脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白和mRNA在正常成年大鼠中枢神经系统中的分布：顺轴运输的证据

摘要

神经营养素是一个相关的生长因子家族，目前由神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素-3（NT-3）、NT-4/5和NT-6组成（Berkemeir等人，1991；Narhi等人，1993年;Gotz等人，1994年; Ibáñez，1994）。尽管许多证据表明，这些因素在调节外周神经元的存活、生长和分化方面发挥着重要作用，但它们在发育和成年中枢神经系统中的生理作用还不太明确。要了解中枢神经系统中的神经营养素功能，可能需要几种实验方法，包括阐明每种神经营养素的合成和储存位置。

迄今为止，许多研究人员已经报道了各种神经营养素mRNA的定位，尽管这些研究很少提供整个CNS的详细图谱。NGF的表达主要局限于海马结构、嗅球和基底前脑胆碱能神经元的所有皮质靶区(Korsching等人，1985年;Shelton和Reichardt，1986年;Whittemore等人，1986年;Ernfors等人，1990年;Guthrie和Gall，1991年). 其他研究表明，在基底前脑中发现高水平的NGF mRNA(Lauterborn等人，1991年,1995)，下丘脑(Spialantini等人，1989年,Ceccatelli等人，1991年)和脑干(Ceccatelli等人，1991年). BDNF mRNA似乎广泛分布于中枢神经系统(Ernfors等人，1990年;菲利普斯等人，1990年;Ceccatelli等人，1991年; Friedman等人，1991年；Guthrie和Gall，1991年;Gall等人，1992年;Castrén等人，1995年). 相反，NT-3 mRNA分布最窄，高表达仅限于海马CA2层锥体、齿状回颗粒细胞和小脑颗粒细胞(Ernfors等人，1990年;Maisonpierre等人，1990年;Ceccatelli等人，1991年)黑质、中线和层内丘脑以及杏仁核后部NT-3 mRNA水平较低(塞鲁吉和加尔，1993年;Lauterborn和Gall，1994年). NT-4/5在中枢神经系统的表达似乎很低(Timmusk等人，1993年)，及其就地分布尚未确定。最近发现的NT-6仅限于非哺乳动物物种，其分布仍基本未知(Gotz等人，1994年).

中枢神经系统中神经营养蛋白的细胞定位进展缓慢，可能反映了免疫组织化学方法固有的技术局限性。最近，我们产生了抗体，并制定了固定和免疫组织化学方案，允许在正常成年大鼠大脑中显示NGF蛋白(Conner等人，1992年). 该协议还被成功用于在多种情况下定位NGF，包括（1）NGF在人类和非人类灵长类动物中的正常分布(Mufson等人，1994年)人阿尔茨海默病组织基底前脑胆碱能神经元NGF积累的变化(Mufson等人，1995年)（3）NGF蛋白在NGF基因突变转基因小鼠中的分布(Carlson等人，1995年;Ma等人，1995年)，以及（4）就地不同实验操作后NGF蛋白的分布(Conner和Varon，1992年,1995;Conner等人，1994年;霍尔兹曼和洛文斯坦，1995年).

在本研究中，我们使用了为NGF开发的敏感免疫组织化学方案，以及一种特性良好的BDNF亲和纯化多克隆抗体的制备(Yan等人，1997年)生成成年大鼠脑和脊髓BDNF蛋白的详细图谱。还对BDNF mRNA分布进行了平行分析。这些综合数据揭示了几个含有高密度BDNF-免疫反应过程的区域，但没有检测到mRNA，因此表明BDNF可能通过顺行轴突运输的方式分布到这些区域。这一假设在两个不同的系统中进行了测试，使用损伤范式破坏特定的细胞群，为含有丰富BDNF蛋白且无可检测mRNA的区域提供传入神经。

材料和方法

BDNF抗体和cDNA探针。本研究中使用的BDNF亲和纯化兔多克隆抗体的产生和特征如前所述(Conner等人，1996年;Yan等人，1997年). 根据几个标准，这种抗体制剂被证明对BDNF具有特异性。（1）在Western blot中，抗体能够识别每条车道0.1纳克的BDNF，但在浓度甚至高出100倍的情况下，与NGF、NT-3或NT-4/5没有交叉反应；（2） 在鸡背根神经节生物测定中，抗体特异性干扰BDNF的促生存活性，但不能抑制NGF或NT-3的作用；和（3）用该抗体在CNS组织中观察到的BDNF-ir的特异性模式在BDNF基因缺失的小鼠中未检测到，但在NGF基因缺失的小鼠中存在（J.Conner，未发表的观察结果）。用T3 TNA聚合酶消化大鼠重组质粒pR1112-8后产生反义BDNF mRNAPvu公司二、。该cRNA探针含有384个碱基，与编码成熟大鼠BDNF蛋白的mRNA互补(Isackson等人，1991年). 如前所述，从质粒DNA中产生放射性标记的义mRNA(加尔和伊萨克森，1989年).

BDNF免疫组化。使用成年雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠（加利福尼亚州Gilroy的Simonsen和加利福尼亚州圣地亚哥的Harlan）(n个=5，正态分布；n个=14，用于分析病变影响）。所有动物在深度麻醉下灌注约50 ml PBS，然后在0.07中灌注约250 ml 2%多聚甲醛+0.2%对苯醌米磷酸盐缓冲液，pH 7.2。取下大脑，在同一固定液中固定2小时，并在0.1的30%蔗糖中冷冻过夜米磷酸盐缓冲液（所有溶液在4°C下）。在滑动切片机上切割冠状切片（40μm），并将其储存在Millonig的缓冲液中，直到对其进行BDNF-ir处理，如前所述(Conner等人，1996年). 简言之，切片（每240μm取一次）在0.1米Tris缓冲盐水（TBS），pH 7.4，在含有0.25%Triton X-100的TBS中培养，并在TBS+2%BSA+5%正常山羊血清中培养。染色方法是在4°C下用一级抗体（50 ng/ml抗BDNF）孵育切片48小时，在室温下用二级抗体（1.5μg/ml生物素化山羊抗兔抗体；加利福尼亚州伯林盖姆的Vector Labs）孵养切片3小时，并用亲和素-生物素-过氧化物酶试剂（1:250稀释，ABC Elite；Vector Labs）进行染色在室温下保持90分钟。然后将切片与含有0.04%二氨基联苯胺四氢氯化物、0.06%氯化镍和0.06%H的溶液反应₂O（运行）₂在Tris-HCl缓冲液中。

现场BDNF mRNA杂交。Sprague-Dawley大鼠（Simonsen）(n个=5）用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，并用50 ml 0.9%生理盐水灌注，然后用350 ml 4%多聚甲醛灌注0.1米磷酸盐缓冲液（PPB）。从颅骨中取出大脑，在4°的PPB中固定24小时，在PPB中20%蔗糖中冷冻24–48小时，然后在冠状面25μm厚的冷冻切片机上切片。如前所述，组织切片自由浮动处理(Lauterborn等人，1991年). 简单地说，冠状切片用蛋白酶K渗透，用醋酸酐处理，然后与cRNA探针（1×10）杂交⁴cpm/μl）在60°C下漂洗24–36小时。杂交后，在40×SSC中漂洗两次，漂洗温度为60°C，用核糖核酸酶A（1.2 kU/ml）（西格玛，圣路易斯，密苏里州）在45°C下处理30分钟，然后在60°C下通过降低SSC浓度进行漂洗，最终浓度为0.1×SSC。在所有洗涤液中添加最终浓度为5 m的二硫苏糖醇米然后将组织安装在涂有明胶的载玻片上并进行空气干燥。对于乳化放射自显影术，载玻片在乙醇中脱水，在氯仿中脱脂。通过胶片（Amershamβ-max）和乳剂（Kodak NTB2）放射自显影术观察杂交，在室温下暴露时间分别为3-4天，在4°C下暴露时间为4-6周。在放射自显影后，用甲酚紫对涂有乳液的载玻片进行复染，用Permount覆盖玻片，并用明暗视野显微镜进行分析。

病变。单边(n个=4）或双侧(n个＝4）通过切除位于脑桥两侧和矢状窦正侧的3×3mm的颅骨区域，完成了间隔伞核和三角间隔核的抽吸损伤。硬脑膜打开后，连续抽吸部分顶叶和扣带回皮质、胼胝体上纹和胼胝体表露出伞和连合上隔核。目测检查伞和连合上隔核的抽吸情况，并用浸泡在无菌PBS中的凝胶泡沫填充由此产生的间隙(n个=4）或双侧(n个=2）脑桥臂旁核的损伤是通过将1mA电流通过钨电极，持续20秒，钨电极位于脑桥臂前角尾侧11.5毫米、中线外侧1.9毫米、颅面下方7.6毫米处（电极载体前角为20°）。对于这两种病变类型，动物在手术后存活2周，然后在深度麻醉下灌注。对所有病变的精确位置和损伤程度进行组织学评估。

结果

BDNF的免疫染色揭示了整个中枢神经系统的特异性标记，该标记仅限于在明确的区域中选择的细胞或纤维/末端群体（概述，见图。​图1）。1). 本描述中使用的解剖学术语取自Paxinos和Watson（1988）。表中显示的结果是对许多动物组织学切片的显微镜观察（由两名不同的研究人员独立进行）所得数据的总结，它们可能与任何一张照片中显示的略有不同。BDNF细胞染色总是以扩散反应产物的形式出现，分布在核周细胞质中，偶尔延伸到最近端的突起，但它并没有占据细胞核（图。​（图22A类). 纤维/末端染色的评估是在组织的高倍镜检查的基础上进行的，其特征是（1）粗糙，具有明确定义的单个纤维（例如脊髓和三叉神经脊核）（图。​（图22B类)，（2）弥散且细点状，个别纤维无法区分（例如下丘脑）（图。​（图22C类)或（3）重度点状突起，在未染色的神经元细胞体（例如，终纹床核、外侧隔、杏仁核中央核）周围形成细胞周围篮状突起（图。​（图22D类). 在整个CNS中，BDNF免疫染色和mRNA的细胞定位仅限于具有神经元形态的细胞。在所有情况下，通过省略一级抗体或使用预吸附对照物（图。​（图3三).

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

图1。

BDNF-ir在成年大鼠脑内的分布。两块钢板在低倍镜下都显示了口直肠的一系列断面(从左到右)这是从使用BDNF特异性亲和纯化抗体进行免疫染色的两只雌性大鼠中获得的。雄性大鼠（未显示）的BDNF免疫染色与雌性大鼠无明显区别。比例尺，3 mm。

在单独的窗口中打开

图2。

大鼠中枢神经系统BDNF免疫染色的特征模式。面板显示基底外侧杏仁核BDNF免疫染色的示例(A类)，脊髓(B类)，下丘脑(C类)和侧隔(D类)这是整个CNS免疫标记质量的代表（亮场照明）。如所示A类核周标记的特征是扩散反应产物分布在细胞质中，但不包括细胞核。B–D类各种类型的纤维/末端染色。如脊髓1层所示(B、 小箭头)和叶片3(B、 打开的箭头)，大量单个纤维被免疫标记；免疫反应纤维也集中在第二层(B、 大箭头). 其他区域包含点状免疫染色，在未标记的细胞体周围呈弥漫或聚集状(C、 箭头)，或定义明确，在未标记的细胞周围有离散的细胞周篮(D、 箭头). 比例尺（如所示B类):A、 B类，100微米；（如所示D类)C、 D类，50微米。

在单独的窗口中打开

图3。

BDNF免疫染色的特异性。A–C，对组织切片进行免疫组织化学处理，省略BDNF抗体(A类)，预吸附纯化的重组人BDNF的BDNF抗体溶液(B类)或预吸附的抗小鼠β-NGF的BDNF抗体溶液(C类)（亮场照明）。如中所示A类和B类当BDNF抗体被省略或预先吸附BDNF蛋白时，不存在特异性染色。在C类，对小鼠β-NGF的预吸附显示出一种免疫染色模式，该模式与仅与BDNF抗体反应的切片相同（见图。​图1）。1). 比例尺，2 mm。

在以下段落中，将描述BDNF-ir和BDNF-cRNA杂交在整个CNS中的分布。尽管这两种技术对来自不同组大鼠的组织进行了处理，但为了在一个领域内进行比较，这些数据将一起呈现。

表中总结了BDNF蛋白和mRNA在嗅球、皮层和海马结构中的分布​表1。1在主嗅球中，少数肾小球周细胞轻度标记BDNF mRNA和蛋白。在二尖瓣细胞层，少数细胞轻度标记BDNF-ir，但未标记mRNA，在颗粒细胞层，整个区域分布着一层微弱的自显影颗粒薄雾，表明mRNA含量低，但未检测到BDNF-ir。相反，副嗅球中的颗粒细胞轻度免疫染色，但未被cRNA标记。​（图44A–C)所有亚区均含有大量BDNF mRNA标记良好且BDNF-ir标记适度的细胞。在tenia tecta吻侧部的几乎所有细胞中都检测到中度BDNF免疫染色和杂交，但在更多的尾侧切片中几乎没有。相比之下，许多含有BDNF-ir和BDNF mRNA的细胞分布在与顶盖网状结构相邻的中间外侧隔核内（图。​（图44D–F型). 在克劳斯特姆核和内虹膜核的整个口直肠范围内，许多细胞都有BDNF mRNA的大量标记，而BDNF-ir的标记相对较重（图。​（图44G、 小时).

在单独的窗口中打开

图4。

前脑区域的BDNF-ir和mRNA。A–J，通过前嗅核的切片(A–C)，构造带尾侧部分(D–F型)、克劳斯特姆和梨状皮层(G、 H（H）)和间隔区(一、 J型)进行免疫组织化学处理(C、 F、H、J; 亮场）和就地杂交(B、 E、G、I; 暗场）。显微照片A类和D类是尼塞尔染色的组织。BDNF-ir和cRNA标记的模式在前嗅核和嘴侧构造带非常相似(TT公司) (A–C)更靠后的是幽闭(氯)，内虹膜核(兽穴)和梨状皮层(Pir公司) (G、 H（H）). 在顶盖的尾部，观察到非常轻微的杂交，但没有免疫染色(D–F型); 在邻近的中间侧隔膜中存在显著的大量杂交和免疫染色(大规模集成电路) (D–F型). 在中隔区，cRNA标记的细胞仅见于内侧中隔(微软)而强烈的BDNF-ir主要定位于外侧隔的纤维/终末(I、 J). 比例尺（如所示C类):A–C500微米；（如所示F类):D–F型，200微米；（如所示H（H）):G、 H（H）500微米；（如所示J型):一、 J型500微米。交流电，前连合；人工智能无核岛叶皮层；AOD公司前嗅核，背侧；AOP公司前嗅核，后部；电子/视频室管膜层/嗅室；海湾合作委员会胼胝体膝；HDB（HDB），斜带的水平翼；LSD公司，侧隔，背部；LSV公司，侧隔，腹侧部；低压侧脑室；德国船级社，对角线带的垂直边。

在皮层中，BDNF-ir和cRNA-标记的细胞分布在所有的口轮回水平，杂交和免疫染色密度在皮层区域有显著差异（图。​（图5，5，表​表1）。1). 在几乎所有的皮层区域，免疫和杂交标记在第II、III、V和VI层中观察到，第IV层中只有少数轻度标记的细胞。最有力的新皮质标记通常出现在胼胝体附近的第VI层深处，尤其是顶叶皮层（图。​（图55A–C). 相比之下，颞叶皮层第六层的标记细胞较少（图。​（图55D–F型). 在给定的区域内，杂交和免疫标记的层流模式通常是相同的，如图中内嗅皮层所示​图55G–I型所有皮层区域的第一层完全缺乏BDNF免疫染色或cRNA杂交。

在单独的窗口中打开

图5。

BDNF-ir和mRNA在皮质区的分布比较。穿过顶盖的截面(A–C)，暂时(D–F型)和内鼻的(G–I型)皮质被处理就地杂交定位BDNF mRNA(B、 E、H; 暗视野）或免疫组织化学定位BDNF-ir(C、 F、I; 亮场）。通过类似平面的切片被尼塞尔染色(A、 D，克; 亮场）。在顶叶皮层(A–C)，BDNF cRNA重标记层神经元不及物动词，分层适度二/三，并轻轻分层V（V）; BDNF-ir在深层非常重不及物动词，层次更轻II、 III、V和表层不及物动词层中几乎检测不到四、.颞叶皮层(D–F型)，BDNF mRNA在层中适度标记二/三和第五版/第六版，层中标签较浅四、.BDNF-ir在颞叶皮层的分层中最重二/三，分层适中第五版/第六版和层中的灯光四、.内嗅皮层(G–I)BDNF-cRNA杂交和免疫反应模式相似。比例尺（如所示A类):A–C500微米；（如所示D类):D–F型500微米；（如所示G公司):G–I型，1毫米。复写的副本胼胝体。

在海马体中，在细胞体和纤维/末端都检测到BDNF免疫染色（图。​（图6）。6). 在锥体细胞层中，cRNA杂交和免疫染色的强度以及标记的细胞数量在不同的亚域中不同（图。​（图66B、 C类). 在CA1中，少数散在细胞被cRNA标记，具有中等密度的放射自显影颗粒，少数细胞具有可检测的免疫反应性。在CA2中，大多数细胞具有中度至重度cRNA标记和轻度至中度免疫染色。在CA3中，cRNA标记和BDNF-ir在几乎所有细胞中都相对密集（尽管由于苔藓纤维区内BDNF免疫染色强烈，通常很难区分免疫标记的CA3锥体细胞）。在CA1–CA3层中仅检测到一个偶发的免疫标记细胞，在该层中未观察到mRNA阳性细胞。免疫反应纤维分布在CA1–CA3区域。如图中CA1区所示​图66D类纤维染色密度在整个海马纹层中不同，在层孔和放射状细胞中免疫染色较强，而在层腔隙分子和锥体中BDNF-ir较少。在齿状回中，颗粒层中的几乎所有细胞均为mRNA阳性和BDNF-免疫活性（图。​（图66B、 C、E). 在齿状分子层中，可以看到BDNF-ir的独特层流模式（图。​（图66E类). 免疫染色在分子内层中等，在分子中层较轻，在分子外层未检测到。在门部，一些细胞被cRNA严重标记，并可见少量免疫反应性胞体；然而，门深部纤维的密集免疫组织化学标记阻止了该区域免疫反应细胞的识别（图。​（图66C类). 在整个中枢神经系统中，门深部的纤维标记区密度最高，染色良好，与颗粒细胞苔藓状纤维轴突的位置相对应。

在单独的窗口中打开

图6。

BDNF-ir和mRNA在海马的分布。低放大倍数(A–C)和高倍放大(D、 E类)海马体Nissl染色切片的显微照片(A类，亮场）或加工用于就地杂交(B类，暗场）或免疫组织化学(C–E类，亮场）。在海马中，BDNF cRNA在CA3、CA2和门中密集标记的锥体细胞，在CA1锥体细胞和齿状回颗粒细胞中不太密集(GrDG公司) (B类). 苔藓纤维系统内BDNF免疫染色密集标记过程(C类). 在高倍镜下，可以看到CA1区BDNF免疫染色在地层中弥漫(或者)和辐射状(半径)而在腔隙分子层中较弱(LMol公司) (D类). CA1锥体细胞层中的分散神经元(派伊)被免疫标记(D类). 在齿状回中(DG公司)分子层，可见BDNF-ir的三层结构，分子内层具有中等密度的标记(国际货币联盟)中分子层的光标记(毫米)外分子层无可检测的染色(oml公司). 比例尺（以C显示）：A–C500微米；（如所示D类):D、 E类分别为100μm和75μm。左侧b，外侧缰核。

BDNF-ir和mRNA在基底前脑和基底神经节内的分布总结见表​表2。2在基底前脑，许多密集的免疫染色和BDNF mRNA阳性细胞分布在中间外侧隔的吻侧部（图。​（图44D–F型). 在其他基底前脑区域，如内侧隔核（图。​（图44我)，对角线带的垂直边（图。​（图44我)大细胞视前核、内侧视前区和隔下丘脑核，可见少量BDNF-mRNA阳性细胞。在这些区域中，仅偶尔可见BDNF-免疫活性细胞（图。​（图44J型). 此外，在三角隔核和隔胚核（未显示）中观察到许多轻度免疫染色的细胞。在许多基底前脑区域也检测到免疫反应性纤维。在外侧隔的背侧和腹侧部分，纤维标记良好，经常在未染色的胞周周围形成胞周篮（图。​（图22D类,​,44J型). 相反，内侧隔相对缺乏纤维染色（图。​（图44J型). 在隔下丘脑核和穹窿下器官也观察到中度BDNF-免疫活性纤维标记。基底神经节细胞或纤维中均未检测到BDNF mRNA和少量BDNF-ir。只有在纹状体的最背侧和邻近胼胝体偶尔观察到单个标记良好的BDNF-免疫活性细胞和神经元形态。

如表所示​表3，三BDNF-ir和mRNA在丘脑和中脑的许多区域都有发现，在含有标记细胞和免疫反应纤维的区域之间存在差异。例如，丘脑束旁核（图。​（图77G、 小时)含有大量mRNA-阳性和免疫反应性胞体，但没有免疫染色纤维。相反，在前腹核和前内侧核中，有适度的纤维免疫染色，但几乎没有细胞杂交或免疫反应（图。​（图77A、 B类). 在背侧和腹侧膝状体细胞核内，存在许多免疫反应纤维，但不存在免疫反应或cRNA标记的细胞体（图。​（图88一、 J型). 在某些领域，杂交和免疫标记的分布相似。例如，在内侧膝状体中，背侧和腹侧部分缺乏免疫标记和杂交，而该核的内侧部分和膝状体上核含有适度的核周杂交和免疫标记（图。​（图77M、 N个). 在上丘，cRNA杂交和免疫反应也在深层至浅灰色层重叠（图。​（图77一、 J型).

在单独的窗口中打开

图7。

BDNF-ir和mRNA在丘脑和脑干区域的定位。显示BDNF-cRNA杂交的暗场和明场显微照片(A、 C、E、G、I、K、M、O、Q)和BDNF免疫标记(B、 D、F、H、J、L、N、P、R)分别位于丘脑(A、 B类)，乳头区(C、 D类)，蓝斑(E、 F类)，束旁核(PF公司) (G、 H（H）)，上丘(I、 J)下橄榄复合体(K、 L（左）)，内侧膝状体核(M、 N个)，臂旁区(O、 P（P）)和孤束核(Q、 R（右）). 在许多丘脑(A、 B、G、H、M、N)和下丘脑(C、 D类)区域、BDNF mRNA和核仁周围BDNF-ir的分布重叠；虽然在某些区域[例如丘脑前腹核(成人影片)]在没有杂交的情况下存在重纤维/末端BDNF ir(A、 B类). 在其他区域，如蓝斑(信用证) (E、 F类)和孤束核(溶胶) (Q、 R（右）)，可以检测到cRNA标记的细胞，但由于纤维/末端免疫标记，很难识别免疫染色的细胞。cRNA和抗体的弱标记也在上丘的大多数层重叠，不包括不含cRNA标记的浅灰色层(一、 J型). 相反，在下橄榄复合体中检测到重杂交和BDNF-ir(K、 L（左）). 臂旁外侧核的外部有中度到重度BDNF-cRNA标记(液化石油气（LPBE）)而重型纤维/末端BDNF-ir出现在臂旁外侧亚区的大多数亚区(低压断路器) (O、 P（P）); cRNA和抗体均未标记臂旁核的内侧部分(主生产线) (O、 P（P）). 比例尺（如所示B、 D、J、N):A–D、I、J、M、N分别为500μm；（如所示F类):E、 F类，200微米；（如所示H、 P、R):G、 H、O、P–R分别为250μm。AP公司，最后面的区域；CG公司中央（导水管周围）灰色；DpG公司上丘，深灰色层；DpMe公司中脑深核；DTg公司被盖背核；前，反屈束；希腊，薄核；国际机械师协会丘脑内侧核；惯性导航与制导上丘，中间灰色层；爱荷华州下橄榄，A亚核；国际奥委会下橄榄，C亚核；IOD公司下橄榄，背核；低密度VL，丘脑背侧核，腹外侧；左侧下丘脑外侧区；LM公司，乳头外侧核；轻轨外侧网状核；MG公司内侧膝状体核；米高梅内侧膝状体核，内侧部分；MM（毫米）乳头内侧核；操作上丘、视神经层；PIL公司层内后核；PrC公司髓鞘前核；聚丙烯，丘脑脚周核；PT公司丘脑旁核；光伏丘脑室旁核；第页，锥体束；供应链计划小脑上脚；新加坡膝上核；子公司C，巩膜下核；SuG公司上丘，浅灰色层；SuM公司乳头上核；VL公司，丘脑腹外侧核。

在单独的窗口中打开

图8。

在缺乏BDNF mRNA表达的许多区域存在密集的纤维/末端BDNF-ir。A–L处理后截面的暗场和明场显微照片就地杂交(A、 C–E、I、K)和免疫组织化学(B、 F–H、J、L)分别通过杏仁核(A、 B类)，缰绳(C、 F类)，终纹床核(D、 G公司)，脊髓(E、 H（H）)，外侧膝状体核(一、 J型)和被盖背核/腹核(K、 L（左）). 如中所示A类和B类，在基底外侧(布拉)和外侧杏仁核(洛杉矶)，许多细胞的mRNA和BDNF-ir都被大量标记，而中央杏仁核中存在许多免疫标记纤维/终末，但cRNA杂交没有。同样，内侧缰核(MHb公司) (C、 F类)终纹床核亚区(D、 G公司)，背部(DLG公司)和腹部区域(VLG（VLG）)外侧膝状体核(一、 J型)，膝间叶(IGL公司) (一、 J型)和腹侧被盖核(VTg（垂直起落架）) (K、 L（左）)，重纤维/末端BDNF-ir未检测到mRNA。在脊髓（显示颈部水平）中，重免疫染色纤维主要存在于第2层(H（H）)缺乏BDNF mRNA(E类). 比例尺（如所示B类):A、 B类500微米；（如所示F类):C、 D、F、G500微米；（如所示H（H）):E、 H（H）150微米；（如所示J、 L（左）):I–L型500微米。交流电，前连合；英国顶级域名，终纹床核，背侧；BSTLJ公司终纹床核，囊旁；英国标准技术手册终纹床核，内侧；CeL公司中央杏仁核，外侧分裂；CeM公司中央杏仁核，内侧分裂；CPu（中央处理器）尾状壳核（纹状体）；兽穴背侧内虹膜核；DG公司，齿状回；DTg公司被盖背核；高频海马结构；集成电路，内囊；拉丁美洲颈外侧核；信用证蓝斑；左侧b外侧缰核；低压侧脑室；选择，视路；Pir公司梨状皮层；光伏丘脑室旁核；SHy公司隔下丘脑核；子G，近卵状核；4伏，第四脑室。

如图所示​图88A、 B类并总结在表中​表2，2BDNF mRNA和BDNF-ir在杏仁核复合体中表现出明显的模式。基底外侧、内侧和基底内侧杏仁核含有大量cRNA-标记和BDNF-免疫活性细胞体，但很少有免疫活性纤维。相反，杏仁核中央核（尤其是外侧亚区）绝对不含BDNF mRNA或BDNF-免疫活性细胞，但含有高密度的免疫标记纤维，这些纤维通常在未标记的胞周周围形成胞周篮。在终纹床核内（图。​（图88D、 G公司)在外侧背侧和囊旁区域观察到大量的细胞周纤维标记，而该核的其他部位有中等密度的免疫反应纤维。终纹床核的任何部分均未检测到BDNF mRNA。

在下丘脑中，观察到BDNF-ir和mRNA的不同程度的细胞标记，并且在许多区域存在低到中等水平的免疫反应纤维标记（表​（表4，4，图。​图1）。1). 少量轻度cRNA标记的细胞散布于下丘脑外侧核和侧前核，并延伸至灰质结节区。下丘脑腹内侧核和下丘脑后部区域分布着较多的cRNA标记和免疫反应细胞。在下丘脑室旁核内，内侧和腹侧小细胞区的许多细胞被cRNA很好地标记，而外侧大细胞区的细胞则没有标记。在乳头和乳头上区域，许多细胞的mRNA和免疫反应性均呈阳性（图。​（图77C、 D类). 有趣的是，在正中隆起和漏斗干中观察到BDNF-免疫反应纤维，但没有免疫反应或cRNA标记的细胞体。内侧缰核也有类似的模式，其中含有非常高密度的免疫反应纤维，但缺乏可检测到的细胞标记（免疫反应或杂交）（图。​（图88C、 F类).

在脑干中，观察到许多BDNF cRNA标记的细胞，除少数例外，这些细胞的分布与免疫反应性细胞体的分布密切相关（表​（表5）。5). 一些显著的例外是臂旁外侧核（图。​（图77O、 P（P）)，蓝斑（图。​（图77E、 F类)和孤束核（图。​（图77Q、 R（右）)，其中含有浓密的cRNA标记细胞，但没有检测到免疫反应性胞体。所有三个区域均有纤维免疫染色，尽管臂旁外侧核（尤其是外侧区内）和孤束核内纤维染色的高密度和独特特征可能掩盖了免疫反应细胞体。相反，在一些脑干细胞核中，如脊髓前庭核、下丘中央核和巨细胞网状核，细胞体呈轻度免疫染色，但未检测到BDNF mRNA。在脑干的许多区域，如臂旁外侧核、孤束核，都有非常重的纤维免疫标记（图。​（图77R（右）)，后部区域，下橄榄色（图。​（图77L（左）)和腹侧被盖核（图。​（图88L（左）). 如表所示​表5，5，小脑中未检测到cRNA杂交或免疫染色。

在脊髓中，纤维标记出现在1–3层，在2层尤为明显（表​（表5，5，图。​图88E、 H（H）). 此外，偶尔BDNF-免疫活性细胞散布在第3、6和7层，偶尔杂交细胞出现在第7层。

尽管轴突BDNF-ir可能通过顺行或逆行运输产生，但在缺乏BDNF mRNA的区域中，似乎是终末树突（即结节状突起）存在免疫染色（图。​（图8）8)提示这些区域内的BDNF可能来源于传入系统的顺行轴突运输。为了验证这一假设，我们选择了两个区域，在这两个区域中，这种不匹配特别显著，并且对传入系统有足够的了解：即杏仁核中央核/终纹床核和内侧缰核。已知杏仁核中央、被囊旁和床核外侧背侧部分的传入来自脑桥臂旁核(Bernard等人，1993年;Alden等人，1994年). 臂旁核的特定消融（单侧或双侧）（图。​（图99C类)导致中央杏仁核中BDNF-免疫活性纤维几乎完全丢失（图。​（图99B类)以及病损同侧床核的囊旁和外侧背侧部分（未显示）。同样，选择性破坏向内侧缰核提供传入神经的连合上隔神经元(萨瑟兰，1982年)导致同侧内侧缰核内几乎所有BDNF-ir丢失（图。​（图99D–F型). 在这些动物中，特别注意避免损伤更多的腹侧场，包括内侧缰核的内侧纹和其他传入纤维(萨瑟兰，1982年).

在单独的窗口中打开

图9。

BDNF通过传入系统的顺行轴突运输。显示通过杏仁核进行BDNF免疫组织化学处理的切片的亮场显微照片(A、 B类)，臂旁区(C类)和缰绳(D–F型)对照组大鼠(A、 D类)或接受臂旁外侧核电解损伤的大鼠(C类)或胚胎隔核和三角核的吸引性病变(E、 F类; 病变部位未显示）。如中所示A–C中央核内BDNF免疫标记(总工程师)杏仁核的(A类)几乎完全消除(B类)臂旁外侧核细胞体消融后(低压断路器) (C类); 在里面C类，病变破坏了大部分LPB，但保留了臂旁内侧核(主生产线).D–F型显示内侧缰核中的BDNF-ir(MHb公司) (D类)单侧胚胎隔/三角隔核病变导致同侧丢失(E类)或双侧损伤这些区域后(F类). 比例尺（如所示A类):A、 B类500微米；C类500微米；（如所示D类):D–F型750微米。布拉基底外侧杏仁核；CeL公司中央杏仁核，外侧分裂；CeM公司中央杏仁核，内侧分裂；洛杉矶侧杏仁核；信用证蓝斑；左侧b外侧缰核；选择，视路；光伏，室旁丘脑核。

讨论

近年来，一些研究人员使用就地杂交技术。通过免疫组织化学方法定位CNS内神经营养蛋白的研究较少。虽然最初可能认为蛋白质的定位会产生多余的信息来识别其mRNA，但事实并非如此。正如在大鼠中枢神经系统NGF免疫反应性研究中所观察到的那样(Conner和Varon，1992年;Conner等人，1992年)正常情况下，合成NGF的细胞没有积累足够的抗原，无法通过免疫组织化学方法进行检测（尽管秋水仙碱预处理迫使正常输出的蛋白质在细胞体内积累，但确实可以检测到NGF生成细胞）。此外，一些细胞不产生NGF，如基底前脑胆碱能神经元(Lauterborn等人，1995年)，在正常情况下确实含有NGF免疫反应性(Conner等人，1992年). 这种免疫反应被认为起源于NGF从遥远的合成部位逆行运输和积累；这与秋水仙碱处理后积累减少的观察结果一致。最后，NGF蛋白已在细胞体内以外的位置（即海马苔藓纤维区域）被鉴定出来，这表明蛋白质的存储位置不必在合成发生的细胞体内。蛋白质在外体部位的积累可能是由于其顺着产生细胞的轴突或树突树干顺行运输，也可能是由于选择性结合或吸收和积累释放到细胞外空间的蛋白质。

在目前的研究中，BDNF蛋白定位于两个基本分区：神经元细胞体内和纤维或轴突末端。细胞体内BDNF的免疫染色以弥漫细胞质标记为特征，并且几乎完全与含有BDNF mRNA的细胞群相关，这表明BDNF-ir池代表产生BDNF细胞保留的蛋白质。我们没有观察到任何神经元群体具有与基底前脑胆碱能神经元的NGF免疫染色类似的强健的点状BDNF免疫染色(Conner等人，1992年). 这表明，在中枢神经系统中，神经元胞体不象带有NGF的基底前脑神经元那样通过逆行转运积累内源性BDNF，或者如果它们确实积累了BDNF的话，它们的储存量不足以检测到这些点状体。或者，逆行累积的BDNF（弥漫性）的超微结构定位可能不同于NGF（点状）。

本研究中观察到的BDNF产生细胞的分布在很大程度上与其他研究的累积结果一致(Ernfors等人，1990年;菲利普斯等人，1990年;Ceccatelli等人，1991年; Friedman等人，1991年；Guthrie和Gall，1991年;Gall等人，1992年;Castrén等人，1995年). 目前和以前的研究之间的一些区别包括：（1）我们无法通过大鼠小脑颗粒细胞证实BDNF的表达（杂交或免疫标记）(Castrén等人，1995年); （2） 目前下丘脑室旁核大细胞神经元缺乏BDNF-cRNA标记(Castrén等人，1995年)尽管杂交和免疫染色确实标记了下丘脑室旁核旁细胞区的神经元；（3）我们无法在面部运动核神经元或脊髓运动神经元中检测BDNF-ir或mRNA(Ceccatelli等人，1991年). 然而，关于最后一点，Ceccatelli等人（1991年）描述了秋水仙碱治疗后BDNF mRNA的分布，而在本研究中，检测了未经治疗的大鼠BDNF的表达。最后，我们在许多以前没有报道过表达这种神经营养素的神经元群中检测到BDNF mRNA，包括位于外侧膝状体和黑质之间的细胞（例如，膝上核、脚周核、内侧膝状体核的内侧分裂）、隔丘脑核中的细胞，伞隔核、直肠前内侧核、外侧嗅束核和束下核，以及位于外侧臂旁核各亚群（尤其是外部）的细胞。

这里的免疫组化数据显示BDNF蛋白在大鼠大脑的整个口唇沟道范围和脊髓中广泛但不连续的定位，并且与以前对包括海马在内的前脑部分区域的免疫组织化学研究部分一致(Wetmore等人，1991年,1993,1994;Humpel等人，1993年;Dugich-Djordjevic等人，1995年)和几个丘脑和中脑/脑干细胞核(Dugich-Djordjevic等人，1995年). 然而，目前的结果显示了以前没有报道过的特征，例如鉴定了大量具有中度至重度核周BDNF-ir（和高BDNF mRNA含量）的神经元群体，包括但不限于前嗅核、乳头上核、各种下丘脑核、内虹膜核、，中央灰色，近纤毛/脚周区，脚轮齿被盖核，孤束核和下橄榄。更重要的是，本研究与其他研究之间最显著的区别之一是，在本材料中，在大脑的许多区域都可以看到强烈的纤维标记，而这在以前没有描述过。在先前的研究中，海马苔藓纤维明显缺乏免疫染色是最显著的差异之一。纤维染色的这种差异可能是由于各种研究中使用的抗体制剂或固定方案的特征不同，或者是由于先前研究范围的不同，其中一些结构可能根本没有被评论。

如图所示，BDNF免疫染色模式最有趣的一个方面是广泛但解剖上离散的纤维/末端标记。许多区域，如内侧缰核、杏仁核中央核、被盖腹侧核和终纹床核，含有高密度的BDNF-ir纤维，但没有检测到BDNF mRNA。此外，在齿状回分子层等区域，BDNF-ir纤维密度的层流差异在内三分之一处用中光染色观察，在外三分之一无明显染色；这一层流模式与该区域的主要传入纤维的层流终止很吻合，即齿状连合/结合系统终止于内分子层，传入纤维起源于内侧和外侧内嗅皮层终止于中分子层和外分子层，分别(加尔，1990年). 这些结果表明，BDNF蛋白通过顺行运输至少分布到其中一些区域，并且确实位于传入轴突系统内。在验证这一假设的两个案例中，通过消除向富含BDNF和mRNA-贫穷区域提供传入神经的神经元胞体，免疫反应纤维被消除。虽然这些数据并不排除中枢神经系统内某些纤维染色可能反映逆行运输的可能性，但有证据表明内源性BDNF在至少两个中枢神经系统中是顺行运输的，这与最近观察到内源性BDNF是由大鼠外周感觉神经节顺行运输一致(周和拉什，1996)在发育中的小鸡中，外源性BDNF和NT-3可以从视网膜顺行运输到顶盖（von Bartheld等人，1996）。这些发现共同挑战了营养因子信号传递的观点主要是包括从突触后靶细胞向突触前反应神经元传递因子。需要进行更多的研究，以确定顺行转运在何种程度上解释了当前材料中的纤维染色，此外，顺行转运的内源性BDNF的命运。

目前研究中获得的BDNF蛋白轴突极化的证据与古德曼等人（1996）这表明BDNF在Madin Darby犬肾上皮细胞中的顶端极化。各种研究描述了顶端/轴突和基底外侧/体树突结构域之间的相似性，并表明常见的靶向信号可能控制神经元和上皮细胞中的蛋白质运输(Dotti和Simons，1990年; 有关查看信息，请参阅Rodriguez-Boulan和Zurzolo，1993年). 然而，本研究的结果与最近在培养的海马神经元中报道的BDNF和NGF的体脂蛋白极化相反(Blöchl和Thoenen，1996年;Goodman等人，1996年). 这种差异可能归因于成熟神经元功能特性的差异体内与胚胎神经元相比在体外研究。胚胎海马神经元中可能尚未表达神经营养蛋白适当轴突运输所需的分子。同样重要的是要指出，在这些先前研究中检测到的发育中的海马神经元通常不会产生大量BDNF或NGF蛋白，因此转染后在过度表达启动子的控制下产生这些神经营养素。

这里观察到的纤维/末端标记的另一个有趣的方面是，含有可能顺行传递BDNF的传入轴突的通路没有被标记（例如，在隔胚/隔三角-内侧缰核投射的情况下的内侧纹）。这表明BDNF蛋白的积累在轴突末端附近最为显著。此外，在轴突终止区域内，免疫反应产物通常以离散的点状出现在未染色的细胞体周围，这表明BDNF可能优先定位于突触前终末。虽然还需要使用电子显微镜技术进行进一步研究，以确定BDNF-ir的确切亚细胞位置，但这种神经营养素在轴突终末内积累的功能意义仍有待阐明。神经营养素在轴突末端的储存可能为这些因子的快速活性依赖性释放提供了一种手段(Blöchl和Thoenen，1995年,1996;Humpel等人，1995年;Goodman等人，1996年)从而有机会调节突触事件。鉴于最近的研究表明BDNF可能具有急性(Kang和Schuman，1995年)和持久的影响(Lohof等人，1993年;Korte等人，1995年)关于大脑中突触传递的增强。

脚注

参考文献