运动神经元选择性易受AMPA/Kainate受体介导的损伤体外试验

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种神经退行性疾病，其特征是上（Betz细胞）和下（腹角）运动神经元的逐渐丧失。尽管原因不明，但摄取异常的发现(Rothstein等人，1992年)或新陈代谢(Plaitakis和Caroscio，1987年;Hugon等人，1989年a;Rothstein等人，1990年)谷氨酸和相关兴奋性氨基酸的含量表明，兴奋性毒性损伤可能是一个促成因素。

谷氨酸可以通过NMDA和AMPA/kainate类离子型受体的作用杀死神经元。虽然NMDA受体可能介导大多数急性神经元损伤，但一些因素表明AMPA/红藻氨酸受体可能对ALS发生的缓慢神经变性更为重要(Weiss和Choi，1991年). 首先，有三种具有突出运动系统表现的综合征，即连锁反应(Spencer等人，1986年)软骨藻酸毒性(Teitelbaum等人，1990年)和BMAA毒性(Spencer等人，1987年)，都与环境AMPA/红藻氨酸受体激动剂的消费有关(Ross等人，1987年;Bridges等人，1989年;Debonnel等人，1989年;Richter和Mena，1989年;Weiss等人，1989年). 其次，鞘内红藻氨酸优先损伤运动神经元(Hugon等人，1989年b)选择性AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂保护运动神经元免受脊髓切片中谷氨酸摄取慢性阻断引起的退化(Rothstein等人，1993年).

培养研究表明，NMDA受体的短暂激活会对大多数中枢神经元造成致命性损伤。这是Ca受伤²⁺-依赖并可能反映高钙²⁺NMDA受体门控通道的渗透率(麦克德莫特等人，1986年). 相反，AMPA/红藻氨酸受体通常是钙²⁺-不渗透，需要较长时间（几个小时）的激活才能发生类似的广泛神经元损伤(Choi，1992年). 然而，某些中央神经元群具有钙²⁺-可渗透AMPA/红藻氨酸通道(Iino等人，1990年;Pruss等人，1991年;Brorson等人，1992年)，这一特征可能会增强AMPA/红藻氨酸受体介导的损伤的内在脆弱性(Koh和Choi，1988年;Brorson等人，1994年;Turetsky等人，1994年;Weiss等人，1994a;Yin等人，1994a，b）。

SMI-32是一种非磷酸化神经丝标记物，可对脊髓切片中的运动神经元进行染色(Gotow和Tanaka，1994年;Carriedo等人，1995年). 在分离的脊髓培养物中，我们发现SMI-32标记神经元的子集在体外具有已确定的运动神经元（“大型SMI-32（+）神经元”）的形态学特征，这些神经元极易受到快速触发的Ca²⁺-依赖性，AMPA/红藻氨酸受体介导的损伤(Carriedo等人，1995年).

本项目以多种方式扩展了这些初步研究。首先，我们利用解剖学的考虑，并用其他运动神经元标记物进行标记，以加强大SMI-32（+）神经元确实是运动神经元的假设。除SMI-32染色外，其他实验还使用胆碱乙酰转移酶（ChAT）酶活性和外周蛋白免疫细胞化学（这两项是运动神经元群的已知指标）来进一步检查钙的作用²⁺AMPA/红藻氨酸受体中的离子介导对培养中假定运动神经元的损伤。最后，我们探讨了大SMI-32（+）和外周蛋白（+）神经元对长期低水平暴露于红藻氨酸或谷氨酸再摄取阻断剂所致损伤的脆弱性我-反式-吡咯烷-2,4-二羧酸（PDC）(Rothstein等人，1993年)这种损伤可能与ALS等疾病状态下的慢性运动神经元变性更为相关。

材料和方法

脊髓培养。如前所述，准备混合脊髓培养物(Regan和Choi，1991年)来自13-d龄小鼠胚胎，除了培养物被放置在预先建立的皮层星形胶质细胞单层上。最近的研究表明星形胶质细胞(伊格尔森等人，1985年;沙夫纳等人，1987年;Martinou等人，1989年a;Ang等人，1992年)或混合脊髓细胞条件培养基(Calof和Reichardt，1984年;Dohrmann等人，1987年)为培养中的运动神经元提供营养支持并显著提高其存活率。

在将脊髓放入由Eagle’s minimal essential medium（MEM）（Earle’s salts，提供的无谷氨酰胺血清；Gibco，Grand Island，NY）和10%热灭活马血清（Gibco）、10%胎牛血清（Gibco）、谷氨酰胺（2 m）组成的培养基中之前，先从脊髓中取出脑膜和背根神经节米)（Gibco）和葡萄糖（总计25 m米)在15 mm Primaria涂层培养板（Falcon，Franklin Lake，NJ）中的星形胶质细胞单层上，密度为每24孔板3条“脊髓”（～1–2×10⁵细胞/厘米²). 培养物在37°C的5%CO中保持₂孵化器。4-6天后在体外，非神经元细胞分裂因暴露于10⁻⁵米阿糖胞苷作用1-3天。然后将细胞转移到与平板培养基相同但缺乏胎儿血清的维持培养基中。随后的媒体更换每周进行两次。13–15天后对培养物进行研究在体外.

免疫细胞化学标记。为了标记脊髓切片中的运动神经元，在石蜡包埋之前，将成年小鼠的脊髓切除并固定在4%多聚甲醛中过夜。将脊髓切成6μm的切片，脱蜡，并淬灭内源性过氧化物酶活性（通过在0.3%H中孵育₂O（运行）₂在无水甲醇中）。然后在4°C下将切片与初级抗血清（在含有产生次级抗体的物种10%血清的PBS中，以尽量减少背景染色）孵育72小时：SMI-32（1:1000稀释；小鼠单克隆，Sternberger单克隆，马里兰州巴尔的摩），降钙素基因相关肽（CGRP）（1:2000稀释；兔单克隆抗体、Amersham International、Arlington Heights、IL）、外周蛋白（1:200稀释度；兔多克隆抗体、Chemicon International和Temecula，CA）、ChAT（1:200倍稀释度；鼠单克隆抗体和乙酰胆碱（ACh）（1:2000稀释度；兔子单克隆抗体，Biodesign International:Kennebunkport，ME）。使用适当的生物素化二级抗体（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）、亲和素和生物素化辣根过氧化物酶大分子复合物（ABC溶液，Vector）和二氨基联苯胺（Sigma）对染色细胞进行可视化。

对于染色，培养物在4%多聚甲醛中固定40分钟，用PBS洗涤三次，并用适当的封闭溶液（PBS中的10%血清）培养（30分钟），以最小化背景染色。对于SMI-32和外围设备，阻塞解决方案包括0.2%Triton X-100。对于CGRP染色，前一天用轴浆转运抑制剂秋水仙碱（10μ米)这一策略已被证明能显著提高染色强度(Juurlink等人，1990年). 一级抗体暴露在“封闭溶液”（含10%血清）中，浓度如下：SMI-32（1:6000）、外周蛋白（1:2000）、ACh（1:6000。SMI-32和外周蛋白暴露在室温下隔夜进行，而其他抗体暴露在4°C下进行48-72小时。使用生物素化二级抗体（载体实验室）、ABC溶液（载体）和3-氨基-9-乙基咔唑（西格玛）对染色细胞进行可视化。对于双重染色，培养物同时暴露于SMI-32抗体（1:1000稀释）和ACh、CGRP或外周蛋白抗体。暴露于CY3-结合抗小鼠二级抗体（1:100稀释；Jackson Research，Westgrove，PA）1小时。用生物素化二级抗体、ABC溶液和AEC（如上所述）观察第二个染色。省略一种或另一种一级抗体的对照组显示，染色之间没有交叉反应。

有限公司²⁺标记。有限公司²⁺按照说明进行标记(Pruss等人，1991年;Turetsky等人，1994年)，稍作修改。文化是共同的²⁺-通过暴露于红藻氨酸（100μ米)与Co²⁺（2.5米米)在吸收缓冲器中（139 m米蔗糖，57.5米米氯化钠，5米米氯化钾，2米米氯化镁₂，1米米氯化钙₂，12米米葡萄糖，10米米HEPES，pH 7.6）15分钟。然后在3 m的吸收缓冲液中清洗培养物米EDTA去除细胞外钴²⁺，在0.05%（NH）中培养₄)₂S持续5分钟以沉淀细胞内Co²⁺在吸收缓冲液中清洗三次，并固定（4%多聚甲醛，30分钟）。对于银增强，培养物在显影缓冲液（292 m）中清洗三次米蔗糖，15.5米米对苯二酚，42米米柠檬酸）并在0.1%AgNO中培养_三在50–55°C的显影缓冲液中。每隔15分钟更换一次溶液，并通过显微镜观察定期监测强化情况。增强完成后（通常在30–50分钟后），通过在温热的显影缓冲液中洗涤培养物三次来终止反应。

神经毒性实验。使用HEPES缓冲盐溶液（HSS），在室内空气（25°C）中进行短暂（15分钟）毒性暴露，其成分如下（单位：m米)：130钠⁺，5.4公里⁺，0.8毫克²⁺，1.8钙²⁺（除非另有说明），130.6 Cl⁻，20 HEPES，pH 7.4，25°C，15葡萄糖。用MEM+葡萄糖和10μ米离子型谷氨酸受体拮抗剂MK-801（Research Biochemicals International，Natick，MA）和2,3-二羟基-6-硝基-7-磺胺酰-苯并（F）喹喔啉（NBQX）（由丹麦马洛夫诺和诺德公司善意提供），并将培养物放回5%CO₂37°C培养箱。长期（24小时）暴露于红藻氨酸或谷氨酸再摄取阻断剂PDC（托克里斯·库克森，英国布里斯托尔）的MEM+葡萄糖中的5%CO₂37°C培养箱。MK-801（10μ米)在所有红藻氨酸暴露期间添加，以防止NMDA受体从内源性释放的谷氨酸中激活，从而确保纯AMPA/红藻氨酸受体介导的损伤机制。

对于急性和慢性暴露，在暴露开始后20–24小时，通过形态学检查和定量测量沐浴液中的乳酸脱氢酶（LDH）来评估整体神经元损伤，该指数与兴奋性毒性暴露损伤的神经元总数成比例(Koh和Choi，1987年). LDH值按比例缩放至暴露于300μ米红藻氨酸24小时（=100%细胞损失）。

然后固定培养物并对其进行SMI-32或外周蛋白染色。通过对所有染色神经元的直接计数来评估兴奋毒性暴露对标记神经元的损伤。大SMI-32（+）或外周蛋白（+）神经元的特异性破坏被评估为暴露于兴奋性毒性激动剂的神经元培养物中完整细胞的平均数与暴露于单独假洗液的几个姊妹培养物中的平均数之间的差异，以后者的百分比表示。

ChAT活性测定。在进行ChAT活性测定之前，通过测量LDH释放（如上所述）来评估整体神经元损伤。如前所述，对ChAT活性进行了分析(Weiss等人，1994年b)，根据采用的方法Fonnum（1975）. [^三H] 乙酰辅酶A（0.125μCi/样品；杜邦NEN，马萨诸塞州波士顿）被用作反应底物，计数显示掺入[^三H] ACh公司。

减去背景计数后，ChAT活性的特定损失被评估为洗发水和红藻氨酸暴露培养物中平均ChAT活性之间的差异，并被缩放到暴露于300μ米红藻氨酸24小时（=100%损失）。

细胞内游离钙²⁺（[钙²⁺]_我)测量值。对于Ca²⁺成像研究中，除细胞被镀在聚乙烯上外，培养物的制备如上所述-我-赖氨酸涂层玻璃底板（Plastek Cultureware，阿什兰，马萨诸塞州）。通过暴露于5μ米Fura-2 AM（分子探针，尤金，俄勒冈州），在HSS中加入0.1%的pluronic acid，在黑暗中（25°C持续30分钟）。然后清洗培养物，并在黑暗中再培养30分钟（用于脱酯化）。将培养物安装在显微镜式适配器中，并使用倒置显微镜（配备氙外荧光光学元件的尼康隔膜）以200×的速度观察预先选择的视野。用340 nm和380 nm氙光源交替照射细胞，并用滨松增强型CCD相机拍摄荧光（510 nm）。使用Universal Imaging（宾夕法尼亚州西切斯特）的fluor软件，在基于80486的计算机上收集数据。[加利福尼亚州²⁺]_我由方程式[Ca决定²⁺]_我 = K（K）_d日(F类_最小值/F类_最大值){(R（右） − R（右）_最小值)}/{(R（右）_最大值 − R（右）)}，使用K（K）_d日=224牛顿米.在对设备进行任何调整后，重新校准系统。

在室温下，在2ml HSS静态浴中进行成像实验。获得基线值后，红藻氨酸（10μ米)和MK-801（10μ米)添加了[Ca²⁺]_我在额外的10分钟内每30秒获得一次值。由于Fura-2的高亲和力，峰[Ca²⁺]_我添加红藻氨酸后立即获得的值可能略微低估了真实值[Ca²⁺]_我值。然后固定培养物并对其进行SMI-32染色。在含有大的SMI-32（+）神经元的场中，对所有不同的神经元进行荧光分析。只分析了包含大型SMI-32（+）神经元的字段。

材料。所有其他化学品和试剂均从通用商业来源获得。

结果

SMI-32和其他运动神经元标记物标记脊髓切片中的运动神经元

非磷酸化神经丝抗体SMI-32强烈标记脊髓切片中的腹角运动神经元(Gotow和Tanaka，1994年;Carriedo等人，1995年). 最初的研究将切片中运动神经元的SMI-32标记与其他各种标记物进行了比较，这些标记物用于染色运动神经元。检测了针对以下标志物的抗体：神经递质ACh(Geffard等人，1985年)，ACh合成酶ChAT(Hietanen等人，1990年;Wang等人，1990年)，外围设备(Parysek和Goldman，1988年;Escura等人，1990年)，一种III类中间丝蛋白和CGRP(Gibson等人，1984年;Kruger等人，1988年;Juurlink等人，1990年). 尽管这些标记物中的每一个都标记了腹角的运动神经元，但染色的程度差异很大（图。​（图1）。1). SMI-32和CGRP显示出最强烈的染色，尽管SMI-32确实显示出腹角外的一些小神经元的标记。ChAT和ACh都显示出较弱的染色，并且也标记了脊髓背角的一些小神经元，这一发现与之前对脊髓中ChAT染色的研究一致(Houser等人，1983年). 与之前的研究一致，脊髓切片中的外周蛋白染色很微弱，但似乎对腹角运动神经元的亚群有选择性。

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图1。

运动神经元标记物标记脊髓切片中的大腹角神经元。显微照片显示成人脊髓切片被SMI-32抗体染色（如上所述）(A类)，外围设备(B)、CGRP(C)、ACh(天)或ChAT(E类). 对于每个标记底板显示神经元的高倍（400×）细节箭头在里面顶部面板.比例尺，300μm。

SMI-32和其他运动神经元标志物标记脊髓培养物中的神经元亚群

研究运动神经元的培养模型的发展受到了缺乏特征明确的标记物的阻碍，这些标记物既针对运动神经元，又显示出良好的形态学细节。与切片中运动神经元的染色一致，SMI-32标记了分离脊髓培养中具有培养运动神经元形态学特征的神经元亚群(沙夫纳等人，1987年;Martinou等人，1989年a)：一个大的（>20μm）细胞体，一个突出的轴突树突，通常是一个长轴突样的轴突，通常延伸数毫米（图。​（图2）。2). 此外，尽管SMI-32标记了培养物中所有神经元的～3%，但只有少数标记神经元（～30%）具有这些特征（“大型SMI-32（+）神经元”）(Carriedo等人，1995年).

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图2。

运动神经元标记物标记脊髓培养中的神经元。显微照片显示相控显微镜下分离的脊髓培养物(A类,箭头显示假定运动神经元在染色前或用SMI-32抗体进行免疫染色（如上所述）后的典型外观(B,箭头显示轴突分支），外周蛋白(C)、CGRP(天)、ACh(E类)或ChAT(F类). 请注意SMI-32和外周蛋白染色提供的广泛形态学细节（通常显示广泛的树突树枝状结构以及通常延伸数毫米的单个轴突样突起）。相比之下，其他染色剂提供的形态学细节相对较少(D–F型,箭头表示有代表性的染色神经元）。比例尺，100μm。

用其他运动神经元标记物（ChAT、ACh、CGRP和外周蛋白）染色可以更好地表征我们培养物中运动神经元的数量(Richards等人，1995年)并进一步确认大SMI-32（+）神经元的假定运动神经元身份（图。​（图2）。2). 与切片中的弱染色相比，外周蛋白（+）神经元（培养物中约0.5%的神经元）通常染色强烈，并显示出广泛的形态学细节（通常与大型SMI-32（+）神经细胞非常相似）。培养物中约1.5%的神经元为CGRP（+）。如前所述(Juurlink等人，1990年)然而，只有在秋水仙碱预处理后才能获得CGRP染色（参见材料和方法），这一操作增加了染色强度，但通常会导致我们培养系统中的形态学特征出现明显的破坏。与切片相比，培养基中的ChAT（占总神经元的约0.25%）和ACh（占总神经细胞的约0.1%）染色较弱，且变化更大，几乎没有神经炎形态。双重免疫细胞化学显示，大多数ACh（+）神经元（80%）、外周蛋白（+）细胞（68%）和CGRP（+）神经细胞（60%）为SMI-32（+）（每个标记计数的≥3个实验中的≥50个标记细胞；图。​图3），三)支持大型SMI-32（+）神经元的运动神经元身份。

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图3。

左上角。大多数外周神经元也是SMI-32（+）神经元。显微照片显示在可见光下外周蛋白和SMI-32的培养物双重染色(A类和荧光显微镜下(B，SMI-32标签）。大多数外周蛋白（+）神经元表达SMI-32免疫反应性。其他双标记研究显示，大多数ACh或CGRP免疫活性神经元为SMI-32（+）（见结果）。比例尺，50μm。

为了进一步描述大型SMI-32（+）神经元的特征，我们通过制备分离的“腹侧”和“背侧”培养物（通过在电镀前纵向分裂脊髓）来检测它们在脊髓中的分布。大的SMI-32（+）神经元优先在腹侧培养中发现[它们包含腹侧3.5%（283/8147）的神经元，但在脊髓背侧培养中仅0.4%（14/3341）的神经元]，因此支持运动神经元的特性。此外，在腹侧SMI-32（+）神经元中，大的SMI-32+神经元占78%（283/364），而在脊髓背侧培养中，仅占17%（14/81）（数据来自三个实验）。

AMPA/红藻氨酸受体介导的培养运动神经元急性损伤是Ca²⁺-从属的

我们之前报道了钙的去除²⁺在短暂的红藻氨酸暴露期间，大的SMI-32（+）神经元随后的退行性变减轻，这在20–24小时后进行了评估(Carriedo等人，1995年). 这些研究现已扩展。首先，我们发现细胞外钙升高²⁺（1.8至10米米)在暴露期间，短时间（10分钟，100μ米)红藻氨酸暴露并几乎不会产生整体神经损伤（通过测量LDH释放进行评估）（图。​（图4，4,​,5),5)进一步证实了钙的关键作用²⁺进入对大型SMI-32（+）神经元的快速触发损伤。此外，由于尚未证明大型SMI-32（+）神经元的运动神经元身份，我们重复了Ca²⁺-运动神经元群其他两项指标的依赖性实验：外周蛋白免疫细胞化学(Parysek和Goldman，1988年;Escura等人，1990年)和ChAT酶活性(Schnaar和Schaffner，1981年;沙夫纳等人，1987年;Martinou等人，1989年b;Rothstein等人，1993年). 与大型SMI-32（+）神经元一样，在短暂的红藻氨酸暴露后，外周蛋白（+）细胞和ChAT活性都会优先丧失。此外，这些措施中的每一项都会受到快速触发的损害²⁺-依赖。

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图4。

外周蛋白（+）和大SMI-32（+）神经元的Kainate损伤是Ca²⁺-依赖：形态外观。脊髓培养物暴露于红藻氨酸（100μ米10分钟），在1.8m的存在下米钙²⁺(A、 C类)或缺乏钙²⁺(B、 D类)24小时后，对其中一种外周蛋白进行染色(A、 B类)或SMI-32(C、 D类). 尽管在钙存在的情况下这些次最大暴露²⁺对许多（但不是所有）标记神经元造成严重损伤，清除钙²⁺在暴露期间，大多数神经元得到了良好的保存。比例尺，100μm。

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图5。

脊髓运动神经元群的Kainate损伤是Ca²⁺-依赖。A类，对大的SMI-32（+）和外周神经细胞（+）的Kainate损伤是Ca²⁺-依赖。培养物暴露于红藻氨酸（100μ米10分钟）²⁺浓度。20–24小时后，对整体神经元丢失和大型SMI-32（+）或外周蛋白（+）神经元的丢失进行评估（如材料和方法中所述）。数值代表四个实验的平均值±SEM；n个=每种条件9–15个培养基。&表明标记的神经元丢失与1.8米处的标记神经元丢失显著不同米钙²⁺条件(对<0.05（双尾）t吨测试）。#表明标记的神经元丢失与相同暴露后的总神经元丢失显著不同(对双尾<0.01t吨测试）。B，Kainate诱导的脊髓ChAT活性丧失是Ca²⁺-依赖。培养物暴露于红藻氨酸（100μ米15分钟）²⁺浓度。20–24小时后（如前所述）评估整体神经元丧失和ChAT活性丧失。数值代表10个实验的平均值±SEM；n个=每种情况下27–36个培养基。&表明ChAT放射性损失与10m中的明显不同米钙²⁺条件(对双尾<0.01t吨测试）。#表明相同暴露后ChAT活性丧失与整体神经元损伤有显著差异(对双尾<0.01t吨测试）。

运动神经元被长期低水平的红藻氨酸暴露选择性损伤

尽管上述实验中使用的快速、强烈的红藻氨酸暴露可能与创伤或缺血中发生的急性脊髓损伤的病理生理学直接相关，但其与ALS中慢性运动神经元变性的潜在兴奋毒性作用的相关性尚不明确。因此，我们研究了SMI-32（+）和外周蛋白（+）神经元对长期低水平红藻氨酸暴露造成的损伤的脆弱性。脊髓培养物暴露于5至20μl浓度的红藻氨酸米24小时，然后评估整体神经元损伤和标记神经元损伤。尽管有10μ米红藻氨酸暴露导致的整体神经元损伤相对较小，这种暴露对SMI-32（+）和外周蛋白（+）神经元群都造成了实质性损伤（图。​（图77A类).

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图7。

运动神经元选择性地易受缓慢的兴奋性毒性损伤。A类，慢性红藻氨酸暴露可选择性损伤SMI-32（+）大神经元和外周蛋白（+）神经元。将培养物暴露在指定的红藻氨酸浓度下20–24小时，然后评估对整个神经元群和标记神经元群的损伤。数值代表三到四个代表性实验的平均值±SEM；n个=每种情况10–12个培养基。#表明标记的神经元丢失与相同暴露后的总神经元丢失显著不同(对双尾<0.01t吨测试）。B，长期接触谷氨酸再摄取阻断剂PDC可选择性损伤SMI-32（+）大神经元。将培养物暴露于PDC（100μ米)单独或添加谷氨酸受体拮抗剂（每种浓度为10μ米)然后评估整体神经元群和大型SMI-32（+）神经元的损伤。数值代表三到四个代表性实验的平均值±SEM；n个=每个条件9–12个培养基。#表明SMI-32（+）神经元大量丢失与相同暴露后的总神经元丢失显著不同(对双尾<0.01t吨测试）。&表明SMI-32（+）神经元的大量丢失与100μ米PDC条件(对双尾<0.01t吨测试）。

通过将培养物暴露于谷氨酸再摄取阻断剂PDC（100μ米). 这种暴露会导致SMI-32（+）大神经元的严重退化，但对整个脊髓神经元群几乎没有损伤。与脊髓切片培养模型的先前研究一致(Rothstein等人，1993年)这种损伤似乎主要通过激活AMPA/kainate型谷氨酸受体介导。选择性AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂NBQX（10μ米)NMDA受体拮抗剂MK-801（10μ米)没有效果（图。​（图77B).

与急性兴奋性毒性方案不同，钙在其中的作用²⁺红藻氨酸对大SMI-32（+）或外周蛋白（+）神经元的损伤中的离子很容易被证明，钙的作用²⁺由于钙的去除，在这些长期的毒性暴露中很难证明离子进入²⁺长时间远离媒体本身就是有害的。因此，我们使用Fura-2成像来比较细胞内游离钙²⁺水平（[Ca²⁺]_我)在含有[Ca的大型SMI-32（+）神经元中²⁺]_我在低水平（10μ米)红藻氨酸暴露。休息[钙²⁺]_我神经元之间的水平差别不大。然而，当添加红藻氨酸时²⁺]_我大多数细胞中的水平迅速增加，然后逐渐下降到持续的[Ca²⁺]_我值接近基线。大的SMI-32（+）神经元表现出持续的[Ca²⁺]_我显著高于平均水平（图。​（图88,​,9),9)从而支持钙的作用²⁺离子对低水平红藻氨酸的敏感性。

图8。

右上角。大型SMI-32（+）神经元显示大量[Ca²⁺]_我低水平红藻氨酸暴露期间的升高。A类，显示[Ca的文化字段的伪彩色图像²⁺]_我添加红藻氨酸（10μ米).BSMI-32染色后同一区域的显微照片。请注意，大型SMI-32（+）神经元具有最高的[Ca²⁺]_我水平。比例尺，100μm。

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图9。

大型SMI-32（+）神经元显示大量[Ca²⁺]_我低水平红藻氨酸暴露期间的升高。A类，[Ca的分布²⁺]_我添加红藻氨酸（10μ米). 所有大型SMI-32（+）神经元的[Ca值均高于平均值²⁺]_我值。B，[Ca的时间进程²⁺]_我变化。[加利福尼亚州²⁺]_我在添加红藻氨酸（10μ米). 在显示的44个神经元中，2个神经元由实线是大型SMI-32（+）神经元。

讨论

脚注

参考文献