AUF1介导的命运决定检查点mRNA的阶段特异性降解控制肌肉发育和再生

AUF1表达被CTCF干细胞因子激活并促进成肌细胞分化。

AUF1仅在卫星细胞活化并分化为成肌细胞时表达(6). 因此，我们对已知参与肌发生的主要AUBP（HuR、TTP、AUF1）的表达进行了表征(10,14——16). C2C12成肌细胞在高血清下增殖，但在低血清下诱导分化，形成多核肌管。在AUBP中，仅Auf1系列在C2C12细胞分化过程中，mRNA和蛋白质显著增加(图2A类和SI附录，图S2A类). 据报道，HuR在肌发生中对抗AUF1介导的mRNA衰减，稳定MyoD公司,第21页、和肌生成素终末肌管分化过程中的mRNA(15). 我们发现此时AUF1表达减少，与这些数据一致。因此，我们研究了AUF1表达增加与卫星细胞/成肌细胞分化的机制。

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图2。

AUF1的表达对成肌细胞分化和肌管形成至关重要。(A类)qRT-PCR检测96小时分化过程中AUBP mRNA的表达(n个=3），归一化为不变量GAPDH公司mRNA。(B类)AUBP蛋白在分化过程中的表达A类,n个= 4. 免疫印迹下的数字：扭转1倍增加，正常化为WT细胞。(C类)C2C12成肌细胞分化期间CTCF、AUF1、MyoD和β-微管蛋白控制的免疫印迹。慢病毒介导的shRNA沉默C2C12细胞中的CTCF。免疫印迹下的数字对应于AUF1相对于β-微管蛋白水平的倍数变化，标准化为0-h Nsi时间点。n个= 4. (D类)在HEK 293细胞中增加CTCF cDNA表达质粒转染的CTCF和AUF1免疫印迹。使用pMy-CTCF（Addgene）过度表达CTCF，n个= 3. CTCF染色质IP（ChIP）分析使用Auf1系列诱导分化后48小时C2C12细胞中的启动子。与抗兔IgG IP对照物相关的抗CTCF抗体片段ChIP分析中的DNA富集，归一化为qRT-PCR测量的内含子信号。n个= 3. *P（P）<0.05 byt吨测试。H19型具有三个CTCF结合位点的启动子是阳性对照。(E类)WT和AUF1 KO C2C12细胞或用siAUF1转染的WT C2C12细胞中的Myogenin（绿色）和MyoD（红色）的代表性IF染色。诱导分化后96小时拍摄的图像。注：WT样品中的浅绿色斑点是非特异性的。白色圆圈表示肌管形成的例子。(F类)WT和AUF1 KO成肌细胞诱导分化后96小时MHC的代表性IF染色*P（P）<0.05 byt吨测试，n个= 5. (G公司)培养的AUF1 WT和KO C2C12成肌细胞分化后Myf5（紫色）和Ki67（红色）的代表性IF染色。细胞核DAPI染色。（比例尺：200μm）

进行了基于siRNA的功能丧失筛选，以确定激活AUF1表达的转录因子。根据AUF1/HNRNPD转录调控区中潜在的一致性靶序列生成了200个候选转录因子列表，这些靶序列使用我们的RNA-sequencing（RNA-seq）数据与活化卫星细胞中表达的靶序列进行筛选(6). 在分化C2C12成肌细胞的过程中鉴定并沉默候选mRNA，以测试其对AUF1表达的影响(SI附录，图S2B类). 随着BCL6、CTCF和FOXJ2的沉默，AUF1表达显著降低，所有这些都调节成肌细胞分化(17——19) (SI附录，图S2C类). 我们专注于CTCF，因为对Auf1系列启动子区域显示一个明确的共识结合位点(编码项目.org)与其他因素相比(SI附录，图S2D类)因为CTCF是干细胞基因表达的主调节器(20).

C2C12成肌细胞中CTCF沉默强烈降低分化过程中AUF1和MyoD的表达(图2C类)而HEK 293细胞中CTCF的异位过度表达促进了AUF1的表达(图2D类). 沉默C2C12成肌细胞中的AUF1不会影响CTCF的表达(SI附录，图S2E类)，表明AUF1是CTCF的下游靶点，但CTCF表达不需要AUF1。CTCF绑定了Auf1系列免疫沉淀-qPCR分析显示的近端启动子区域与阳性对照（Igf2/hH19启动子）相比，后者包含三个CTCF结合位点(21)和一个阴性对照内含子区(SI附录，图S2F类). 此外Auf1系列使用荧光素酶报告子，启动子足以实现CTCF转录反应性(SI附录，图S2G公司). 因此，CTCF对于Auf1系列转录激活。

CTCF通过招募MyoD激活肌肉特异性基因来调节成肌细胞分化(18,22). 因此，我们询问CTCF激活是否通过激活AUF1表达来控制成肌细胞分化。诱导分化96小时后，对CTCF诱导的细胞进行肌生成素染色。免疫荧光（IF）分析表明，与对照细胞相比，CTCF样细胞中成肌细胞向肌管的分化要少得多(SI附录，图S3A类). 因此，我们测试了在CTCF沉默的情况下，恢复AUF1表达是否可以挽救肌肉发生。通过逆转录病毒感染将FLAG标记的AUF1 p42和p45 cDNA导入CTCF诱导的C2C12细胞。随着AUF1的异位表达，肌球蛋白和MHC（终末分化肌管的标记物）的染色表明，即使在没有CTCF表达的情况下，分化肌管也能得到很强的恢复(SI附录，图S3A类). 综上所述，我们的数据表明AUF1是一个关键的CTCF靶基因，位于肌发生中CTCF的下游。

CRISPR Cas 9缺失Auf1系列与WT C2C12细胞相比，基因导致肌管减少90%，成肌细胞无法分化，类似于Auf1系列沉默(图2E类和SI附录，图S3B类和C类). 因此，AUF1表达缺失的肌肉发生减弱不是shRNA沉默的非靶向效应。AUF1 KO成肌细胞表达较高水平的MyoD(图2E类)只有非常弱表达的MHC，一种终末分化肌管的标志物(图2F类和SI附录，图S3D类和E类)和Myf5，并且高度增殖，Ki67上调显示(图2G公司). 通过异位表达p40、p42或p45 AUF1的cDNA，可以挽救AUF1 KO C2C12细胞的分化阻滞，从而促进肌管的正常分化和MHC的再表达(SI附录，图S3E类和F类). 因此，AUF1表达的缺失是卫星细胞和成肌细胞过度增殖表型及其分化和编程肌生成能力不足的原因。

AUF1通过破坏Twist1 ARE-mRNA的稳定性启动成肌细胞分化。

WT和AUF1 KO卫星细胞以及AUF1克隆的C2C12小鼠成肌细胞的RNA-seq数据(6)用于鉴定ARE-mRNA，这些ARE-mRNAs是AUF1的靶点，由于在缺乏AUF1表达的情况下增加mRNA稳定性，因此可能通过过度表达参与过度增殖表型。我们确定了几个符合这一特征的关键mRNA：扭转1,英国标准普尔4、和Sox8指数TWIST1是一种转录因子，通过阻断关键成肌因子MyoD和MEF2的分化诱导功能来抑制肌生成，并通过激活成肌细胞的表达来维持成肌细胞增殖周期D1基因(23). BMP4（骨形态发生蛋白4）通过抑制某些肌原基因防止卫星细胞的肌原性分化(24). SOX8是一种转录因子，也抑制肌生成并阻断MyoD和Myogenin的表达(24). 在这些基因中，我们都没有发现英国标准普尔4也不是Sox8指数siAUF1处理的C2C12细胞中mRNA水平高度增加(SI附录，图S4A类和B类)表明它们不是AUF1的直接目标。然而，TWIST1位于肌源性分化途径中这些因子的上游，与WT相比，其mRNA在AUF1 KO C2C12细胞中增加了约15倍，TWIST 1蛋白也是如此(图3A类和B类).扭转1与WT动物相比，AUF1 KO小鼠胫骨前肌（TA）的mRNA和蛋白质水平也显著增加(SI附录，图S4C类和D类).

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图3。

AUF1靶向衰变扭转1mRNA部分恢复肌生成。TWIST1 mRNA的相对表达(A类)WT C2C12成肌细胞和AUF1 KO C2C11成肌细胞的蛋白质水平(B类),n个= 3. 印迹下的数字是指AUF1标准化为GAPDH蛋白的倍数增加**P（P）<0.01，未成对的曼·惠特尼U型测试。(C类)扭转1在WT C2C12细胞诱导分化48小时后，与成肌细胞内源性AUF1蛋白相关的mRNA。每个免疫印迹具有代表性的AUF1 IP。n个= 5. *P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001由未成对的Mann–Whitney提供U型测试。(D类)扭转1非分化培养基中WT C2C12细胞（实线）或AUF1 KO C2C11细胞（虚线）的mRNA衰减率。放线菌素D（ActD）抑制转录，采集的样本如图所示**P（P）<0.01，未成对的曼·惠特尼U型测试。n个=3，显示SEM。(E类)转染非沉默对照（Nsi）或扭转1siRNA。GAPDH，装载控制。n个= 3. (F类)转染非沉默对照（siNsi）或扭转1诱导分化后96小时的siRNA。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（比例尺：200μm）白色椭圆形表示肌管形成。(G公司)转染非沉默（Nsi）siRNA或siRNA的WT和AUF1 KO C2C12细胞的典型相差显微镜图像扭转1RNA。(H（H）)融合指数和成肌细胞数由五个独立实验计算得出。融合指数计算为多核肌管内的细胞核百分比，与转染Nsi或Nsi的AUF1 KO成肌细胞的细胞核总数相比扭转1siRNA。成肌细胞数计算为每个场分离成肌细胞的数量，每个实验中至少对五个场进行评分，平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）<0.01，未成对的曼·惠特尼U型测试。(我)转染Nsi或Nsi的AUF1 KO C2C12细胞中Cyclin D1、MHC和Myogenin的代表性免疫印迹扭转1siRNA。GAPDH，装载控制。(J–L)转染Nsi或Twist1 siRNA的AUF1 KO C2C12细胞中肌生成素、MHC和细胞周期蛋白D1的定量，n个=3，±SEM*P（P）<0.05，未成婚的曼·惠特尼U型测试。

老鼠扭转1mRNA具有两个3′UTR ARE基序(10)可能成为潜在的AUF1结合位点。因此，我们在分化后48小时从未分化的WT C2C12细胞中免疫沉淀AUF1，然后用qRT-PCR定量扭转1mRNA。AUF1显示与扭转1分化C2C12细胞的mRNA(图3C类)与此时增加的表达水平一致(图2B类)以及可能的磷酸化介导的结合活化(25).扭转1用放线菌素D处理WT和AUF1 KO C2C12细胞以阻断新转录，测定其mRNA半衰期(图3D类). 如果没有AUF1，扭转1mRNA稳定性增加了～5倍，与mRNA和蛋白质水平的增加一致。

沉默扭转1和周期D1mRNAs仅部分恢复AUF1 KO成肌细胞的肌源性分化。

TWIST1通过阻断肌源性调节因子如MyoD和MEF2的功能来抑制肌生成(26). AUF1 KO成肌细胞转移到分化培养基后继续增殖，未能形成成熟的肌纤维，TWIST1蛋白显著过度表达(SI附录，图S4E类). 然而，随着AUF1 KO成肌细胞中TWIST1的沉默，成熟的肌管开始形成(图3E类——G公司)成肌细胞融合指数增加了7倍，但仍有大量未融合成肌细胞(图3H（H）). 与对照组AUF1 KO成肌细胞相比，TWIST1沉默的AUF1 KO-成肌细胞也表达肌生成素和MHC水平增加，细胞周期蛋白D1蛋白水平降低(图3我——L（左）). 总之，在AUF1 KO成肌细胞中沉默TWIST1部分挽救了分化表型，表明虽然AUF1通过破坏稳定来促进成肌细胞分化扭转1mRNA，必须有其他下游ARE-mRNA靶点。

细胞周期蛋白D1是TWIST1的下游靶点，可促进细胞增殖(27). 细胞周期蛋白D1编程卫星细胞和成肌细胞的短暂增殖，这是自我更新所必需的，但必须下调以允许退出细胞周期，从而实现成肌细胞分化(28). 我们确定了AUF1是否需要破坏稳定性周期D1AUF1衰变诱导分化后阻止成肌细胞增殖的mRNA和蛋白水平扭转1mRNA。抑制细胞周期蛋白D1的表达可以使成肌细胞退出细胞周期并开始分化。AUF1 KO成肌细胞的细胞周期蛋白D1蛋白水平比WT成肌纤维细胞高10至15倍(SI附录，图S4F类和G公司). 此外，周期D1与WT相比，AUF1 KO C2C12细胞的mRNA稳定性增加了约3.5倍(SI附录，图S4H（H）). 然而，同时静音扭转1和周期D1mRNA增加了肌源性分化，但仍仅部分恢复(SI附录，图S4我和J)与沉默相比，肌管分化和成熟度略有增加扭转1独自前往扭转1具有周期D1这些数据表明，需要AUF1来破坏两者的稳定性扭转1和周期D1mRNAs能够使成肌细胞分化，但沉默两者仍然不足以使肌细胞完全成熟。

肌纤维制备。

在4个月龄时从WT和KO小鼠中获取肌纤维。简言之，从后肢解剖趾长伸肌，并在37°C下用1.5 U/mL I型胶原酶（沃辛顿）消化1.5小时。用巴斯德吸管通过反复冲洗释放单个纤维。肌纤维在37°C、5%CO、添加15%马血清（Gibco）、1%青霉素-链霉素（Life Technologies）和2.5μg/μL FGF（Sigma）的F12培养基（Corning）中培养72小时₂组织培养箱(6).

大规模准备。

从4个月龄的WT和AUF1 KO小鼠中获取整个后肢骨骼肌，在37°C水浴中用1.5 U/mL I型胶原酶（沃辛顿）消化1小时。将大量制剂在37°C、5%CO、添加15%马血清（Gibco）、1%青霉素-链霉素（Life Technologies）和2.5μg/μL FGF（Sigma）的F12培养基（Corning）中培养10 d₂组织培养箱。用编码一种AUF1亚型（p37、p40、p42或p45）的慢病毒在optiMEM中转导肌纤维卫星细胞复合体72小时。如图所示，对每个基因型的3至5只小鼠进行研究。

氯化钡₂后肢受伤。

向3个月龄的雄性和雌性小鼠注射50μL过滤过的1.2%BaCl₂将盐水注入左TA肌肉。作为对照，右TA肌肉未受损伤。注射后15天处死小鼠，并将TA肌肉冷冻在OCT中（Tissue-Tek）。对每个基因型的三只小鼠进行了研究。

这项工作得到了NIH拨款1R01 AR074430-01和国家翻译科学促进中心拨款UL1 TR00038的支持，以获得核心服务支持。