三个100 Hz序列(以两倍测试脉冲宽度),从而诱发短时增强。根据该方案,强直化后60-90分钟,促进水平下降至基线水平的125%以下。在6组100 Hz的刺激下,诱导了一个持续时间较长的增强,虽然持续,但幅度不同:在强直化60分钟后,7个切片中有3个显示<50%的促进作用。在这两种方案中,生理盐水中存在正常钙和50%的正常镁水平。C类,10个100 Hz序列在50%镁盐中诱导MPP场EPSP的强健和持续增强(实心圆圈;n个 = 11). 相反,相同的方案在正常镁盐中只产生了中等程度的促进作用(下曲线,开放符号). 正常镁的增强水平显著低于还原镁盐的增强水平,从强直后20分钟开始,一直持续到强直后130分钟,平均仅为早产儿基线水平的122%。在破甲前10分钟和破甲后2小时记录样品场EPSP痕迹。校准棒:2 mV,4 msec。D类,从在还原镁盐中进行强直处理的切片上测得的样品场EPSP痕迹显示出强大的增强作用,没有重复的后放电(与A类). 校准棒:2 mV,4 msec。
大鼠海马脑片MPP中的LTP依赖于NMDA受体的激活(汉斯和古斯塔夫森,1992年b; 科利诺和马伦卡,1993年)。因此,我们决定将镁的盐分水平降低到正常值的50%,并对MPP应用不同数量的100 Hz序列(持续时间1秒,测试强度的两倍)。
在镁含量降低的情况下,三个100 Hz序列(每分钟发送一次)引发了短时增强,在70分钟后衰减至早产基线的128±4%(图。B类;n个 = 7). 强直后3小时,增强水平为基线水平的116±7%。相比之下,在相同条件下,六个100 Hz序列诱导的LTP略强,与三个序列的LTP在幅度上显著不同(图。B类;对强直90分钟后的时间点<0.05)。然而,在6个序列中观察到的增强幅度存在较大的变异性:在这些实验的3小时持续时间内,测试的7个切片中有3个未能将增强水平保持在早产儿基线的150%以上。因此,我们寻求更强大的诱导方案,以可靠地诱导持续3小时的强健增强。
使用相同的离子条件(50%镁,正常钙),我们接下来对MPP施加10组刺激(两倍测试强度,每分钟施加一次)。我们发现,该方案诱导了一种非常强健和稳定的LTP形式,在强直化后至少持续3小时。强直后1小时、2小时和3小时记录的平均增强水平分别为早产儿基线水平的175±11、170±12和158±15%(图。C类;n个 = 11). 在一些切片中,这种增强持续了7小时(P.Nguyen,未发表的观察结果)。相比之下,在镁和钙水平正常的情况下,10列车在1小时、2小时和3小时后诱导的易化水平分别为123±14、121±15和139±17%(图。C类;对<0.02(对于1小时和2小时的值)。因此,降低镁的10列诱导方案被证明是在MPP中诱导稳定和稳健形式的L-LTP的最可靠方案。检查LTP维护期间记录的现场EPSP扫描样本(图。D类)进一步表明,这种10次训练方案在测试的11个切片中的任何一个切片中都没有引发癫痫样放电。因此,我们决定将此诱导方案用于MPP中L-LTP的其余实验。
MPP中的LTP依赖于NMDA接收器
先前对海马切片MPP中LTP的研究表明,NMDA受体的激活对于LTP的诱导是必要的(Hanse和Gustafson,1992b;Colino和Malenka,1993)。这些研究使用了苦毒毒素和与我们不同的诱导方案;因此,我们测试了由我们目前的方案(10个100 Hz的还原镁序列)诱导的LTP形式是否也依赖于NMDA受体。
在NMDA受体拮抗剂2-氨基-5-磷酸(APV;100μ米),在镁含量降低的情况下,10个100 Hz序列未诱导增强(图。;对与对照未经处理的切片相比,<0.01)。因此,我们用10列还原镁刺激诱发的LTP的形式依赖于NMDA受体的激活。
重复强直诱导的MPP-LTP依赖于NMDA受体的激活。NMDA受体拮抗剂APV(100μ米)从强韧化开始前20分钟开始,施加30分钟的阻止增强作用。破伤风后第一次记录的反应是在10列100 Hz序列中的最后一列(以两倍测试脉冲宽度交付一次/分钟)后1分钟获得的;因此,没有观察到强直后电位。所有实验均使用含50%正常镁水平的生理盐水进行。
蛋白质合成对MPP中LTP晚期而非早期的表达至关重要
先前关于L-LTP在CA1中表达的研究(Frey等人,1991年;Huang和Kandel,1994年)和CA3区域(Huang等人,1994年)海马体的表达表明需要新的蛋白质合成。此外,在体内齿状回中的LTP也表明维持LTP需要新的蛋白质合成(Krug等人,1984年;Otani等人,1989年;Fazeli等人,1993年). 在我们目前的实验中,我们决定测试蛋白质合成是否对海马脑片MPP中L-LTP的表达至关重要。我们发现,40分钟的暴露(从破甲前15分钟开始)到25μ米在破伤风作用后80分钟开始,蛋白质合成抑制剂埃米汀显著降低LTP。然后,药物治疗组的增强水平为基线水平的127±10%,而未治疗组为170±12%(图。第1页;对 < 0.02). 在随后的所有时间(在强直处理后80分钟后),经催吐剂处理的切片中的增强水平显著降低(对<0.01)比控制切片中达到的水平(图。第1页). 与10个刺激序列诱导的L-LTP衰减相反,催吐碱对3个刺激序列诱导的短时程增强的衰减没有影响(图。A2类). 在所有检查的时间点,药物治疗组和对照组切片之间的三列增强没有显著差异(对 > 0.5). 这些实验首次在海马脑片中证实,齿状回MPP中LTP晚期的表达需要新的蛋白质合成。此外,依米汀对基线现场EPSP和LTP早期没有显著影响(图。A2类,B类).
MPP中LTP的晚期需要蛋白质合成。第1页,在暴露于25μ米emetine(蛋白质合成抑制剂)40min。LTP的早期阶段,从强直化后立即持续到强直化约70分钟,不受依米汀的影响。在破甲前10分钟和破甲后3小时记录样本场EPSP痕迹。比例尺:2毫伏,4毫秒。A2类、Emetine(25μ米)对三个100Hz序列(以两倍测试脉冲宽度发送一次/分钟)诱导的短时增强没有影响。控制,打开的符号; 催眠药,填充符号.B类,急性应用25μ米依米汀40min对0.02Hz时诱发的基线场EPSP无明显影响。
MPP中LTP的晚期由转录介导
我们还测试了在MPP中表达L-LTP是否需要基因转录。海马脑片急性暴露于40μ米ACT-D或0.2米米5,6-二氯-1-β-d日-两种转录抑制剂核糖呋喃氧基苯并咪唑(DRB)显著减弱晚期LTP,但不影响早期LTP。在ACT-D的情况下,从破伤风作用后80分钟起,药物处理的切片中的增强水平显著低于对照组(图。第1页;对 < 0.05). 强直化3小时后,对照组的增强水平为基线水平的182±16%,药物治疗组为130±10%(图。第1页;对 < 0.05). 对于DRB,我们观察到L-LTP的衰减稍微缓慢一些。从强直作用后100分钟开始,DRB处理的切片中的增强水平显著低于对照组(图。地下一层;对此后所有时间点均<0.05)。强直化后3小时,对照组和DRB治疗组切片的促通水平分别为161±11和118±8%(图。地下一层;对 < 0.05). 因此,在之前已经显示的浓度下,可以有效地阻断海马脑片中的转录(参见Nguyen等人,1994年),这两种转录抑制剂(通过不同的阻断机制发挥作用)显著减弱了LTP的晚期,而不影响MPP的早期阶段。
基因转录介导MPP中LTP的晚期。第1页,地下一层,两种不同的转录抑制剂,放线菌素D(ACT D;40μ米)和DRB(0.2米米),在脱丁烷开始前30分钟开始施用1小时时阻断L-LTP的表达。ACT D破伤风后80分钟开始,药物治疗切片的促通水平显著降低(第1页)以及DRB破伤风后100分钟(地下一层) (对<0.05对于未配对t吨与控制切片的测试比较)。在破伤风作用前10分钟和作用后3小时分别记录样本场EPSP痕迹第1页和地下一层。两个图形的校准条:2 mV,4 msec。A2类,地下二层,都不是40μ米ACT-D或0.2 m米DRB显著影响0.02 Hz时诱发的基线场EPSP。将ACT D溶解在DMSO中(最终浓度为0.1%)。
MPP反复强直诱导PKA依赖性LTP晚期
早期研究表明,cAMP依赖性蛋白激酶活性对Schaffer侧支通路中LTP晚期而非早期的表达至关重要(Frey等人,1994;Huang和Kandel,1994年)在苔藓纤维通路中(Huang等人,1994年). MPP中LTP的晚期是否也依赖于PKA活性?
为了解决这个问题,我们测试了两种PKA抑制剂Rp-cAMPs和KT-5720的作用,这两种抑制剂具体作用于调节亚基和催化亚基。暴露于50μ米Rp-cAMPS(在开始强直化前15分钟开始),与仅强直化的对照切片相比,药物处理切片中的增强作用从强直化后30分钟开始显著减弱(10个100 Hz序列)(图。第1页;对从破伤风化后30分钟开始,所有时间均<0.05)。KT-5720在破伤风化前15分钟开始使用25分钟,也显著降低了药物处理切片中的增强作用(图。第1页;对从强直化后50分钟开始,所有时间均<0.05)。对于这两种抑制剂,破伤风作用3小时后观察到的增强水平分别为基线的99±9%(Rp-cAMPS)和108±11%(KT-5720);在未经治疗的对照组中,这些值分别为基线值的158±15和149±10%(图。第1页,第1页;对 < 0.05).
PKA抑制剂Rp-cAMPS阻断海马脑片MPP中LTP晚期的表达。第1页,用50μ处理切片米从破伤风作用前15分钟开始,40分钟的Rp-cAMPS显示出衰减的LTP,这明显小于破伤风处理后30分钟及之后未经处理的对照切片中观察到的增强。Rp-cAMPS的应用与强韧化协议重叠(10列100 Hz序列,以两倍于测试脉冲宽度的速度每分钟交付一次)。在破伤风前10分钟和第一次破伤风后3小时进行样本扫描。校准棒:2 mV,4 msec。A2类,三个100 Hz序列(以两倍测试脉冲宽度每分钟一次)引起的短时增强不受50μ的影响米Rp-cAMPS。使用与零件L-LTP图相同的时间窗口应用Rp-cAMP第1页.控制装置,打开的符号.B类,Rp cAMPS(50μ米)应用40min对0.02Hz刺激MPP诱发的基线场EPSP斜率无明显影响。
PKA的第二个抑制剂KT-5720也可阻止MPP中L-LTP的充分表达。第1页,30分钟涂抹1μ米在强直作用前15分钟开始的KT-5720,在强直化后30–40分钟开始引起了延迟性增强下降。从破伤风作用后60分钟开始,药物治疗组切片的促通水平显著低于对照组切片(对破伤风化后60分钟及此后所有时间<0.05)。使用与图中相同的方案诱导L-LTP.在破伤风化开始前10分钟和开始后3小时记录样本现场EPSP扫描。校准棒:2 mV,4 msec。A2类,三个100 Hz序列(以两倍测试脉冲宽度交付一次/分钟)诱导的短时促进不受1μ的影响米KT-5720。抑制剂的使用时间与部分使用时间相同第1页此图表的。控制,填充符号.B类,切片急性暴露于1μ米KT-5720持续30分钟对0.02Hz刺激MPP诱发的基线场EPSP无影响。将KT-5720溶解在二甲基亚砜中(最终浓度为0.1%)。
与L-LTP的衰减相反,Rp-cAMPS和KT-5720对仅用三个100Hz刺激序列诱发的短时增强没有显著影响(图。A2类,A2类). 用这两种抑制剂处理的切片显示出增强作用,在破伤风治疗后3小时内,增强作用减弱至早产儿基线水平的100–110%。未接触抑制剂的对照切片也显示出逐渐衰减的增强,其幅度与治疗切片中观察到的幅度没有显著差异(图。A2类,A2类;对对于两个图中的所有点,>0.5)。
我们的研究结果表明,与苔藓纤维和Schaffer侧支通路中的L-LTP一样,MPP中LTP的晚期也需要PKA活性才能充分表达。此外,由较少的序列诱导的短时增强不需要PKA活性。
Forskolin是一种腺苷酸环化酶激活剂,在MPP中诱导L-LTP的转录依赖型
为了探索通过激活cAMP信号通路来模拟MPP中的L-LTP的可能性,我们在0.02 Hz的MPP测试刺激期间将forskolin(腺苷酸环化酶激活剂)应用于切片。15分钟涂抹50μ米通过MPP刺激诱发的forskolin增强场EPSP:应用forskolin后1小时、2小时和3小时记录的平均场EPSP斜率分别为预orskolin基线的148±9、158±12和160±11%(图。A类;n个 = 7). 这些值明显大于用等浓度的无活性毛喉素类似物(7β-脱乙酰基-7β-[γ-(吗啉基)丁酰基]盐酸盐)处理的切片记录的值(图。B类;对forskolin后45分钟开始的所有时间点均<0.01)。在3小时的记录期内,非活性毛喉素类似物对基线场EPSP斜率没有产生显著影响(图。B类;n个 = 4).
forskolin激活腺苷酸环化酶模拟MPP中LTP的晚期。A类,用50μ处理切片米forskolin作用15min后逐渐增强,在施用后约45min达到稳定水平。在0.02 Hz的MPP测试刺激期间,这种促进作用持续了3小时。ACT D(40μ米)在应用forskolin之前和期间,一种转录抑制剂减弱了这种促进作用。B类相比之下,50μ米7β-脱乙酰基-7β-[γ-(吗啉啉)丁酰基]盐酸盐是一种非活性的福斯科林类似物,对0.02 Hz时诱发的基线场EPSP没有影响。将模拟物溶解在二甲基亚砜中(0.1%最终浓度)。在这些实验中,镁和钙含量正常。
在MPP中,福斯克林诱导的促进传播需要基因转录吗?急性应用转录抑制剂ACT-D(40μ米,1小时)显著减弱了forskolin诱发的突触增强(图。A类). ACT-D和forskolin(50μ米,15分钟,n个=7)在应用forskolin后90分钟和3小时分别为123±10和126±6%。这些值明显低于单独使用福斯柯林治疗的切片中观察到的值(在相同的时间分别为165±8和160±11%;n个 = 6, 对 < 0.02).
这些结果加强了PKA抑制剂的使用,并证明forskolin激活cAMP信号通路可在MPP中产生突触传递的L-LTP。他们还表明,一旦(通过短暂应用forskolin)触发,cAMP信号转导途径能够影响持续的生理变化,从而导致长期的促进作用,即使forskolin-不再存在。这种持续性变化可能涉及cAMP诱导基因的激活以及突触前和/或突触后结构变化的启动。
讨论
海马脑片MPP中的LTP有早期和晚期
我们的研究结果表明,大鼠海马脑片MPP中的LTP具有两个不同的时间阶段,它们的表达涉及不同的分子机制。早期阶段持续约45分钟,可由三列高频突触前冲动诱导,不需要新的蛋白质或mRNA合成。相比之下,10个序列产生一个晚期(出现在早期之后),该晚期被蛋白质和RNA合成抑制剂阻断。
本研究没有研究MPP早期LTP的确切机制,但先前的研究表明突触后(颗粒细胞)去极化水平,从而突触后钙水平2+流入,在控制LTP早期阶段的稳定性方面起着关键作用(汉斯和古斯塔夫森,1992年,b;科利诺和马伦卡,1993年)。此外,蛋白激酶似乎对早期阶段的诱导至关重要,因为staurosporine(一种普通激酶抑制剂)会减弱早期阶段(汉斯和古斯塔夫森,1994年). 在我们的实验中,PKA的抑制并没有消除早期阶段;因此,其他激酶必须是早期诱导的基础。此类激酶可包括钙/钙调素依赖性蛋白激酶II、PKC和酪氨酸激酶。
齿状回的蛋白质合成和L-LTP的诱导
我们的发现是,海马切片MPP中LTP的晚期被蛋白质合成抑制所阻断,这扩展并巩固了其他人先前的工作。Otani等人(1989)和Krug等人(1984年)还报告了麻醉和自由运动大鼠齿状回中L-LTP的蛋白质合成需求。在这些研究和我们目前的实验中,蛋白质合成抑制剂并不影响LTP早期、短暂期的表达,而是减弱晚期的表达。尽管我们还没有证明吐吐丁能抑制齿状回颗粒细胞中的蛋白质合成,但斯坦顿和萨维(1984)已经证明,在与我们目前实验中使用的浓度类似的浓度下,依米汀强烈阻断整个海马脑片的蛋白质合成。
蛋白质合成的部位是突触前还是突触后?虽然蛋白质合成抑制剂的全片应用不允许蛋白质合成的细胞位置的明确定位,但一些研究指出突触后颗粒细胞是蛋白质合成变化的可能场所。首先,阻滞麻醉大鼠齿状回中的蛋白质合成可减弱L-LTP,而抑制内嗅皮层(突触前穿通通路轴突的细胞体部位)对L-LTP无影响(奥塔尼和亚伯拉罕,1989年). 第二,导致增强的电刺激在齿状颗粒细胞中诱导过多的mRNA和蛋白质,包括组织纤溶酶原激活物(tPA)(钱等人,1993年)和其他早期基因(科尔等人,1989年;休斯和德拉古诺,1995年). 第三,齿状回蛋白质合成的定量变化体内已报告(Fazeli等人,1993年)尽管改变的蛋白质的身份仍有待确定。最后,应该注意的是,在横向海马切片的制备中,位于内嗅皮层的突触前穿支轴突的细胞体缺失。此外,有趣的是,在海马脑片的CA1区,与CA1锥体细胞体分离的突触后CA1树突中只存在短暂的LTP早期(Frey等人,1989年). 因此,累积的证据表明MPP中L-LTP的基因和蛋白质诱导的突触后位点。