动物（巴塞尔）。2019年5月；9(5): 266.
L-色氨酸增强Diquat-Challenged仔猪肠道完整性并改善氧化还原状态和线粒体功能
2019年5月4日收到；2019年5月21日接受。
摘要
简单摘要
在本研究中，用联吡啶类除草剂敌草枯处理三组仔猪，敌草枯可以利用分子氧产生超氧阴离子自由基，被广泛认为是诱导氧化应激的有效化学剂。三组分别饲喂添加了0、0.15%和0.30%色氨酸（Trp）的日粮，一个未添加敌草枯的对照组用于研究添加Trp对氧化应激仔猪生长性能和肠道屏障功能的保护作用。结果表明，添加0.15%的Trp可缓解敌草枯诱导的生长性能受损、肠屏障损伤、氧化还原失衡和线粒体功能障碍。本研究的这些结果表明，在应激条件下，仔猪可能需要更多的Trp来维持肠道完整性和最佳生长性能，但需要根据不同的条件或模型确定适当的Trp补充剂量。
摘要
研究表明，补充色氨酸（Trp）可以提高仔猪的生长性能和肠道完整性。然而，添加Trp对暴露于氧化应激的仔猪肠道屏障功能的影响尚不清楚。本研究旨在评估日粮中添加Trp能否减轻敌草枯注射液引起的仔猪肠道损伤、氧化应激和线粒体功能障碍。32头25日龄仔猪随机分为四组：（1）非激发对照组；（2） 敌草枯控制；（3） 0.15%添加Trp的日粮+敌草枯；（4） 0.30%添加Trp的日粮+敌草枯。第七天，将无菌生理盐水或敌草枯（10 mg/kg体重）腹腔注射给小猪。实验持续了21天。从第7天到第21天，日粮中添加0.15%的Trp可以提高双季铵盐断奶仔猪的生长性能。百草枯可导致肠道通透性增加、抗氧化能力受损和线粒体功能障碍。虽然饮食中添加0.15%的Trp改善了敌草枯激发引起的这些负面影响，表现为降低了4kDa异硫氰酸荧光素葡聚糖的通透性，增加了抗氧化指数，并增强了线粒体的生物生成。结果表明，日粮中添加0.15%的Trp可以增强仔猪肠道的完整性，恢复氧化还原状态，并改善受到敌草枯攻击的仔猪的线粒体功能。
关键词：色氨酸、氧化应激、肠屏障功能、线粒体、仔猪
1.简介
早期断奶策略已普遍应用于生猪生产，因为它可以缩短生猪的屠宰周期，提高母猪的繁殖性能[1]. 然而，断奶本身是一种应激状态，会导致腹泻的发生率增加，从而增加仔猪的死亡率并降低其生长性能[2]. 此外，以肠道通透性增加为特征的断奶应激诱导的肠屏障功能障碍已被证明是断奶后仔猪严重腹泻和生长性能下降的主要原因之一[三]. 色氨酸（Trp）是大多数猪玉米日粮中的第二限制性氨基酸，在功能上调节身体蛋白质合成，改善应激和免疫反应[4，5]. 几项研究表明，膳食中添加Trp可增强肠道完整性，降低腹泻率，从而改善生长性能[6，7]. 相比之下，先前的一项研究表明，饮食中添加0.1%Trp显著增加了肠道通透性，并降低了紧密连接蛋白的基因表达[8]. 有趣的是，来自同一组的作者得出结论认为，添加Trp的饮食会损害仔猪的肠道完整性，他们认为添加0.15%Trp的食物会增加绒毛高度与窝深的比率，而不会影响肠道通透性[9]. 最近的一项研究表明，喂食添加0.20%或0.4%Trp的日粮的断奶仔猪比喂食基础日粮的仔猪表现出更强的肠粘膜屏障功能[5]. 由此可见，日粮中添加适量的Trp有利于提高仔猪肠道的完整性和生长性能。
据报道，肠道氧化还原失衡会导致断奶仔猪肠粘膜屏障受损和生长性能下降[10]. 断奶应激破坏自由基代谢并损害抗氧化系统，从而诱发严重的氧化应激，其特征是抗氧化剂和抗氧化酶不足，无法清除过量生成的活性氧（ROS）[11，12]. 几项研究表明，氧化应激和氧化还原稳态的破坏会导致肠道屏障破裂和/或紧密连接蛋白表达下降，从而导致肠道细胞旁通透性增加[13，14，15]. 为了保持细胞的完整性和功能，肠道需要大量能量，而能量主要由细胞内的细胞器、线粒体提供[16]. 同时，线粒体是细胞内活性氧的主要来源，也是活性氧损伤作用的重要靶点之一[17]. 在氧化应激的情况下，细胞的抗氧化能力不足以清除产生的ROS，导致ROS在线粒体中过度积累[13]. ROS生成和清除之间的不平衡导致线粒体功能障碍，如异常的生物生成过程和ATP合成中断[18]. 体内研究表明，肠屏障功能的维持依赖于线粒体的生物生成和ATP的生成[13，19]. 综上所述，肠道氧化还原平衡受损和线粒体功能障碍可能导致暴露于氧化应激的仔猪肠道屏障功能受损。
考虑到添加Trp对断奶仔猪肠屏障功能的影响，确定添加适当剂量Trp的膳食是否能在氧化应激变化模型中发挥这种作用是必要的。此外，确定补充色氨酸对肠屏障功能的益处是否与改善肠道氧化还原状态和线粒体功能有关，这将非常有意义。在之前的一项研究中，日粮中添加0.12%Trp可增强氧化应激仔猪的抗氧化能力，并提高肝脏中抗氧化酶的活性[12]. 因此，我们假设膳食中补充适量的Trp可以通过恢复氧化还原平衡和线粒体功能来缓解氧化应激诱导的肠屏障功能受损。在本研究中，通过注射敌草枯诱导氧化应激的一个有充分文献记载的模型[12，13]研究了添加Trp对断奶仔猪肠道屏障功能、氧化还原状态和线粒体功能的保护作用。
2.材料和方法
2.1. 道德声明
本实验按照中国动物福利指南进行，所有实验程序均经西南科技大学（中国四川绵阳）伦理委员会批准，许可证号为DKX-1020150040。
2.2。动物和治疗
从新希望集团的一个高卫生状态饲养场中，从8窝（每窝4头仔猪）中选择32头去势公猪，即杜洛克×（长白×约克郡）商品杂交猪[20]. 小猪在18日龄时断奶，并被带到西南科技大学猪研究所的动物实验设施。经过7天的适应期后，将选定的平均体重（BW）为6.62 kg的仔猪（25天龄）随机分配到4个治疗组中的一个(n个=每治疗8头仔猪）：（1）非激发对照组（对照组），仔猪喂基础饲料并注射生理盐水；（2） 敌草枯组（敌草枯），仔猪饲喂基础饲料并注射敌草枯（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）；（3） 0.15%Trp+敌草枯，仔猪在基础日粮中添加0.15%Trp（Trp1日粮）并注射敌草枯；（4） 0.30%Trp+敌草枯，仔猪饲喂基础日粮，补充0.30%Trp（Trp2日粮），注射敌草枯。对体重和窝重进行平衡处理，并探讨Trp在氧化应激条件下对仔猪生产性能和肠道完整性的保护作用，因此，本研究不包括喂食添加了Trp且未添加敌草枯的饲料的仔猪组。基础日粮的标准回肠可消化（SID）Trp含量为0.22，其配方满足或超过了国家研究委员会建议的7-11公斤猪的营养需求（NRC 2012）[21]. 基础日粮中添加0.153%或0.306%的L-色氨酸（纯度98.0%；赢创德固赛（中国）有限公司，中国北京），使Trp1或Trp2日粮中SID-Trp含量比基础日粮多0.15%或0.30%。Trp的补充水平是基于先前的一项研究，该研究表明，0.12%的Trp补充能够缓解敌喹诱导的肝脏氧化应激[12]. 如前所述，通过调节L-丙氨酸和玉米淀粉的含量，使所有的饮食保持等氮和等能量[22]. 实验日粮的成分组成和营养水平列于.用各自的饲料喂养仔猪21天。第7天，敌草枯组、0.15%Trp+敌草枯和0.30%Trp+敌草枯组的仔猪以10 mg/kg体重经腹腔注射敌草枯（二溴化物，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA），而对照组仔猪则接受相同体积的无菌盐水。在整个试验过程中，小猪被单独安置在不锈钢代谢笼中，笼中配有奶嘴饮水器和喂食器，并允许随意获取饲料和水。在整个实验过程中，小猪无法获得抗生素。
表1
| 项目 | 基本饮食 | Trp1饮食三 | Trp2饮食三 |
|---|
| 成分组成，% |
| 玉米 | 30.83 | 30.83 | 30.83 |
| 挤压玉米 | 24 | 24 | 24 |
| 挤压大豆 | 6 | 6 | 6 |
| 脱皮豆粕（44%粗蛋白） | 10 | 10 | 10 |
| 大豆浓缩蛋白 | 10 | 10 | 10 |
| 乳清粉 | 5 | 5 | 5 |
| 鱼粉 | 5 | 5 | 5 |
| 大豆油 | 1.80 | 1.80 | 1.80 |
| 蔗糖 | 3 | 3 | 3 |
| 葡萄糖 | 1.69 | 1.69 | 1.69 |
| 玉米淀粉 | 0.039 | 0.019 | 0 |
| 盐 | 0.30 | 0.30 | 0.30 |
| 石灰石 | 0.72 | 0.72 | 0.72 |
| 磷酸钙 | 0.52 | 0.52 | 0.52 |
| 氯胆碱 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
| 维生素预混料1 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 矿物预混料2 | 0.30 | 0.30 | 0.30 |
| L-色氨酸（98.0%） | 0 | 0.153 | 0.306 |
| L-丙氨酸（99.8%） | 0.271 | 0.138 | 0.004 |
| DL-蛋氨酸（98.5%） | 0.13 | 0.13 | 0.13 |
| L-赖氨酸·盐酸（78%） | 0.18 | 0.18 | 0.18 |
| L-苏氨酸（98.5%） | 0.07 | 0.07 | 0.07 |
| 总计 | 100 | 100 | 100 |
| 营养水平（计算值） |
| DE/（兆焦耳/千克） | 15.04 | 15.04 | 15.04 |
| 粗蛋白（%） | 20.88 | 20.88 | 20.88 |
| 钙（%） | 0.80 | 0.80 | 0.80 |
| 有效磷（%） | 0.41 | 0.41 | 0.41 |
| SID赖氨酸（%） | 1.35 | 1.35 | 1.35 |
| 已达到SID（%） | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| SID Thr（%） | 0.80 | 0.80 | 0.80 |
| SID-Trp（%） | 0.22 | 0.37 | 0.52 |
2.3. 绩效衡量和样本收集
每天记录每头仔猪的采食量，以计算d0–d7和d7–d21期间的平均日采食量（ADFI），并在试验的d0、d7和d 21期间测量每头仔猪的体重，以确定d0–d 7和d7-d 21期间的日均增重（ADG）。通过将相应的ADFI除以ADG来确定每个时期每头仔猪的饲料增益比。在本研究中，在基础日粮中添加L-色氨酸是为了阐明补充色氨酸对断奶仔猪肠道功能障碍的益处。因此，选择两个色氨酸处理组中生长性能较好的组（0.15%色氨酸+二枯）作为适当的色氨酸处理，以进一步研究色氨酸对肠道功能的益处。在试验的第21天，从对照组、敌草枯组和0.15%Trp+敌草枯对照组各抽取8头仔猪。隔夜断奶后，将仔猪的血样从前静脉收集到不含抗凝剂（5 mL）的试管中，然后在3000×g下离心10分钟。收集上清液（血清）并在−20°C下保存，直到进一步分析。血液取样后，通过静脉注射（10 mg/kg BW）唑拉西泮和替利他明的混合物（一种含有125 mg替利他胺和125 mg唑拉西帕姆的冻干产品，在使用前溶解在5 mL无菌盐水中，最终浓度为50 mg/mL）对小猪进行麻醉，然后放血。尸检后，立即取出整个小肠，取出空肠进行样品采集。从近端空肠收集10厘米的节段用于Ussing chamber研究。相邻空肠的另一个5厘米部分被纵向打开，并用冰镇磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）清洗。从该节段收集约100 mg新鲜空肠样品，并将其储存在4°C下，以分离肠线粒体。此外，处理来自同一区域的20 cm空肠段，以获取粘膜刮片，将其立即浸入液氮中，然后储存在−80°C下进行进一步分析。
2.4. 血清肠道通透性生物标志物浓度
如前所述，使用分光光度法测量血清中的二胺氧化酶（DAO）活性[23]. 简言之，反应混合物，包含0.5 mL血清样品、3 mL磷酸盐缓冲液（0.2 M，pH 7.2）、0.1 mL邻二氨基二苯甲醚-甲醇溶液（0.5%邻二氨基三苯甲醚甲醇溶液）、0.1 mL辣根过氧化物酶溶液（0.004%）和0.1 mL底物溶液（0.175%尸体盐酸），在37°C下孵育30分钟，并测量436nm处的吸光度以计算DAO活性。结果以单位/升（U/L）血清表示。根据制造商的说明，采用商业ELISA试剂盒（中国北京绿源伯德生物技术有限公司）和微孔板阅读器测量血清中的D-乳酸浓度。D-乳酸浓度的结果以微克每毫升（μg/mL）表示。所有分析均一式三份。
2.5. 肠屏障功能的体外测量
如前所述，通过使用Ussing chamber技术测量跨上皮电阻（TER）和大分子标记物的易位，在体外评估肠粘膜通透性[13，24，25]. 将新鲜空肠粘膜样品从浆膜肌层剥离，然后安装在EasyMount Ussing腔室系统中（型号VCC MC6，Physiological Instruments，San Diego，CA，USA）。肠片被5 mL林格溶液包围，林格溶液在浆膜侧含有10 mM葡萄糖，在粘膜侧含有相同浓度的甘露醇。用95%的氧对系统进行氧化2和5%CO2气流和水套温度达到37°C。连接到Acquire and Analyze软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥生理仪器公司）的夹具用于自动数据采集。在20分钟的平衡期后，每隔20分钟记录一次超过80分钟的TER。为了测量大分子标记的易位，在20分钟平衡期之后，4kDa异硫氰酸荧光素葡聚糖（FD4，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）添加到安装好的肠板的粘膜侧，最终浓度为0.8 mg/mL FD4。在添加标记物后的20、40、60和80分钟，从安装好的肠板的浆膜侧采集样品（50μL），然后转移到96-well分析板中。使用荧光微孔板阅读器（FLx800，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT，USA）在485 nm的激发波长下测量从组织浆膜侧采集的样品的FD4荧光强度。计算了80分钟内FD4的通量，并将其表示为表观渗透系数（cm/s）。
2.6. 肠道氧化还原状态测量
按照制造商的说明，采用商用SOD、GPx、CAT和MDA检测试剂盒（中国江苏省南京建成生物工程研究所），利用空肠粘膜测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）浓度。根据制造商的方案，使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒（Pierce Chemical，Rockford，IL，USA）测定空肠粘膜中的总蛋白含量。SOD、GPx和CAT活性的结果以单位/微克空肠蛋白（U/mg-prot）表示，而MDA的结果以nmol/微克空肠蛋白（nmol/mg-prot）表示。所有分析均一式三份。
2.7. 肠道线粒体的分离
按照制造商的说明，使用商用组织线粒体分离试剂盒（中国上海贝约泰生物技术研究所）分离空肠线粒体。线粒体分离的所有程序均在4°C下进行。如前所述，通过Western blotting检查β-肌动蛋白和电压依赖性阴离子选择性通道（VDAC）的存在来验证分离线粒体的纯度[26]. β-肌动蛋白和VDAC分别是细胞质和线粒体的标记蛋白。在本研究中，分离的线粒体中未检测到β-肌动蛋白的表达，表明分离的线粒体样品中没有细胞液衍生蛋白的污染。根据制造商的协议，使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce Chemical，Rockford，IL，USA）测量线粒体蛋白质含量。
2.8. 肠线粒体活性氧测定
如前一项研究所述，使用荧光微孔板阅读器和二氯氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）测量肠线粒体中的ROS生成[8]. 简单地说，用2μM DCFDA对分离的肠线粒体（0.4 mg/mL）进行染色，并在25°C下培养20分钟。DCFDA穿过膜，在ROS存在下氧化为二氯氢荧光素（DCF），其激发波长和发射波长分别为485 nm和530 nm。在λex 485 nm和λem 530 nm下测定荧光。因此，DCF荧光强度的任意单位用于指示线粒体样品中的ROS水平。所有样本的ROS水平表示为相对于对照组平均ROS水平的倍数变化。
2.9. 肠线粒体膜电位（ΔΨm）测定
使用带有荧光染料JC-1的线粒体膜电位测定试剂盒（中国上海贝奥泰姆生物技术研究所）测量所有分离线粒体样品的线粒体膜电势（ΔΨm）。JC-1染料与线粒体膜成分的相互作用可以改变其与单体和聚集体的转换相关的荧光特性。当线粒体膜电位较低时，可以看到产生绿色荧光的JC-1单体荧光形式，而在线粒体膜电位较高时，会出现产生红色荧光的JC-2染料聚集形式。将分离的肠线粒体（0.4 mg/mL）在37°C下用JC-1（500 nM）染色30分钟。用荧光微孔板阅读器测定荧光强度。JC-1单体荧光形式在485nm激发，发射荧光在530nm检测，JC-1聚集体形式在485 nm激发，发光在590nm检测。因此，ΔΨm用红/绿荧光强度比表示。所有样品的肠线粒体膜电位（ΔΨm）均表示为相对于对照组平均Δψm的倍数变化。
2.10. 空肠线粒体DNA（mtDNA）含量的测定
使用DNAiso试剂（Takara Bio Inc.，中国大连）从空肠样本中提取总DNA。DNA的质量控制如前所述[27]. 通过共同扩增线粒体DNA A环来测量线粒体DNA相对于核基因组DNA的含量(mt D回路)和核编码的betβ-actin(ACTB公司)采用实时PCR检测。mt D-loop和ACTB，其中引物和探针序列列于，用荧光探针定量。每个PCR反应由1μL DNA模板、8μL TaqMan Universal Master混合物、1μL正向引物（2μM）、1μL反向引物（3μM）和1μL增强溶液以及7μL Milli-Q水组成，总体积为20μL。热循环条件如下：初始变性和酶激活步骤（95℃10 s），然后50个变性/退火/延伸循环和数据采集（95℃5 s，60℃25 s，72℃10 s。mtDNA与基因组DNA含量的比值计算为ΔCt（mt CqD回路−核CqACTB公司). 相对丰度（RE）表明组间线粒体DNA含量的因子差异。RE计算为2-ΔΔCq方法，其中ΔΔCt=ΔCq其他组mtDNA含量–ΔCq对照组线粒体DNA含量。
表2
用于测定线粒体DNA（mtDNA）含量的引物和探针序列。
2.11. RNA分离和逆转录定量PCR（RT-qPCR）
使用Bio-Rad Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）从空肠粘膜提取总RNA。在合成cDNA之前进行RNA质量控制。使用Nanodrop ND-1000（Nanodrot Technologies，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）测量分离RNA样品的纯度和浓度。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。通过减反转录控制PCR验证RNA样品中没有基因组DNA污染。在对RNA样品进行质量控制后，使用ImProm-II cDNA合成试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）将1μg不含DNA的高质量RNA转化为cDNA。靶基因，包括紧密连接蛋白（闭塞带1(ZO1公司)，闭塞带2(ZO2公司)，闭塞素(OCLN公司)，克劳丁1(CLDN1型)和克劳丁2(CLDN2型))氧化还原敏感基因（铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1标准)，血红素加氧酶1(HMOX1型)，谷胱甘肽过氧化物酶(通用处理器X1)，硫氧还蛋白还原酶(TXNRD1型)，核呼吸因子2(NRF2级)和海带样ECH相关蛋白1(KEAP1公司))以及与线粒体生物发生相关的基因（核呼吸因子1(NRF1级)，转录因子A，线粒体(TFAM公司)，过氧化物酶体增殖激活受体γ辅活化因子1α(PPARGC1A公司)，西尔图因1(SIRT1型)，单链DNA结合蛋白1(SSBP1型)和DNA导向RNA聚合酶，线粒体(波尔米特))，在本研究中确定。根据国家生物技术信息中心（NCBI）数据库上公布的猪基因序列的某些外显子-外显子边界，使用Primer3Plus设计引物，并在PCR反应由5μL 2×KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix、0.5μL正向引物（5μM）、0.5μL反向引物（5M）、2μL Milli-Q水和2μL cDNA模板组成。RT-qPCR采用以下热循环条件：初始变性和酶激活步骤（95℃3分钟），然后40个变性/退火循环和数据采集（95℃20秒，退火温度40秒，取决于引物），和熔体曲线分析（从70°C到90°C，每5秒增加0.5°C）。在每次运行中包括5个4倍连续稀释的cDNA点，以通过构建标准曲线获得PCR效率。在本研究中，PCR扩增效率始终在90%到110%之间，并用于将Cq值转换为原始数据。TATA-结合蛋白(TBP（待定）)，DNA拓扑异构酶IIβ(TOP2B排名)、和ACTB公司，其中引物序列列于，被用作参考基因，以规范化RT-qPCR的原始数据。相对基因表达水平表示为相对于对照组基因平均mRNA水平的倍数变化。
2.12. 凝胶电泳和Western印迹
如前所述，通过Western blotting进一步检测空肠粘膜中ZO1、clodin、claudin1、HO1和GPx的蛋白表达[28，29]，以确认转录调控是否也发生在翻译水平。简言之，空肠粘膜的总蛋白提取液在裂解缓冲液（中国江苏省贝尤泰生物技术公司）中收集，并添加完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司），然后在4°C下12000×g离心30分钟进行清除。用BCA蛋白质分析试剂盒（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德，美国）在平板阅读器上测量每个裂解物的蛋白质含量。在10%SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质裂解物（每道30μg），然后将蛋白质转移到聚二氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，Billerica，MA，USA）。在含有吐温的Tris-buffered生理盐水（TBST）中清洗膜，并在室温下用5%脱脂的毫升溶液（Beyotime Biotechnology，江苏，中国）封闭膜1小时，轻轻摇晃。然后，在4°C下用相应的一级抗体隔夜探测斑点。随后，用TBST清洗印迹，并在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体孵育1小时。通过Image Lab统计软件（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Read Laboratories）对印迹上的条带强度进行量化。使用GAPDH作为内部蛋白对靶蛋白的相对表达进行标准化，并表示为相对于对照组的折叠变化。
2.13. 统计分析
仔猪被视为所有分析的实验单位(n个=每治疗8次），所有数据均表示为平均值±标准误差。生长性能数据通过重复测量的方差分析（ANOVA）进行，其他数据使用SAS 9.1软件进行方差分析（SAS Institute，Cary，NC，USA）。使用Tukey检验评估两种处理之间的差异。统计显著性设置为概率值<0.05。
3.结果
3.1. 增长绩效
在敌草枯挑战之前，在试验的前七天，补充L-色氨酸对体重、平均日增重和饲料与增重比没有影响(第页>0.05），而日粮中添加0.15%Trp显著增加了仔猪的平均日采食量(第页< 0.05). 与非激发仔猪相比，腹腔注射敌草枯显著降低了喂食基础日粮的仔猪第21天的体重、从d7到d21的平均日增重、从d7-d21的日均采食量以及从d7-d21的料重比(第页< 0.05). 对照组和0.15%Trp+diquat组在d7至d21期间的平均日增重、平均日采食量和饲料与增重比没有差异(第页>0.05）。此外，对去势仔猪来说，日粮中添加0.15%Trp显著增加了第21天的体重，从d7到d21的平均日增重，以及从d7至d21的日均采食量(第页< 0.05). 然而，添加0.30%Trp的日粮对敌草枯处理仔猪的平均日增重和从d7到d21的料重比没有影响(第页> 0.05) (). 生产性能结果表明，日粮中添加0.15%的Trp可以保护仔猪免受敌草枯引起的生长性能下降的影响。
表4
日粮中补充色氨酸对diquat攻击仔猪生长性能的影响。
| 项目 | 控制 | 敌草枯 | 0.15%色氨酸
+敌草枯 | 0.30%色氨酸
+敌草枯 |
|---|
| 体重（kg） |
| 第0天 | 6.62 ± 0.20 | 6.63 ± 0.21 | 6.62 ± 0.21 | 6.63 ± 0.22 |
| 第7天 | 8.42 ± 0.22 | 8.43±0.20 | 8.66 ± 0.23 | 8.60 ± 0.22 |
| 第21天 | 14.01 ± 0.28一 | 12.11 ± 0.47b条 | 13.80 ± 0.49一 | 12.64 ± 0.41b条 |
| 平均日增重（g） |
| 第0天到第7天 | 256.43 ± 7.10 | 258.22 ± 11.50 | 290.89 ± 5.35 | 281.79 ± 14.90 |
| 第7至21天 | 399.64 ± 8.86一 | 262.50 ± 20.5b条 | 366.79 ± 19.22一 | 288.84 ± 22.36b条 |
| 平均日采食量（g） |
| 第0天到第7天 | 313.42 ± 8.12b条 | 311.75 ± 7.87b条 | 331.97±5.23一 | 320.45 ± 9.50b条 |
| 第7至21天 | 566.37 ± 12.53一 | 462.47±14.90c（c） | 560.30 ± 11.18一 | 500.78 ± 11.70b条 |
| 进料增益比 |
| 第0天到第7天 | 1.23 ± 0.04 | 1.23 ± 0.07 | 1.14 ± 0.02 | 1.16 ± 0.08 |
| 第7至21天 | 1.42 ± 0.04b条 | 1.81±0.10一 | 1.55 ± 0.06ab公司 | 1.78 ± 0.11一 |
3.2. 肠道通透性
在本研究中，通过联合测定血清生物标志物、D-乳酸浓度和DAO活性以及空肠中的TER和FD4移位来评估肠道通透性。敌草枯激发和添加L-色氨酸对血清D-乳酸浓度均无显著影响(第页>0.05）。与非激发仔猪相比，喂基础日粮的敌草枯处理仔猪的血清DAO活性更高(第页< 0.05). 对照组与0.15%Trp+敌草枯组的血清DAO活性无显著差异(第页>0.05）。离体Ussing chamber研究表明，与对照组相比，喂食基础日粮的二喹螯合仔猪在空肠粘膜侧到浆膜侧的TER较低，FD4通量较高(第页< 0.05). 在敌草枯处理的仔猪中，日粮中添加0.15%Trp显著增加了TER，并降低了空肠中FD4从粘膜侧到浆膜侧的流量(第页< 0.05). 此外，喂食添加0.15%Trp的日粮的敌草枯处理仔猪与未受挑战的仔猪具有相似的TER和FD4通量(第页> 0.05) ().
日粮补充色氨酸对敌草枯攻击仔猪肠道通透性的影响。(A类)D-乳酸浓度；(B类)二胺氧化酶活性；(C类)TER，跨上皮电阻；(D类)FD4，4kDa异硫氰酸荧光素葡聚糖在空肠处的流量。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组，仔猪在基础日粮中不注射百草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+敌草枯，仔猪饲喂添加0.15%的日粮并用敌草枯处理。
3.3. 空肠紧密连接蛋白的mRNA丰度和蛋白表达
紧密连接蛋白的mRNA表达(ZO1公司，ZO2公司，OCLN公司，CLDN1型、和CLDN2型)在空肠中可以找到与非激发仔猪相比，饲喂基础日粮的敌草枯处理仔猪的mRNA丰度较低ZO1公司，OCLN公司、和CLDN1型空肠粘膜(第页<0.05），而饲喂添加0.15%Trp的日粮的敌枯攻击仔猪的紧密连接蛋白的mRNA表达水平相似(第页>0.05）。日粮中添加0.15%Trp显著上调ZO1公司，OCLN公司、和CLDN1型在敌草枯处理的仔猪的空肠中(第页< 0.05). 为了检查饮食中补充Trp对紧密连接蛋白mRNA水平的影响是否也发生在翻译水平，测量了ZO1、闭塞素和克劳丁1的蛋白表达，相关结果可在与非激发仔猪相比，喂食基础日粮的仔猪暴露于敌草枯显著降低了空肠中ZO1和闭塞素的蛋白表达(第页< 0.05). 喂食添加0.15%Trp的日粮的非激发仔猪和敌草枯处理仔猪的空肠中ZO1和闭塞素的蛋白质水平没有显著差异(第页>0.05）。在断奶仔猪中，添加0.15%Trp显著上调了空肠中ZO1和闭塞素的蛋白表达(第页< 0.05). 其他参数没有发现显著差异。
日粮补充色氨酸对敌草枯攻击仔猪紧密连接蛋白mRNA表达的影响。(A类)ZO1公司，闭塞带1；(B类)ZO2公司闭塞带2；(C类)OCLN公司，闭塞素；(D类)CLDN1型，第1条；(E类)CLDN2型，克劳丁2。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组仔猪饲喂基础日粮，不注射敌草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+diquat，仔猪饲喂0.15%补充日粮并用diquat处理。
日粮补充色氨酸对敌草枯攻击仔猪紧密连接蛋白表达的影响。(A类)仔猪空肠粘膜中ZO1、clodin、claudin1和GAPDH的代表性印迹；(B类)ZO1、闭塞带1的蛋白表达；(C类)闭塞素蛋白表达；(D类)claudin1蛋白表达。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组仔猪饲喂基础日粮，不注射敌草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+敌草枯，仔猪饲喂添加0.15%的日粮并用敌草枯处理。
3.4. 空肠中抗氧化酶活性和MDA含量
与非激发仔猪相比，注射敌草枯显著降低了基础日粮仔猪空肠粘膜中SOD、GPx和CAT的活性(第页< 0.05). 此外，与对照组的仔猪相比，用百草枯处理的基础日粮喂养的仔猪空肠粘膜中的MDA浓度更高(第页< 0.05). 然而，0.15%Trp+敌草枯组和对照组仔猪空肠粘膜SOD、CAT活性和MDA含量无差异(第页>0.05）。0.15%Trp+敌草枯组仔猪空肠粘膜中GPx活性显著低于对照组仔猪(第页< 0.05). 与基础日粮组相比，添加0.15%Trp的饲粮组仔猪的SOD、GPx和CAT活性增加，空肠粘膜MDA浓度降低(第页< 0.05) ().
日粮补充色氨酸对敌草枯攻击仔猪空肠氧化还原状态的影响。(A类)超氧化物歧化酶活性；(B类)谷胱甘肽过氧化物酶活性；(C类)过氧化氢酶活性；(D类)丙二醛浓度。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组仔猪饲喂基础日粮，不注射敌草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+敌草枯，仔猪饲喂添加0.15%的日粮并用敌草枯处理。
3.5. 氧化还原敏感基因在空肠中的表达
基因表达SOD1标准，HMOX1型，通用处理器X1，TXNRD1型，NRF2级、和KEAP1公司总结如下.敌草枯注射液降低了SOD1标准，HMOX1型，通用处理器X1，TXNRD1型与非激发仔猪相比，喂食基础饲料的仔猪空肠粘膜中的NRF2(第页< 0.05). 然而，在SOD1标准，HMOX1型，通用处理器X1，TXNRD1型0.15%Trp+敌草枯组和对照组仔猪空肠粘膜中的NRF2(第页>0.05）。此外，0.15%Trp+敌草枯组的仔猪表现出较高的mRNA水平SOD1标准，HMOX1型、和通用处理器X1喂食基础日粮的仔猪空肠粘膜中，敌草枯处理的仔猪比(第页< 0.05). 空肠粘膜中HO1和GPx的蛋白表达可以在与非激发仔猪相比，敌草枯激发降低了喂食基础日粮仔猪空肠粘膜中HO1和GPx的蛋白表达(第页< 0.05). 相比之下，喂食添加0.15%Trp的日粮的非激发仔猪和去势仔猪的空肠粘膜中HO1和GPx的蛋白质水平没有差异(第页>0.05）。在敌草枯处理的仔猪中，补充Trp显著上调空肠粘膜中HO1和GPx的蛋白表达(第页< 0.05).
日粮补充色氨酸对敌草枯攻击仔猪氧化还原敏感基因mRNA表达的影响。(A类)SOD1标准，铜/锌超氧化物歧化酶；(B类)HMOX1型血红素加氧酶1；(C类)通用处理器X1谷胱甘肽过氧化物酶；(D类)TXNRD1型硫氧还蛋白还原酶；(E类)NRF2级，核呼吸因子2；(F类)KEAP1公司，海带样ECH相关蛋白1。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组仔猪饲喂基础日粮，不注射敌草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+敌草枯，仔猪饲喂添加0.15%的日粮并用敌草枯处理。
日粮补充色氨酸对敌草枯攻击仔猪抗氧化酶蛋白表达的影响。(A类)仔猪空肠粘膜中HO1、GPx和GAPDH的代表性印迹；(B类)血红素加氧酶1；(C类)谷胱甘肽过氧化物酶。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组，仔猪在基础日粮中不注射百草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+敌草枯，仔猪饲喂添加0.15%的日粮并用敌草枯处理。
3.6. 肠道线粒体ROS生成和ΔΨm
与未受攻击的仔猪相比，在喂食基础日粮的diquat处理的仔猪中，线粒体ROS的产生增加，空肠中的ΔΨm下降(第页< 0.05). 然而，与敌草枯组相比，日粮中添加0.15%Trp显著降低了敌草枯感染仔猪的线粒体ROS生成，并增加了空肠中的ΔΨm(第页< 0.05). 对照组和0.15%Trp+敌草枯组空肠线粒体ROS生成和ΔΨm无差异(第页> 0.05) ().
饮食中补充色氨酸对肠道线粒体活性氧（ROS）生成的影响(A类)和肠线粒体膜电位的变化(B类)用敌草枯攻击小猪。ROS生成和线粒体膜电位以相对于对照组计算的折叠变化表示。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组，仔猪在基础日粮中不注射百草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+敌草枯，仔猪饲喂添加0.15%的日粮并用敌草枯处理。
3.7. 线粒体生物发生相关基因在空肠中的表达
基因表达NRF1级，TFAM公司，PPARGC1A公司，SIRT1型，SSBP1型、和POLRMT公司显示在中.mRNA丰度NRF1级，PPARGC1A公司、和SSBP1型与非激发仔猪相比，饲喂基础日粮的敌草枯处理仔猪的空肠中(第页< 0.05). 然而，在NRF1级，PPARGC1A公司、和SSBP1型在饲喂添加0.15%Trp的饲粮的敌草枯处理仔猪和非激发仔猪的空肠中(第页>0.05）。日粮中添加0.15%Trp显著上调NRF1级，PPARGC1A公司、和SSBP1型敌草枯处理仔猪与敌草枯组仔猪的空肠比较(第页< 0.05). 此外，喂食添加0.15%Trp的日粮的双季铵盐处理仔猪表现出较高的mRNA丰度TFAM公司在空肠中比那些吃基础饮食的人(第页< 0.05). 基因表达没有差异TFAM公司在喂食基础日粮或0.15%Trp补充日粮的经百草枯处理的仔猪与未受攻击的仔猪之间的空肠中(第页> 0.05).
日粮补充色氨酸对敌草枯攻击仔猪线粒体生物发生相关基因mRNA表达和空肠mtDNA含量的影响。(A类)NRF1级，核呼吸因子1；(B类)TFAM公司，转录因子A，线粒体；(C类)PPARGC1A公司过氧化物酶体增殖激活受体γ辅活化因子1α；(D类)SIRT1型，sirtuin 1；(E类)SSBP1型，单链DNA结合蛋白1；(F类)POLRMT公司，DNA定向RNA聚合酶，线粒体；(G公司)线粒体DNA。数据为平均值±标准误差；n个=每组8人。在同一行中共享不同上标的平均值差异显著(第页< 0.05). 对照组仔猪饲喂基础日粮，不注射敌草枯；敌草快，仔猪饲喂基础日粮并用敌草快进行攻击；0.15%Trp+敌草枯，仔猪饲喂添加0.15%的日粮并用敌草枯处理。
3.8. 空肠mtDNA含量
与盐处理仔猪相比，喂基础日粮的敌草枯处理仔猪空肠中的线粒体DNA含量降低(第页< 0.05). 然而，喂食添加0.15%色氨酸的日粮的敌草枯处理仔猪和非激发仔猪的线粒体DNA含量没有差异(第页> 0.05) ().
4.讨论
Trp对控制猪饲料摄入量的重要性已得到充分证明，据报道，随着日粮色氨酸水平在0.12%至0.26%之间的增加，断奶仔猪的日摄入量呈线性增加，这与胃肠道ghrelin分泌增加有关[30]. 最近的一项研究表明，基础日粮中添加0.21%的Trp水平和0.2%或0.4%的Trp可以提高断奶仔猪的平均日采食量和平均日增重，但添加0.2%Trp的日粮比添加0.4%Trp更能促进生长[31]. 一直以来，在本研究中，在基础日粮中添加0.15%的Trp而不是0.30%的Trp，其中Trp水平为0.22%，会增加断奶仔猪在敌草枯攻击前的采食量，这可能与增加ghrelin分泌和减少仔猪的攻击性行为有关[30]. 值得注意的是，国家研究委员会建议体重7-11公斤的猪的色氨酸需要量为0.22%[21]. 可以得出结论，在正常条件下，将适当剂量的Trp添加到推荐水平有助于断奶仔猪摄入饲料。研究表明，敌草枯挑战会导致平均日增重和平均日采食量下降[12，13]日粮中添加0.12%Trp可防止氧化应激导致的生长性能下降[12]. 在本研究中，日粮中添加0.15%的Trp（而不是0.30%的Trp）可以保护仔猪免受敌草枯引起的生长性能下降的影响，这表明敌草枯处理仔猪添加Trp的合适剂量为0.15%。先前的研究表明，断奶仔猪日粮Trp与Lys的最佳比值为0.26[32]. 在本研究中，添加0.15%Trp的日粮中Trp与Lys的比值为0.27，这与荟萃分析相似，荟萃分析表明，以平均日增重、平均日采食量和饲料增重比为响应标准，7至30 kg猪的Trp与Lys的比值要求分别为0.22、0.22和0.20[33]. 此外，高日粮Trp/Lys比或敌草枯挑战已被证明会降低氮的利用率，并降低其他氨基酸的肠道吸收和全身代谢，导致断奶仔猪的生长性能较差[12，34]. 本研究结果表明，添加0.15%Trp的日粮比添加0.30%Trp的饲粮能改善氧化应激仔猪的生长性能，这可能与添加0.15%Trp的日粮中更合适的Trp/Lys比率有关。
完整的肠道屏障在防止病原体和有害物质通过肠道进入体内方面起着关键作用，因此对宿主的健康至关重要[8，9]. 在本研究中，敌草枯处理的仔猪比未激发的仔猪表现出更高的血清DAO活性。DAO是一种细胞内酶，主要在动物的肠上皮细胞中合成，当肠屏障受到损伤时释放到血液中[35]. 因此，将血液DAO活性作为循环生物标志物来评估肠屏障功能[36]. 此外，还通过Ussing腔技术测量肠道屏障功能，以检测FD4的TER和细胞旁流量。TER和FD4主要用于研究通过细胞旁途径的渗透，可以反映紧密连接的开放[37，38]. 在应激、断奶应激或氧化应激条件下，仔猪的肠屏障功能受损，表现为TER降低和FD4流量增加[10，13]. 在目前的研究中，敌草枯治疗降低了空肠TER，增加了FD4的空肠流量。这项研究的数据，包括间接和直接的证据，都表明施用百草枯损害了仔猪的肠道屏障功能。作为一种营养必需氨基酸，色氨酸已被证明可以调节紧密连接蛋白的表达，促进肠蛋白合成，增强猪的肠粘膜屏障[39]. 与本研究一致，日粮中添加0.15%Trp可保护仔猪免受敌草枯诱导的肠粘膜屏障功能受损的影响，如血清DAO活性降低、空肠TER升高和空肠FD4流量降低。肠屏障由上皮细胞组成，这些上皮细胞通过紧密连接蛋白连接，如ZO、克劳丁家族和闭塞素，调节上皮细胞之间的选择性通透性[40]. 紧密连接蛋白的表达对维持肠上皮屏障很重要[41]. 先前的研究表明，氧化应激下调紧密连接蛋白的表达[13，37]. 一直以来，在这项研究中，敌草枯激发降低了ZO1公司，OCLN公司、和CLDN1型以及ZO1和闭塞素的蛋白表达。ZO家族是紧密连接蛋白的细胞质斑块的一部分，而闭塞素是上皮屏障中发现的紧密连接完整性的独特标记；它的存在与否可以反映肠上皮的通透性[24]. 在diquat处理的仔猪中，较高的空肠紧密连接通透性可能归因于ZO1和occludin的较低表达，先前的一项研究证明OCLN公司导致宫内生长受限（IUGR）仔猪肠道通透性增加[42]. 与肠道屏障功能的改善相一致，添加0.15%Trp的饮食可保留敌草枯治疗引起的空肠紧密连接蛋白丰度下降。一项涉及肠猪上皮细胞的体外研究表明，Trp可以增强紧密连接蛋白的表达[39]. 此外，日粮中添加Trp可以防止受感染仔猪小肠紧密连接蛋白mRNA表达减少大肠杆菌[43]. 因此，日粮补充色氨酸可以减轻敌草枯氧化应激引起的肠屏障损伤。先前的研究表明，微生物衍生的色氨酸代谢物，如吲哚，是芳香烃受体（AhR）的配体，在肠道内稳态中起着重要作用，并与代谢综合征和炎症性肠病的发病机制有关[31，44]. 研究表明，日粮中添加Trp可以通过富集仔猪小肠中的Trp代谢细菌来提高AhR配体的生成，从而有益于影响粘膜的完整性[5，31]. 鉴于Trp代谢细菌的丰度因氧化应激而减少，可以推测，日粮中添加Trp可能通过恢复微生物群的组成来增强氧化应激仔猪的肠道完整性。然而，这一假设应该在未来的研究中得到证实。
一些研究表明，氧化剂可以下调紧密连接蛋白对屏障紧密性的调节作用，而抗氧化剂可以增强紧密连接蛋白的屏障紧密性[45，46，47]. 膳食中补充色氨酸已被证明可以增加色氨酸代谢物的生成，并提高色氨酸代谢酶的活性，如具有抗氧化活性的色氨酸2,3-双加氧酶[12]. 为了探讨日粮中添加Trp对敌草枯处理仔猪肠屏障功能的有益影响是否与氧化还原状态的改善有关，测定了抗氧化酶活性、MDA含量以及氧化还原敏感基因在空肠粘膜中的表达。在本研究中，敌草枯攻击降低了基础日粮喂养仔猪空肠中SOD和GPx的活性，并增加了MDA的浓度，这与以前的研究一致[12，13，37]. SOD是位于细胞膜或胞浆中的可溶性Cu/Zn SOD，已被证明能将超氧物转化为过氧化氢（H2哦2). GPx是一个酶家族，通过清除活性氧来提供对氧化应激的保护机制[48]. 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性的下降表明，过氧化可能发生在敌草枯处理的仔猪空肠中。此外，脂质氧化的次级产物MDA被认为是监测脂质过氧化的标志物[49]. 空肠中MDA含量的增加表明，敌草枯处理的仔猪可能发生严重的脂质过氧化。与之前对IUGR仔猪的研究一致[42]，的SOD1标准，HMOX1型，通用处理器X1，TXRND1号、和NRF2级敌草枯处理的仔猪表达下调。NRF2级据报道可以调节内源性抗氧化酶的水平以对抗氧化应激。已经证明HMOX1型，一种重要的抗氧化酶，由NRF2级通过调节活性氧水平，对减轻肠上皮细胞的氧化应激至关重要[49]. 在本研究中，HO1的蛋白表达在双季铵盐处理的仔猪空肠中下调，进一步证明了氧化应激情况下抗氧化能力受损。TXNRD1型是一种使硫氧还蛋白保持还原状态的酶，在此过程中产生的活性氧被清除[50]. TXNRD1的低表达也可能反映了二喹啉酮感染仔猪的抗氧化能力受到干扰。这些结果表明，敌草枯处理导致了仔猪抗氧化系统的破坏和氧化还原状态的失衡。在本研究中，膳食中添加Trp可增加SOD、GPx和CAT的活性SOD1标准，HMOX1型、和通用处理器X1以及HO1蛋白的表达，同时降低了敌草枯处理仔猪空肠中MDA的含量。在之前的一项研究中，发现Trp可以增加血清和肝脏中的抗氧化防御酶活性，并减轻双喹诱导的氧化应激[12]从而证实了本研究的结果。因此，日粮中添加适量的Trp可以有效改善被敌草枯攻击的仔猪空肠中的氧化应激。研究表明，一些色氨酸代谢物，如5-羟基色氨酸和3-羟基邻氨基苯甲酸，具有抗氧化能力[51]. 此外，最近的研究表明，肠道微生物群可能参与色氨酸对宿主肠道功能的有益影响[5，31]. 因此，在未来的研究中，确定Trp改善被敌草枯攻击的仔猪氧化还原状态的潜在机制，并研究Trp代谢物和肠道微生物群是否参与这一过程，将是非常有意义的。
研究表明，线粒体对氧化损伤很敏感，因为它们缺乏保护性组蛋白，氧化应激已被证明会导致线粒体DNA损伤[52]. 在本研究中，敌草枯激发降低了仔猪空肠中mtDNA的含量，这与之前的研究一致[37]. 一些研究报告表明，线粒体线粒体DNA损伤与线粒体ROS生成增加和线粒体ΔΨm降低有关。我们的数据表明，敌草枯处理的仔猪空肠线粒体ROS产生增加，这与之前的研究一致，研究表明，在氧化应激条件下，心脏或肠线粒体中的ROS水平增加[13，18，53]. 一项体外研究证实，敌草枯诱导的抗氧化酶系统破坏导致活性氧降解不足，导致肠上皮细胞中活性氧过度积累[54]. 此外，活性氧的过度生产已被证明触发内膜阴离子通道的开放，导致线粒体膜去极化，其特征是ΔΨm降低[18]. 人们认为氧化还原内稳态受损与线粒体DNA损伤和线粒体ROS过度产生有关。在本研究中，日粮中添加Trp降低了线粒体ROS的生成，增加了线粒体ΔΨm，从而恢复了被敌草枯攻击的仔猪空肠中mtDNA的含量。根据Trp的抗氧化特性，线粒体中ROS生成量较低的可能原因可能是饲粮中添加Trp增强了敌草枯攻击仔猪线粒体ROS的清除。先前的研究表明，线粒体DNA含量的改变与线粒体生物发生相关转录因子表达的变化一致[26]. 此外，研究表明，肠道线粒体ROS生成和ΔΨm的改变是由异常的线粒体生物生成过程引起的[13]. NRF1和PPARGC1A是线粒体生物发生的主要调节因子，已被证明在暴露于氧化应激的仔猪空肠中下调[13]. 另一项先前的研究表明，当IUGR仔猪暴露于严重的氧化应激时NRF1级和PPARGC1A公司在空肠里[26]. 与之前的研究一致，我们的数据显示，敌草枯挑战下调NRF1级和PPARGC1A公司在空肠里。此外，SSBP1型对mtDNA复制很重要，在用敌草枯处理的仔猪的空肠中显示下调[13，26]; 我们的研究显示了类似的结果。研究表明，维持肠道屏障功能需要正常的线粒体生物发生和功能[19]. 因此，可以推测地喹诱导的肠屏障损伤可能归因于线粒体功能障碍。我们假设，饮食色氨酸对敌草枯引起的肠屏障损伤的保护作用是通过改善线粒体功能发挥的。在本研究中，日粮中添加Trp可防止仔猪受到敌草枯诱导的线粒体DNA损伤、活性氧的过度生成，并损害线粒体的生物生成过程。这些发现表明，膳食中补充Trp可以增强线粒体的生物发生，从而减轻氧化应激对肠道屏障的损伤。
总之，饮食中补充适量的Trp可以防止氧化应激导致的生长性能和肠道屏障功能受损。本研究结果表明，日粮中添加Trp可通过提高抗氧化酶的活性和mRNA或蛋白表达，改善线粒体DNA损伤，上调线粒体生物生成相关转录因子，从而改善敌草枯处理仔猪的肠屏障功能。
5.结论
敌草枯处理导致仔猪肠道通透性增加，氧化还原平衡受损。日粮中添加0.15%的Trp可改善生长性能，增强肠道完整性，恢复氧化还原平衡，并改善敌草枯处理仔猪的线粒体功能。
作者贡献
概念化，H.Y。；数据管理，Y.Z.和Y.L。；资金收购，H.Y.和H.Z。；方法，Y.Z.和Y.L。；项目管理，H.Y。；监督，H.Y。；验证，J.L。；书面原稿，J.L。；写作审查和编辑，H.Z。
基金
这项工作得到了国家重点研发计划（2016YFD0500505）和国家自然科学基金（31802069）的支持。
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