从神经传递到胃肠运动和激素释放,血清素能信号对一系列生物过程至关重要。尽管5-HT的囊泡包装对其许多功能至关重要,但少数研究表明,在单胺产生细胞的细胞核和胞体中存在囊外单胺7,8虽然囊外5-HT的存在被认为在活动依赖性体细胞释放期间很重要7目前尚不清楚它是否会在核内发挥其他作用。
研究表明,5-HT通过TGM2的转酰胺作用与细胞溶质蛋白形成共价键,这种修饰被认为可以改变单胺基底物的信号传递特性9–11因此,我们试图研究核蛋白是否可以进行类似的修饰。考虑到TGM2可能与组蛋白相互作用甚至交联在体外12–14,我们首先研究组蛋白是否可以作为血清酰化的内源性底物。我们采用了生物正交代谢标记方法15基于可输送至活细胞的丙炔化血清素(5-PT)(-)然后对5-羟色胺化底物进行蛋白质标记和免疫沉淀(IP)(,左)。蛋白质印迹显示H3,但H4、H2A或H2B不是5-羟色胺酰化的假定内源性底物(、右侧和-).
内源性5-羟色胺酰化H3谷氨酰胺5的鉴定。a、,HeLa核提取物中5-PT修饰组蛋白的生物正交标记。H3结果在≥3个独立实验中得到证实。b、,组蛋白TGM2单胺基化(MDC)测定与。非组蛋白底物-/+TGM2被胱胺(4 mM)抑制或供体与过量5-HT(500μM)竞争。H3结果在≥3个独立实验中得到证实。c中,未经修饰的TGM2血清酰化试验与。H3K4me3核小体(n个=3/MN型,双尾学生t检验;t吨4=0.7309,p=0.50)。H4作为装载控制装置提供。日期:,内源性MS/MS光谱的镜像图表示(以m/z对齐,并在前体离子两侧放大2X)与。重合成(即,在N-末端标记的D5导致b条+仅片段离子)H3K4me3Q5ser肽。在≥3个独立实验(RN46A-B14细胞预处理-与。分化后和小鼠脑内)。e、,H3K4me3Q5ser表达的多谱比较(n个=1). H3作为装载控制装置提供。代表性分析f、,外周器官/血液(PBMC)和克,小鼠大脑(海马、前额叶皮层、腹被盖区、中缝背核、伏隔核、尾状壳核、小脑)细胞提取物中K4me3Q5ser的存在(n个=3–4/组织或脑区;看见补充数据表1用于量化)。H3作为装载控制装置提供。数据表示为平均值±SEM。
评估TGM2是否是一种普遍表达且功能多样的蛋白质16()是人类细胞中H3 5-羟色胺化的关键,我们在存在或不存在转谷氨酰胺酶活性抑制剂盐酸胱胺的情况下进行基于生物正交标记的IP。用胱胺治疗几乎消除了所有H3 5-羟色胺信号(). 虽然TGM2可能是H3 5-羟色胺酰化所必需的,但存在许多可能影响标记沉积的转谷氨酰胺酶。因此,我们检查TGM2是否足以催化H3 5-羟化。我们采用了另一种人类组织培养系统HEK293T细胞,与HeLa细胞不同,该细胞不表达TGM2(). 采用类似基因拯救的方法,我们证实在这些细胞中外源性表达活性核TGM2足以促进标记的沉积().
为了评估H3是否是5-羟色胺酰化的直接底物,我们进行了重组TGM2酶分析在体外组蛋白和非组蛋白底物(例如纤维蛋白原,一种以前被证明是5-羟色胺化的蛋白质17). 在存在或不存在胱胺或过量5-HT的情况下,使用荧光单胺类似物单丹酰卡德韦(MDC)进行单胺化分析。虽然纤维蛋白原和H3均显示MDC的TGM2依赖性转酰胺作用,但应用胱胺和与5-HT的供体竞争减弱了MDC信号,H4未观察到信号(). 随后进行了基于放射性的血清甲酰化分析,结果一致().
为了确定H3上5-羟色胺酰化的位置,我们接下来进行了靶向液相色谱-质谱(LC-MS/MS)分析,如下所示在体外使用5-HT进行TGM2分析。肽MS/MS分析()显示谷氨酰胺5是该标记的反应性氨基酸底物。与这一分配一致,谷氨酰胺5突变为丙氨酸(H3Q5A)导致TGM2的转酰胺活性丧失().
鉴于Q5ser与赖氨酸4非常接近,赖氨酸是一种在三甲基化时为转录起始提供关键标志的残基,我们研究了K4me3对TGM2介导的单胺基化的潜在影响在体外.未修饰的或H3K4me3核小体(-)进行TGM2/5-HT分析。使用针对标记的抗体进行免疫检测(见下文),我们发现TGM2和H3K4me3底物均为未修饰的单胺基(和). 同样,Q5ser的存在对MLL1(H3K4甲基转移酶)修饰核小体的能力没有影响在体外().
更好地理解H3 5-羟色胺酰化的功能作用体内,我们提出并验证了单(H3Q5ser)和双(H3K4me3Q5user)修饰特异性抗体(-). 使用这些抗体在5-羟色胺能细胞系(RN46A-B14细胞)和成年小鼠大脑(中缝背核,DRN)中对IP’d物质进行LC-MS/MS分析,明确证实哺乳动物细胞/组织中存在这些标记(和-). 虽然两种PTM都存在于培养物中,但只鉴定出了组合修饰体内大脑中(以及从果蝇到人类的各种5-HT产生生物体中)). 因此,我们选择关注H3K4me3Q5ser,并开始调查其在哺乳动物组织中的分布。我们确定了一种普遍存在的表达模式,即标记在产生5-HT的器官(如大脑和结肠)中富集,并在一些非性欲器官中显示更有限的信号。在心脏、循环血(即外周血单个核细胞、PBMC)和睾丸中也观察到强大的信号(). 与大脑中最初的预期相反,H3K4me3Q5ser信号并没有分离到产生5-HT的区域(例如DRN),而是广泛分布在各个结构上(); 看见补充数据表1用于量化。即使在DRN中,也定性地发现该标记并非针对5-羟色胺能神经元,而是在非色情能神经元和非神经元细胞中显示额外信号(-). 这种表达在不产生血清素的动物中被消除(-).
为了将我们的发现扩展到人类5-羟色胺能神经元分化模型,我们检测了H3K4me3Q5ser在人类多能干细胞(hPSC)衍生的5-HT神经元分化前后的表达18(请参见-用于蜂窝验证)。我们发现分化导致H3K4me3Q5ser水平显著增加,同时在H3K4me3中观察到伴随的变化(和). 为了评估血清素能分化的全基因组影响,我们使用我们的双PTM抗体进行了ChIP-seq。在hPSCs中,峰召唤显示标记的富集可以忽略不计,但H3K4me3Q5ser的总峰数随着分化而显著增加;5-HT神经元中标记的基因组分布模式显示出对启动子的强烈偏好(和补充数据表2-三). 为了研究在分化过程中显示H3K4me3Q5ser差异调节的精确基因组位点,diffReps19鉴定了12086个富集度改变的蛋白质编码基因。这些变化中的绝大多数被发现是基因启动子内发生的事件增加(和补充数据表4)例如ELAVL3与NANOG,一种与未分化干细胞自我更新相关的转录因子(). 进一步评估(Enrichr:Kegg 2016路径分析)20,21显示H3K4me3Q5ser富集改变的基因中,有个与神经元分化和发育相关的通路有显著关联(补充数据表5). 为了了解H3K4me3Q5ser在基因表达调控中的潜在作用,我们在5-HT神经元中使用了RNA-seq与。hPSCs和Fisher的精确测试将含有差异H3K4me3Q5ser位点的基因与差异表达的基因进行了比较。在这样做的过程中,我们确定了标记的富集和表达改变之间的相关性,特别是与那些显示丰度增加的基因相比(和补充数据表6). 对这些重叠蛋白编码基因的Kegg分析确定了与“轴突引导”和“5-羟色胺能突触”等相关的显著丰富的通路(补充数据表5).
H3K4me3Q5ser对人类5-羟色胺能神经元分化有反应。a、,Brightfield和b、,免疫荧光图像(以第1行为代表)验证5-HT+/TPH2+神经元与hPSC的分化c中,所有四条检测线的效率约为72%(5-HT+/MAP2+)。比例尺等于20μm。日期:,5-HT神经元H3K4me3和H3K4me3Q5ser表达的定量WB分析与。hPSC(双尾学生t检验,n个=4/组;K4me3-吨6=6.134,***p=0.0009,K4me3Q5ser-t6=9.513,****p<0.0001,K4me3Q5ser与。K4me3神经元-t6=3.755,**p=0.0095)。H3被用作加载控制。e、,基于MACSv2.1.1的H3K4me3Q5ser ChIP-seq数据分化前和分化后峰值调用(FDR<0.05,FC>1.2,在调整多次比较后应用截止值-n个=4行/前-与。后分化;归一化为各自的输入)。f、,H3K4me3Q5ser差异富集预处理的diffReps分析-与。差异化后(FDR<0.05,FC>1.2,在调整多重比较后应用的截止值-n个=4行/前-与。分化后)。饼图显示标记比较启动子基因差异富集事件的分布与。基因体区域。克,具有代表性的基因组浏览器轨迹ELAVL3与NANOGH3K4me3Q5ser基因座(与。hPSC中的DNA输入与。5-羟色胺神经元(n个=4行/前-与。分化后)。Δ表示H3K4me3Q5ser差异富集的统计显著位置。小时,显示差异H3K4me3Q5ser富集的重叠基因的比值比分析(FDR<0.05,FC>2.5,n个=4行/前-与。分化后)与。差异基因表达(DEx,n个=3行/前-与。分化后-第1-3行,经多重比较调整后应用FDR<0.05截止值)。插入数字表示相关的p值,然后是每个重要类别重叠的蛋白编码基因的数量。数据表示为平均值±SEM。
在胚胎发育期间,从E9.5到E17.5,小鼠大脑中观察到一致的结果,在这段时间内,5-羟色胺能神经元完全分化,并建立起深远的神经支配22(-和补充数据表7-14). 与人类5-HT神经元的结果类似,发育过程中激活的神经元基因对H3K4me3和H3K4me3Q5ser的富集度显著增加,而在两个时间点保持相同表达的其他基因在两个发育阶段对这两个标记的基因组富集度相似。这些数据表明,在H3上结合K4me3和Q5ser可能会加强允许或诱导的基因表达模式体内然而,鉴于这两个标记都是在这些系统的分化/发育过程中诱导出来的,因此很难区分它们的具体贡献。
因此,为了更因果地评估Q5ser在这些过程中的作用,我们采用了RN46A-B14细胞培养模型23其中,这些可操作的、增殖的5-HT产生细胞可以被分化在体外增加5-HT生成,诱导细胞周期阻滞,促进BDNF依赖性神经突起生长表型(). 与人类5-HT神经元和发育中的小鼠大脑的数据一致,我们发现RN46A-B14细胞分化导致H3K4me3Q5ser水平显著增加(). 然而,与其他两种模型不同,我们没有观察到H3K4me3表达的变化(n个=3; t吨4=1.188,p=0.30),我们推断这一现象可能有助于进一步剖析H3K4me3Q5ser对基因表达的特殊贡献。为了验证该系统对H3K4me3Q5ser因果评估的有用性,我们通过使用我们的双PTM抗体执行ChIP-seq来评估分化的全基因组影响与。抗H3K4me3抗体;注意,H3K4me3抗体在Q5ser存在和不存在的情况下都能同样检测到甲基标记(). 分化前,峰召唤显示两个标记的全基因组富集度大致相等,但H3K4me3Q5ser的峰召唤总数随着分化而增加,而H3K4me3的富集度保持不变;两种PTM的基因组分布模式几乎相同(,和补充数据表15-18). 为了研究分化过程中H3K4me3Q5ser差异调控的基因组位点,进行了diffReps,鉴定了6386个富集改变的蛋白编码基因~60%的K4me3富集基因在H3K4me3Q5ser信号中显示出这种变化。大多数这些变化被发现是基因启动子内发生的事件增加(和补充数据表19-20),如波形蛋白(维姆)轨迹(). RN46A-B14细胞中约65%的所谓“二价基因”(广义上定义为H3K4me3和H3K27me3预分化均出现显著峰值的基因;这些细胞中约14%的K4me2标记蛋白编码基因),发现与显示差异富集的H3K4me3Q5ser的基因重叠,表明该标记的改变可能在分化过程中起到规避二价基因抑制的作用(补充数据表21-23). 随后对RN46A-B14细胞中显示H3K4me3Q5ser富集改变的基因通路进行评估,结果与分化的人类5-羟色胺能神经元和小鼠脑中观察到的结果相似,这些通路与H3K4me3差异分析中确定的通路重叠最小(补充数据表24-25). 最后,我们再次在这些细胞中进行RNA-seq,并进行Fisher精确测试,将具有差异H3K4me3Q5ser位点的基因与差异表达的基因进行比较。我们确定(与。H3K4me3;)标记的富集和差异基因表达之间的正相关(和补充数据表26)表明H3K4me3Q5ser可能是一种允许的修改。
H3K4me3Q5ser独立于H3K4me3,与细胞分化过程中的许可基因表达相关。a、,RN46A-B14细胞中5-HT的免疫荧光图像与分化前后的核共染色(DAPI)重叠。比例尺等于20μm。在≥3个独立实验中确认的结果b、,定量WB分析RN46A-B14细胞前体H3K4me3Q5ser表达-与。后分化(双尾学生t检验,n个=4/组;t吨6=3.736,**p=0.0097)。H3被用作加载控制。。c中,基于MACSv2.1.1的H3K4me3峰值呼叫与。RN46A-B14细胞分化前后的H3K4me3Q5ser ChIP-seq数据n个=3个独立的生物样品/预处理-与。后分化;归一化为各自的输入)。日期:,比较RN46A-B14细胞前H3K4me3Q5ser差异富集的分析-与。差异化后(FDR<0.05,FC>1.2,在调整多重比较后应用的截止值-n个=3个独立的生物样品/预处理-与。分化后)。饼图显示标记比较启动子基因差异富集事件的分布与。基因体区域。e、,基因组浏览器跟踪维姆H3K4me3和H3K4me3Q5ser的基因座(与。DNA输入)在RN46A-B14细胞分化前后。Δ表示由diffReps确定的H3K4me3Q5ser差异富集的统计显著位置(n个=3个独立的生物样品/预处理-与。分化后)。f、,H3K4me3Q5ser差异富集重叠基因的比值分析与。差异基因表达(DEx,n个=3个独立的生物样品/预处理-与。分化后,经多重比较调整后,应用FDR<0.05截止值)。插入数字表示相关的p值,然后是每个重要类别重叠的蛋白编码基因的数量。数据表示为平均值±SEM。
为了直接验证该标记在活性基因表达中的假定作用,我们生成了表达野生型H3.3或H3.3Q5A的慢病毒(H3.3用于确保细胞有丝分裂后染色质掺入24)–防止血清甲酰化的突变()但不影响H3在赖氨酸4处三甲基化的能力()–并在分化过程中转导RN46A-B14细胞。H3K4me3Q5ser靶基因表达模式与。通过RNA-seq评估非目标基因座(补充数据表27). 我们的数据表明,与内源性H3K4me3Q5ser表达竞争会改变H3K4me3Q5user靶基因的水平,对非靶基因座几乎没有影响(). 此外,H3.3Q5A调节的许多靶基因与正常分化期间观察到的调控模式相反()这表明,减弱标记的表达可能会导致这些细胞保持更未分化的状态。根据这一想法,Kegg分析确定轴突导向是受H3.3Q5A表达影响的唯一富集途径(补充数据表28). 接下来,我们在分化过程中对RN46A-B14细胞应用TGM2特异性抑制剂(LDN 27219),然后对预测受该标记调控的候选基因进行qPCR评估。在检测的候选基因座中,发现所有基因座在分化过程中的表达均下调(),与H3K4me3Q5ser作为许可修改的假定角色一致。最后,通过评估分化过程中RN46A-B14轴突生长,证实了标记的诱导和细胞发育进程之间的预测关联,其中H3.3Q5A的表达可显著缩短轴突长度(-)与细胞保持低分化状态一致。
为了评估H3K4me3Q5ser在基因表达中的许可作用的潜在机制,我们接下来研究了在K4me3存在和不存在的情况下,Q5 ser对核蛋白与N末端H3尾部结合作用的影响。我们使用核提取物IP中使用的人工修饰和生物素化的H3肽,然后使用LC-MS/MS来鉴定假定的结合蛋白。与H3K4me3的大量相互作用与。H3未经修改,包括许多公认的H3K4me3“阅读器”(补充数据表29). 以H3K4me3结合物为重点,我们评估了Q5ser与K4me3结合是否会影响这些结合事件。在这样做的过程中,我们发现77(约21%)这些蛋白质在Q5ser的存在下表现出增强或减弱的结合(和补充数据表29-30). 在这些增强的基因中,有15个普通转录因子复合物TFIID(TATA-box-binding protein/TBP及其相关因子/TAFs)成员。TFIID和H3K4me3Q5ser之间的这种增强相互作用随后通过western blotting核后提取物IP进行验证(和),并通过肽IP对抗纯化的TFIID复合物().
H3K4me3Q5ser增强TFIID与H3K4me3的相互作用。来自HeLa核提取物的改性H3(1–10)肽IP,通过a、,LC-MS/MS–iBAQ无标签定量,n个=4个独立的生物复制品/肽;t检验的结果(针对多重比较进行了调整)使用火山图进行了说明。填充圆圈的大小用于指示给定蛋白质的近似量。FDR<0.05,FC>2个截止值(灰色圆圈=未受Q5ser影响的K4me3结合物;红色圆圈=Q5ser-增强或减弱的K4me3结合物,黑色圆圈=在Q5ser--相互作用中改变的TFIID复合蛋白)。b、,HeLa核提取物中修饰的H3(1–10)肽IP的代表性蛋白质印迹图像(定量信息见).
最后,为了从表观基因组学上探讨差异性H3K4me3Q5ser富集与TFIID向染色质募集之间的关系,在RN46A-B14细胞分化前和分化后进行了Taf3的ChIP-seq检测。Taf3/TFIID染色质关联随着分化而升高,在转录起始位点(TSS)周围观察到大量增加的富集(和补充数据表31-32),如程序rg4轨迹(). 用差异H3K4me3或H3K4me3Q5ser分化后Taf3/TFIID峰重叠的进一步评估(与。这些基因包含两个或两个标记都不包含的差异位点)表明,在所有Taf3/TFIID结合基因中,约48%在过渡到有丝分裂后状态后与H3K4me3Q5ser富集改变相关(). 虽然发现两个标记的改变都与Taf3/TFIID基因相关,但只有约28%的H3K4me3差异富集基因与分化后的Taf3/TFIID重叠。与H3K4me3相比,显示H3K4me3Q5ser和Taf3/TFIID分化后富集改变的蛋白编码基因之间也观察到更多重叠(和补充数据表33).
H3Q5的5-羟色胺基化代表了待描述的组蛋白的第一个内源性单胺基修饰()以及谷氨酰胺残基的第一个非甲基PTM(例如H2AQ105me25)在组蛋白中鉴定。关于组蛋白5-羟色胺酰化的潜在功能,还有很多有待阐明的地方体内例如,标记相对于H3K4me3的化学计量比是多少,是否有特定的非H3K4me3“读取器”或去甲酰胺酶控制其活动,标记是否对环境扰动或与5-HT生成和/或信号转导改变相关的病理生理状态作出反应等。?然而,Q5ser似乎确实是一种修饰物,其作用是改变与H3K4me3的特定蛋白质相互作用,并可能参与增强选定组织和/或细胞类型内基因表达的允许模式。然而,标记定位于基因组位点的确切机制尚不清楚。此外,虽然H3K4me3Q5ser与TFIID的关联可能促进分化过程中位点特异性基因的表达,但这种相互作用可能只解释了标记在基因调控中的作用片段。最后,有理由认为组蛋白单胺基化的替代状态可能存在体内可能与H3 5-羟色胺酰化作用显著或协同调节真核细胞中的基因表达。因此,这些发现可能揭示与这类新组蛋白PTM有关的未来探索的大量机制。
方法
化学制品
常用试剂购自Sigma Aldrich(威斯康星州密尔沃基)和Fisher Scientific(宾夕法尼亚州匹兹堡)。用于Fmoc固相肽合成(SPPS)的氨基酸衍生物和偶联剂购自Novabiochem(瑞士Läufelfingen)和Matrix Innovation(加拿大魁北克)。血清素(5-HT)盐酸盐(类别号H-9523)、单丹酰卡德维尔(类别号30432)和盐酸胱胺(类别号C121509)购自Sigma Aldrich。LDN 27219购自研发系统公司(产品目录号4602)。羟色胺硫酸肌酐-5-[1,2-三H(N)]购自Perkin Elmer(目录号NET498001MC)。生物素尸体是从Invitrogen购买的。根据报告的合成程序,5-PT作为盐酸盐在室内制备15.
分析
使用Agilent 1100系列仪器和Vydac C18色谱柱(5μm,1 mL/min)进行反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)。在Agilent 1200系列系统上使用Vydac C18色谱柱(半制备色谱柱12μm,10 mm×250 mm,4mL/min)进行半制备反相高效液相色谱。在配备Waters 2535二元梯度模块、Waters 2489紫外线检测器和Vydac C18色谱柱(10μm,22×250 mm,18 mL/min)的Waters prep LC上进行制备规模的RP-HPLC纯化。所有反相高效液相色谱均以0.1%三氟乙酸(TFA)为流动相(HPLC溶剂A),90%乙腈和0.1%TFA为流动相。使用MicrOTOFQ II ESI-Qq-TOF质谱仪上的ESI-MS分析进行质谱分析(Bruker Daltonics,Billerica,MA)。
动物
小鼠(C57BL/6J)购自杰克逊实验室。Tph 1/2基因敲除小鼠的组织(与。研究人员在德国柏林麦克斯-德布吕克分子医学中心(MDC)的Natalia Alenina博士和Michael Bader博士提供了窝友控制。在恒定温度(23ºC)下,将动物分组,以12小时的光/暗周期(从早上7:00到晚上7:00)饲养随意获得食物和水。所有动物实验方案均由西奈山伊坎医学院(ISMMS)和MDC的IACUC批准。用二氧化碳对怀孕的雌性小鼠实施安乐死,并在E9.5和E17.5收获小鼠胚胎脑(整个),用于随后的测序和蛋白质印迹实验。PBMC分离:成年小鼠快速断头处死。收集躯干血(~500μl)于1.5 ml肝素-碘衬里的Eppendorf管中(目录号022379208)。随后,将干血与2 ml室温(RT)RPMI培养基在15 ml锥形管中混合,并分层在2 ml RT Ficoll试剂(Ficoll-paque™PLUS试剂,GE Healthcare目录#17-1440-02批号10260010)上。在室温下以2200 RPM的转速离心总混合物15分钟,并缓慢制动。PBMC可见为混浊层。用1 ml移液管缓慢移走这一层,并将其添加到一个新的无菌15 ml锥形管中。随后将DPBS中的BEP洗涤缓冲液(5%BSA,2 mM EDTA)添加到PBMC层中,并在RT下离心10分钟,以洗涤细胞并使其颗粒化。
组织培养
细胞培养材料
Dulbecco改良鹰培养基(DMEM)(Sigma;猫#D8437),0.05%胰蛋白酶(Thermo Fisher,猫#25300120),10%胎牛血清(Omega;猫#FB11),100μg ml−1链霉素和100 U ml−1青霉素(Thermo Fisher;目录号15140122)、RPMI-1640培养基(Sigma目录号R8758)、Geneticin(Thermo-Fisher,目录号11811031)、Matrigel(VWR;目录编号47743–716)、B-27增补剂、(ThermoFisher:目录号17504–044)、0.1%胰岛素、(西格玛;目录号I6634。B16基本培养基(pH 7.35):[740 ml DMEM(GIBCO;类别号31053–036),260 ml F-12营养素(GIBCO;类别号21700–075),14 mM碳酸氢钠,11 mM HEPES(Sigma;类别号H6147)和1%BSA(Sigma#A3311)溶于1 L MilliQ水中]。
HEK293T和HeLa细胞培养
HEK293T和HeLa细胞系从美国型培养物收集(ATCC)中获得,并在补充有10%FBS和100μg ml的DMEM中生长−1链霉素/100 U ml−1青霉素。细胞保持在37°C的5%CO中2,95%加湿培养箱。
人PSC与5-羟色胺能神经元培养
将健康人的成纤维细胞培养,以重新编程为诱导的多能干细胞(PSCs)。根据制造商的说明(Invitrogen,A13780–02,A16517,A16518),在CytolTune-iPS Sendai重组试剂盒中使用仙台病毒实现了对人原代成纤维细胞的重组。PSC经证实核型正常,并使用改良的mTeSR1培养基配方(Stemcell Technologies)在Matrigel-coated塑料板(BD Biosciences)上培养。简而言之,hPSCs保持为菌落并通过机械和酶解(Dispase)传代(行:#1=p13,#2=p12,#3=p14和#4=p19)。细胞培养1周,收获前每天更换培养基。使用之前描述的方法的改进版本生成血清素能神经元18简单地说,漂浮的类单体(EB)是由hPSC菌落的机械和酶(胶原酶)分解产生的。EB用DMEM/F12-谷氨酰胺:神经基(1:1)培养一周,包括:N2、B27补充剂、1x非必需氨基酸、SB431542(2μM)、DMH-1(2μM)和CHIR99021(1.4μM)(血清学培养基)。在血清学培养基中,将EB镀到涂有聚鸟氨酸/层粘连蛋白(Sigma)的塑料板上,并添加Sonic hedgehog蛋白(Shh,500 ng/ml),持续一周。在含有Shh(500 ng/ml)和FGF-4(10 ng/ml。通过在血清能分化培养基中以较低密度额外培养3周,得到血清能神经元,该分化培养基由含有GDNF(10 ng/ml)、BDNF(10mg/ml)(Peprotech)、二丁基环AMP(1 mM,Sigma)、抗坏血酸(200 nM,Simma)、层粘连蛋白(1μg/ml)、DAPT(2.5µM)的神经基底培养基组成和TGF-β3(1 ng/ml)。培养基每隔一天更换一次,持续3周,然后采集细胞进行进一步处理。所有人类干细胞工作程序均由索尔克研究所机构审查委员会进行监测和批准。
RN46A-B14细胞分化
对于RN46A-B14细胞分化,使用了已发布协议的修改版本23,26简单地说,RN46A-B14细胞(由ISMMS的Olivier Berton博士提供)在33°C、5%CO、10%FBS、1%Pen/Strep和250μg/ml Geneticin的DMEM中培养和维持2在10厘米的细胞培养皿上。分化前一天,用6毫升基质凝胶/DEM混合物在室温下涂布细胞培养皿1小时。基质凝胶聚合后,0.7–0.8×106用10ml常规培养基将细胞接种在每个培养板上。然后在33°C下培养板过夜,使细胞粘附在板上。分化当天,从培养板中取出常规生长培养基,并向每个培养板中加入10ml分化培养基(B16基础培养基中的1%Pen/Strep、1%B-27补充剂、0.1%胰岛素、0.1%脱铁蛋白、0.1%腐胺)。然后在39°C和5%CO下培养细胞2,95%湿度三天。第四天,以1:1的比例有条件地更换分化培养基。第六天用0.05%胰蛋白酶离心收集分化后的RN46A-B14细胞,洗涤多次,然后在冰上的DPBS中复原。
手机线路源和身份验证
HEK293T和HeLa细胞系来自美国型培养物收集(ATCC)。RN46A-B14细胞由ISMMS的Olivier Berton博士提供。hPSC和hPSC衍生的5-HT神经元由Salk研究所的Fred Gage博士提供。Sf9细胞由普林斯顿大学的Tom Muir博士提供。HEK293T和HeLa细胞是根据我们使用这些细胞系的丰富经验(基于细胞形态、生长条件等)进行鉴定的。如原稿所述,RN46A-B14细胞的1)5-HT生成和2)分化潜能(例如,细胞分裂停滞、神经突起形成、基因表达改变等)得到了验证。如手稿中所述,hPSC和衍生的5-HT神经元得到了验证(). Sf9细胞在TGM2蛋白纯化中的用途得到了验证。所有细胞株支原体污染检测均为阴性。
治疗
5-PT:细胞(HEK293T或HeLa S2)与5-PT(500μM)在约75%的汇合处孵育。细胞处理3小时,然后用0.05%胰蛋白酶收集并在DPBS中造粒。胱胺:如有指示,细胞接受浓度为4 mM的二氢氯胱胺3小时,并结合5-PT处理。
LDN 27219:细胞(RN46A-B14)在分化的第1天与可逆TGM2抑制剂LDN 272019(10μM)孵育。第四天,以1:1的比例有条件地更换分化培养基,不再添加抑制剂。第六天用0.05%胰蛋白酶离心收集分化后的RN46A-B14细胞,洗涤多次,然后在冰上的DPBS中复原。
转染
HEK293T细胞在六孔板中培养,以FuGENE®HD转染试剂(Promega;cat#E2311)与DNA的3:1比率进行瞬时转染。对于转染,每孔转染1μg质粒DNA;转染48小时后,用0.05%胰蛋白酶分离细胞并收集。
肽的合成和重组蛋白的制备
抗体产生用5-羟色胺酰化肽的制备
使用标准Fmoc策略固相化学,在含有C末端Cys残基的2-Cl Trityl树脂上制备对应于H3(1–10,Q5ser或K4me3Q5 ser)的肽免疫原,用于与马来酰亚胺活化的KLH偶联。在位置5并入正交保护的Fmoc-Glu(OAll)-OH以进行树脂上的5-羟色胺酰化,在位置4偶联Fmoc-Lys(me3)-OH以生成双重修饰免疫原。在组装肽主干后,用Pd(0)(PPh)处理树脂结合肽,使其烯丙基脱保护三)4(0.2当量),N,N-二甲基巴比妥酸(10当量)在DCM中放置30分钟(两次处理)。用DCM和DMF对树脂进行广泛清洗以去除残余Pd,用PyAOP(1.1当量)和DIEA(4.0当量)在DMF中对Glu侧链羧酸盐进行两次处理,然后直接添加盐酸羟色胺(2.0当量)并搅拌30分钟。用5%乙二硫醇(EDT)、2.5%iPr处理,从树脂中分离出粗5-羟色胺酰化肽,同时进行全局脱保护三SiH,2.5%H2O在TFA中室温下放置2小时。通过制备的C-18 RP-HPLC纯化肽,并通过C-18 RP-HPLC和ESI-MS分析最终产物。然后将纯化的肽提供给EMD Millipore以生成兔多克隆抗体,如下所述。
生物素化H3(1-10)肽的制备
在含有C末端赖氨酸(生物素)残基的2-氯三丁基树脂上,使用标准Fmoc-策略固相化学制备对应于H3(1-10)的改性肽。根据上述条件对肽进行血清酮基化、纯化和表征。
H3(1–15)肽的制备
使用标准Fmoc策略固相化学在Rink Amide ChemMatrix树脂上合成与H3(1–15)对应的肽。H3K4的甲基化状态通过掺入适当保护的赖氨酸残基来改变,以获得me1[Fmoc-Lys(Me,Boc)-OH]、me2[Fmoc-Lys(Alloc)-OH)]或Me3[Fmoc-Lys(Me3)-OH]。Lys(Alloc)转化为Lys(me2)是通过如上所述的双Alloc/烯丙基脱保护,然后用37%甲醛和NaBH还原胺化来实现的三在血清酮化之前在PBS/MeOH中的CN。根据上述条件对肽进行5-羟色胺酰化、纯化和表征。
重组蛋白
将人类组蛋白H3.2和H4克隆到pRUTH5中,以产生N末端His6-TEV标记。组蛋白随后在BL21 Star(DE3)细胞(Thermo Fisher,cat#C6010-03)中表达到包涵体中,并在37°C下持续3⁄hr。在Ni-NTA亲和柱上纯化之前,包涵体在6⁄M胍-HCl、1⁄M NaCl和50⁄mM Tris-HCl(pH⁄8)中重新溶解。为了产生重组H3Q5A,使用标准SDM将突变引入pRUTH5-H3.2构建物。其他组蛋白购自Active Motif(H3.1,cat#31294,EPL生成H3K4me3,cat#31278)。对于一些实验,从R&D Systems购买重组人TGM2(猫号4376-TG-050),从Zedira购买豚鼠TGM2(猫号T006);活性Motif的KMT2A(MLL1)复合物(类别号31423);和来自西格玛的人类血浆的纤维蛋白原(类别号F4883)。
Sf9细胞中TGM2的产生
组织转谷氨酰胺酶2(Uniprot ID:{“类型”:“entrez-protein”,“属性”:{“文本”:“P21980”,“term_id”:“20141877”,“term_text”:“P21980”}}第21980页)使用杆状病毒表达载体系统进行表达。TGM2的编码序列来自哺乳动物表达载体mCer-TG2-YFP[Addgene Plasmid#85471;该质粒包含两个非本地错义突变(T141A和V224G),它们被突变为内源性残基]。使用标准限制性内切酶方法将该基因亚克隆到pACEBac1载体中,并引入N末端FLAG亲和标记以纯化产生pACEBack1-FLAG-TGM2的酶。所有序列均经Sanger测序(新泽西州南普莱恩斯博罗市GENEWIZ)证实。为了产生bacmid,将pACEBac1-flag-TGM2转化为DH10bac大肠杆菌符合制造商说明的合格电池(赛默飞世尔科技公司)。如前所述生成病毒2TGM2通过将1:500稀释的P3病毒添加到2×106Sf9细胞每毫升培养的细胞数。27℃孵育48小时后哦在黑暗中,通过离心收集细胞,用PBS洗涤并造粒。使用40µL/mL培养物,将颗粒重新悬浮在TEGN(25 mM Tris,1 mM EDTA,10%甘油,0.02%IGEPAL CA 630,pH 7.5)加500 mM NaCl,1 mM DTT,0.1 mM PMSF中。细胞通过20次紧密的Dounce均质器溶解,然后进行超声处理。通过离心(17000g x 30 min)清除裂解液,用TEGN将NaCl浓度稀释至350 mM,然后再次通过离心清除。将上清液与Flag琼脂糖珠(Genscript G1 a-DYKDDDDK,0.5µL珠/mL培养基)在4哦C.培养后,用TGN(25 mM Tris,10%甘油,0.02%IGEPAL CA 630,pH 7.5)加350 mM NaCl洗涤珠子三次,最后用TGN加120 mM NaCl洗涤。然后在4℃下通过培养从珠子中洗脱蛋白质哦C和FLAG肽(0.25 mg/mL TGN加120 mM NaCl,1 mM DTT,3×10 min x 1 CV)。然后使用Vivaspin 500离心浓缩器(MWCO 30000)浓缩洗脱的蛋白质,并用TGN加120mM NaCl、1mM DTT透析(2×4小时)。将透析、纯化的TGM2进行校准并储存在−80哦C、。
H3K4me3和H3Q5ser核小体的产生
肽合成
半合成中使用的合成肽硫酯是在SEA-PS树脂(Iris)上手动合成的。利用5当量的Fmoc-Gly-OH、4.9当量的HATU和10当量的DIEA(2×1小时)进行第一个甘氨酸残基的偶联。耦合后,使用10%DIEA和10%Ac的封盖步骤2在DMF(5 mL)中加入O(1×10 min)。然后使用Fmoc脱保护[3 mL 20%哌啶在DMF中(1×1 min,2×8 min)和氨基酸偶联(4.9 eq.HOBt/HBTU和10 eq.DIEA 20–45 min)的迭代循环来延长肽,并在每个步骤之间用DMF彻底清洗。必要时使用双偶联剂以确保生长肽的完全酰化。通过加入Fmoc-L-谷氨酸γ-烯丙基酯(Chem-Impex International)引入5-羟色胺残基,然后如上所述去保护和偶联5-羟色氨(抗体生成用5-羟色胺化肽的制备肽组装后,使用92.5%TFA、2.5%EDT、2.5%iPr对粗肽进行裂解和脱保护三SiH和2.5%H2O。然后用乙醚沉淀粗肽,并让其风干。然后根据既定方案将肽转化为C端硫代酯27简单地说,(对于0.05 mmol规模的合成)在巯基丙酸(MPA,0.5 mL)和TCEP(16当量,相对于肽)的溶液中培养粗肽[含有C末端双(磺胺基乙基)氨基连接物],2x PBS(10 mL)pH 4.0,37哦C过夜。用水(10 mL)和10%水性TFA(5 mL)稀释反应混合物,并用Et萃取2O去除MPA,冻干过夜,然后通过制备RP-HPLC利用0-30%B的梯度在60分钟内纯化。
重组组蛋白的制备
重组人组蛋白H2A、H2B和H4在大肠杆菌并根据规定进行净化28稍作修改的协议。用组蛋白表达质粒转化BL21(DE3)细胞,并在37°C的Luria-Bertani(LB)培养基中生长,直至OD600为0.6。然后通过添加1 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。组蛋白在37°C下表达3-4 h,然后通过离心法(4000×g,15 min,4°C)造粒细胞。将颗粒重新悬浮在每升细胞培养液中10 ml的裂解缓冲液中(20 mM Tris、200 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM-BME、0.1%Triton X-100 pH 7.5)。通过超声波(30秒开/30秒关,5个周期,45%振幅)对细胞进行裂解,并离心(16000×g,25分钟,4°C)。用不含Triton X-100的冷裂解缓冲液洗涤包涵体颗粒两次,并在4℃下用再悬浮缓冲液(7 M尿素、10 mM tris、1 mM EDTA、100 mM NaCl和1 mM DTT)萃取2 h。然后通过离心(16000×g,25 min,4°C)清除包涵体提取物并过滤。然后使用HiTrap SP FF柱(GE Healthcare Life Sciences)通过离子交换色谱分离组蛋白,在再悬浮缓冲液中使用0.1到1 M NaCl的梯度超过60分钟。通过SDS-PAGE分析组分,并通过制备型RP-HPLC利用20–73%B的梯度在60分钟内混合并纯化含组蛋白的组分。
截短组蛋白的制备
用编码N-末端6xHis-SUMO标记组蛋白H3(14-135,K14C)的质粒转化BL21(DE3)细胞。如上所述进行表达,将细胞颗粒重新悬浮在20 mL变性裂解缓冲液(6 M Gdn.HCl,50 mM Na)中2高性能操作4,300 mM NaCl,1%Triton X-100,5 mM咪唑,1 mM TCEP,pH 8.0),通过超声波溶解并通过离心(16000×g,25 min,4°C)清除。通过Ni-NTA亲和层析从裂解液中亲和纯化6xHis标记蛋白。将蛋白质在洗脱缓冲液(6M尿素,50mM Na2高性能操作4,250 mM咪唑,1 mM TCEP pH 7.5),并在4°C下逐步透析至复性缓冲液(50 mM Na2高性能操作4300 mM NaCl,5 mM DTT,pH 7.5),含2 M尿素4 h,2 M尿素18 h,0 M尿素4小时。在最后透析步骤之前添加Ulp1蛋白酶,以分离6xHis-SUMO标签。解理后,固体Gdn。添加HCl以溶解在蛋白水解过程中部分沉淀的截短组蛋白,并通过制备型RP-HPLC利用20–73%B的梯度在60分钟内直接纯化溶解的混合物。
改良半合成组蛋白的制备
如前所述,全长组蛋白由两个片段半合成而成29简单地说,H3肽◻-硫代酯(残基1-13)与截短组蛋白H3(残基14-135,K14C)在6 M Gdn中孵育。0.1 M Na盐酸2高性能操作4,20 mM TCEP,0.1 M巯基苯乙酸,pH 7.5–8.0。在完成连接反应后(根据HPLC和ESI-MS分析判断),通过制备RP-HPLC利用20–73%B的梯度在60分钟内纯化连接产物(H3Q5ser,K14C)。然后用6 M Gdn的2-溴乙基溴化铵(50 mM)溶液处理纯化的半合成蛋白质。HCl,1 M HEPES,10 mM蛋氨酸,20 mM DTT,27°C时pH 7.8,将非天然半胱氨酸残基转化为14位的赖氨酸模拟物(K14Kc(c))30在完全转化为烷基化产物后,利用20–73%B的梯度在40分钟内通过半制备RP-HPLC纯化蛋白质,并通过HPLC和ESI-MS分析验证其特性和纯度。
组蛋白八聚体复性
组蛋白八聚体是根据既定方案形成的31组蛋白首先溶解在去折叠缓冲液中(6 M氯化胍,20 mM Tris-HCl,1 mM DTT,pH 7.9),其浓度通过280 nm处的紫外-可见吸收测定。四种组蛋白在展开缓冲液中结合(H3、H4、H2A和H2B的摩尔比为1:1:1.1:1.1),最终蛋白质浓度为1 mg/mL。在4°C下,在复性缓冲液(2 M NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM-DTT、pH 7.9)上反复透析混合物4、18和4小时。然后使用Superdex S200 10/300增列柱(GE Healthcare Life Sciences)通过尺寸排除色谱法从聚集体和二聚体中纯化组蛋白八聚体。通过SDS-PAGE对馏分进行分析,将纯馏分混合,稀释至最终浓度50%的甘油,并储存在−20哦C、。
DNA制备
含有147 bp Widom 601 DNA序列多拷贝的表达质粒32将EcoRV位点两侧转化为DH5α大肠杆菌细胞。在表达和分离质粒并用EcoRV消化后,用PEG 6000沉淀纯化单体601 DNA33.
核小体重建
使用既定方法形成MN34简单地说,组蛋白八聚体和601 DNA混合在2 M TEK中(20 mM Tris-HCl,2 M KCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT pH 7.5,4°C),并放置在Slide-a-Lyzer MINI透析设备中(3.5 kDa分子量(MW)截止值,Thermo Fisher Scientific)。将溶液在4°C下透析到200 ml 1.4 M TEK(10 mM Tris-HCl,1.4 M KCl,1 mM DTT,0.1 mM EDTA,4°C时pH值7.5)中1 h。使用蠕动泵,以1 ml/min的速度将330 ml核小体隔夜添加到10 mM TEK中(10 mM-Tris-HCl,10 mM KCl、1 mM DTT,0.1 ml EDTA,在4°C时pH值为7.5)。随后在200 mL 10 mM TEK中进行两个透析步骤(2×3 h),然后将样品转移到1.5 mL微离心管中,离心(17000 g,4°C,10 min)并分离上清液。核小体浓度通过260 nm处的紫外吸收光谱定量,核小体质量通过天然凝胶电泳验证(5%丙烯酰胺,0.5×TBE,120 V,60 min SYBR Gold核酸染色,来自Life Technologies)。
酶分析
TGM2-MDC/血清酰化分析(肽和单体组蛋白)
为了评估TGM2介导的MDC/5-HT对肽/蛋白质的转酰胺作用,将10μg纤维蛋白原、BSA或重组组蛋白/肽与5 mM MDC/5-HT(5μM三放射性分析中使用5-HT)和0.25 ug rTGM2,最后体积为25μL的酶缓冲液(25 mM Tris-Cl,pH 8和5 mM CaCl2,加上蛋白酶抑制剂)。然后在室温下黑暗培养反应3小时。然后在凝胶电泳之前,将样品在变性样品缓冲液中加热至98°C 8分钟。MDC标记的蛋白质条带可以在紫外光下通过荧光观察,然后通过考马斯染色来控制相等的蛋白质负载。放射性5-HT转移通过闪烁计数(滤波后捕获)进行监测。
TGM2-脱甲酰化/生物素尸检(单核小体)
通过在20µL酶缓冲液(25mM Tris,10mM CaCl210 mM DTT,10 mM KCl,5 mM血清素或生物素尸体,pH 7.8),30℃下1小时哦C.孵育1小时后,用4X SDS负载缓冲液猝灭反应,并通过使用α-H3Q5Ser(在3%牛奶中为1:500)或Strep-800(在3%TBST中为1:10000)和α-H4(在TBST中为1:1000)的蛋白质印迹进行分析,以控制负载。
MLL1复合甲基转移酶检测(单体组蛋白)
评估MLL1介导的甲基化活性,5 ug蛋白质(H3与。H3Q5A)与1μg重组MLL1复合物在反应缓冲液中孵育(50 mM TrisCl pH 8.6,0.02%Triton X-100,2 mM MgCl21 mM TCEP,50μM SAM,室温下3小时。通过α-H3K4me3特异性抗体的免疫印迹法评估甲基化状态。
MLL1复合甲基转移酶分析(单核小体)
未改性的等浓度与。Q5ser单核小体在含有50 mM TrisCl pH 8.6、0.02%Triton X-100、2 mM MgCl2、1 mM TCEP和0.2μM氚化SAM的反应缓冲液中培养三(PerkinElmer NET 155050UC,LOT 2094503)在室温下放置3小时。培养后,用吸管将反应物移到滤纸方块(1 cm x 1 cm)上,并让其完全干燥。滤纸随后在磁性搅拌板上的大烧杯中的冰镇碳酸钠缓冲液(0.1 M;pH 8.5)中清洗3次。滤纸再次在室温下风干,然后放入装有5 ml闪烁液的闪烁小瓶中。通过氚(3-H)的液体闪烁计数(CPM)测量氚化SAM的掺入。
5-羟色胺化H3(1-15)的LC-MS/MS验证
样品通过LC-MS/MS(Dionex 3000耦合到Q-Exactive,Thermo Fisher)进行分析。肽通过C-18色谱法(75µm/3µm颗粒内径,日本Nikkyo Technologies)分离,梯度在25分钟内从1%B增加到40%B(a:0.1%甲酸,B:0.1%甲酸中的乙腈)。质谱仪在PRM模式下运行35(分辨率35000,AGC目标,5e5,最大注入时间60ms,隔离窗口m/z为2.0)。MS从m/z 300–1650获得,而m/z=100被设置为MS/MS的最低质量。修饰肽和非修饰肽的电荷状态为2+至5+。四电荷肽ARTKQTARKSTGGKA-NH的能量为25 NCE2,有修改和无修改。表示Gln 5(m/z 430.4997[0.12 ppm])处经5-HT修饰的四电荷肽ARTKQTARKSTGGKA-NH2的高分辨率、高精度串联质谱(样品+5-HT/+TGM2)。计算了完整的氨基酸序列。对用于验证血清酰化谷氨酰胺的选定片段离子进行了注释(双电荷y10/y11和双电荷b4/b5)。我们在m/z 160.07554处观察到一个诊断片段离子,对应于5-羟色胺减去氨的损失(C10H10NO)。通过重复使用氘化物(D4)血清素。正如预期的那样,含有D4血清素的前体和片段移动了4.025 Da(数据未显示)。
细胞分馏
核制剂、细胞溶质制剂和染色质制剂
收集细胞并在200μl冰冷缓冲液A(10 mM HEPES,pH 7.9,10 mM KCL,1.5 mM MgCl)中均质2,0.34 M蔗糖,10%甘油,0.5 mM PMSF),使用1 ml玻璃搅拌器和紧杵。将均化的裂解物转移到1.5ml Eppendorf管中,并将Triton-X 100洗涤剂添加到0.1%的最终浓度。然后将样品在冰上培养30分钟,每5分钟间歇摇动试管。在4°C下以1300g离心5分钟后,去除上清液并将其分离到标有“S1”的试管中。第一次旋转产生的剩余小球被视为细胞核。通过20000g离心5分钟以去除颗粒物质(上清液=胞浆),进一步澄清S1部分。然后将第一次旋转的颗粒重新悬浮在200μl缓冲液A(不含Triton-X 100)中,离心5分钟进行洗涤与。可溶核材料,将核颗粒重新悬浮在100μl缓冲液B(3 mM EDTA,0.2 mM EGTA)中,并在冰上培养30分钟,每5分钟摇动一次。培养后,离心样品,将上清液作为可溶核部分去除与。颗粒,代表染色质。在RIPA缓冲液中制备组织的全细胞裂解物。蛋白质浓度使用DC™蛋白质分析测定(BioRad,cat#5000111)。
HeLa细胞可溶性核提取物的制备
Dignam和Roeder称,核提取物是从HeLa细胞中制备的36或从CilBiotech购买。在进行IPs之前,将提取物透析到以下缓冲液中:Hepes 20 mM,NP40 0.01%,EDTA 0.5 mM,甘油10%,KCL 150 mM,PMSF 0.4 mM。浓度通过DC™蛋白分析测定。
免疫沉淀(IP)
5-PT IP
使用按说明制备的全细胞、细胞溶质、可溶性核或染色质组分进行5-PT IP(细胞分馏部分).利用铜点击化学,将炔烃功能化5-HT衍生物5-PT与生物素叠氮分子偶联(Thermo Fisher;cat#{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“B10184”,“term_id”:“2091303”,“term_text”:“B1 0184”}}B10184号)并用于标记血清酰化蛋白。在用5-PT处理后,在专利的CLICKiT反应缓冲液中制备细胞裂解物(Thermo Fisher;cat#{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“C33372”,“term_id”:“2365168”,”term_text“:”C33372“}}C33372号). 对于全细胞裂解物,在200μL缓冲液中对细胞颗粒进行超声处理。对于核、细胞溶质和染色质组分,将样品重新悬浮在约200μL的反应缓冲液中。在添加CLICK试剂之前,样品在16000g下离心5分钟,以去除不溶性碎片。然后将裂解液转移到新鲜的1.5 ml离心管中。按以下顺序,0.25 mM生物素叠氮化物,0.1 mM CuSO4向裂解液中添加0.1 mM铜保护剂和50μL 1X CLICK添加剂,并使用CLICK反应缓冲液将最终体积增加至~500μL。允许样品在4°C下培养2小时。接下来在PBS中洗涤两次磁性链霉亲和素珠(Thermo Fisher,cat#11206D),每次洗涤时轻轻旋转。在添加洗涤珠之前,用PBS将反应体积进一步增加至1 ml,去除5%以供输入。对于每个IP,使用20μL珠浆。在RT下旋转IP 3小时。培养后,将样品放置在磁性支架上,以使珠子与上清液分离。用移液管小心地移走上清液(流过)。然后,通过倒置试管并在含有蛋白酶抑制剂的冷RIPA缓冲液(10 mM Tris-Cl,pH 8.0,1 mM EDTA,1%Triton X-100,0.1%脱氧胆酸钠,0.1%十二烷基硫酸钠,150 mM NaCl,1 m M PMSF)中轻轻旋转来清洗珠子。重复六次,然后在冷DPBS中清洗六次,以去除多余的洗涤剂。最后一次清洗后,将样品缓冲液添加到珠子中,并在98°C下煮沸8分钟,然后进行凝胶电泳,并与适当的一级和二级抗体孵育。
组蛋白尾肽IP和相关质谱
将100μg每种肽与100μL预先洗涤的固定化链霉亲和素珠(DynaBeads™链霉亲和力M-280)重新悬浮在0.01%DPBS/Triton-X 100中,然后在4°C下旋转培养过夜。对于每个肽IP,将40μl 50%的肽珠浆加入到透析的HeLa细胞提取物中(10mg/IP,含2mM MgCl2如前所述,在珠之前添加)或纯化TFIID复合物(来自表达HeLa细胞的Flag-TBP的IPd4在结合缓冲液中:150 mM KCl,50 mM Tris-HCl,pH 8.0,1%NP40,1 mM DTT),每个样品在4°C下旋转4小时。然后将IP以1000rpm离心1分钟以使珠粒沉淀。然后在用300 mM KCl(不含MgCl)替换的结合缓冲液中清洗珠子六次2). 对于免疫印迹分析,接下来将珠子在冷的DPBS中洗涤,并在30μl变性样品缓冲液中煮沸8分钟。
对于质谱分析,与肽结合的蛋白质在8 M尿素/0.1 M碳酸氢铵/10 mM DTT中洗脱。还原后,半胱氨酸在30 mM碘乙酰胺中烷基化。然后用LysC(LysC、Endoproteinase LysC和Wako Chemicals)在小于4M的尿素中消化蛋白质,然后用小于2M的尿素进行胰蛋白酶化(Trypsin Gold、Promega)。通过添加TFA停止消化,并将消化液脱盐37并使用Fusion Lumos(Thermo Scientific)在高/高模式下运行,通过反相纳米LC-MS/MS进行分析。
使用ProteomeDiscoverer v.1.4.0.288(Thermo Scientific),结合Mascot v.2.5.1(Matrix Science)和MaxQuant v.1.6.0.13,根据Uniprot的人类数据库(70246序列,2016年3月)对数据进行量化和搜索38蛋氨酸氧化和蛋白质N末端乙酰化被允许作为可变修饰,所有半胱氨酸被视为氨基甲酰化。使用Percolator筛选肽匹配物39,计算FDR为1%。对于定量MaxQuant分析,肽的FDR阈值分别设置为2%和1%。
数据分析:实验包括3个肽条件(H3、H3K4me3和H3K4me3Q5ser),每个肽有4个生物复制品。使用Perseus v 1.6.0.7处理数据40。消除了反向匹配和潜在污染。Log2转换的iBAQ值41按中位数(每个样本)进行归一化。为了进行比较,要求在至少一种条件下,在4次重复中至少3次测量信号。输入缺失值(宽度:0.3,降档:1.8)。首先,使用t检验比较H3和H3K4me3(基于置换的FDR为0.05)。只有在H3K4me3中发现更丰富的重要蛋白质与。第二次分析(361个蛋白质)考虑了H3条件(具有最小两倍线性差异):H3K4me3Q5ser与H3K4Met3的比较(t检验,基于置换的FDR为0.05,S=0.1)。所有测量的蛋白质和信号,以及折叠差异和p-/q值都可以在补充数据表29。主要数据以及MaxQuant搜索结果将上载到PRIDE。
内源性H3Q5ser和H3K4me3Q5user的LC-MS/MS鉴定
样品制备和靶向MS/MS
RN46A-B14细胞分化后的染色质(5×106/按照ChIP实验中的描述,对16号小鼠DRN组织穿孔(双侧,共3只动物/样品)进行溶解和声波处理,但不进行交联。然后将超声染色质与我们的两种特异性抗体之一(H3Q5ser或H3K4me3Q5user,7.5μg/样品)和标记IPd孵育。如前所述,在小球上,使用丙酸酐和乙腈的1:3混合物衍生未经修饰的赖氨酸42然后在50 mM NH中用胰蛋白酶(酶:样品比=1:20,6小时,RT)消化衍生组蛋白4HCO公司三将肽进一步衍生两次,得到丙酰化N-末端。在此之后,使用C-18分级尖端对样品进行脱盐,以进行LC-MS分析。使用安装在EASY nLC纳米HPLC(Thermo Scientific,San Jose,Ca,USA)上的75µm ID x 17 cm Reprosil Pur C18-AQ(3µm;德国Maisch GmbH博士)纳米柱分离酸化样品。HPLC梯度如下:溶剂B(A=0.1%甲酸;B=95%MeCN,0.1%甲酸)在45分钟内从2%到26%,溶剂B在5分钟内从26%到80%,80%B在300 nL/min的流速下持续10分钟。nLC在线耦合到Orbitrap Fusion™Tribrid™质谱仪(Thermo Fisher)使用目标数据相关采集(DIA)获取数据。全扫描MS(米/z300−1100),分辨率为60000,AGC目标为2×10e5。MS/MS在离子阱中进行,具有50的顺序隔离窗口米/zAGC目标为1×10e4,HCD碰撞能量为32,最大注入时间为50毫秒。以质心模式收集MS/MS数据。对合成肽中的内源性Q5ser或K4me3Q5ser-标记和D5-丙酰化重峰进行靶向MS/MS。手动搜索数据,并使用重峰值对照确定低丰度内源性肽。
关于缺乏化学计量评估的说明
由于每种检测方法都包含固有的偏差,因此获得准确的化学计量学评估是一项复杂的任务。尽管质谱法具有高精度和高灵敏度,但也不例外。事实上,几乎所有MS实验都只定义了PTM状态的相对丰度和相对变化。
为了正确定义H3Q5ser和H3K4me3Q5user的化学计量,不仅需要准确估计修饰物本身的摩尔浓度,还需要准确估计该肽所有其他修饰状态的摩尔浓度(例如,未修饰的H3K4me1、H3K4-me2、H3K4me3、H3K 4ac以及与H3Q5 ser的所有组合)。当合成所有合成肽当量并在已知摩尔浓度下加标时,这项任务是可能的。然而,这也要求在同一样品中可以检测到给定肽的所有形式,因为不同样品类型的组蛋白具有不同的背景和不同的敏感性。在5-羟色胺修饰的情况下,这种实验是禁止的,因为检测H3Q5ser/H3K4me3Q5ser肽需要使用位点特异性抗体进行富集,从而在其他非富集修饰形式的量化中产生偏差。
对于这些标记的化学计量评估,需要将含有H3Q5ser的肽峰的曲线下面积与来自相同肽的其他低水平检测标记(如H3K4me3)进行比较。通常,MS在依赖数据的采集模式下分析的非富集组蛋白肽,相对于所有H3(3–8)肽(未修饰+H3K4me1+H3K4me2+H3K 4me3+H3K 4ac),H3K4me3标记的丰度为0.002–0.01%。对于RN46A-B14细胞和小鼠DRN,我们注射1-3 ug组蛋白肽~1 ug是可以注射的组蛋白肽总量的最低值,因为低丰度标记,如H3K4me3,在这种混合物中仅占总组蛋白肽的~0.0000084%,而3 ug是在纳米流液相色谱中注射最多的,不会堵塞C18柱并造成色谱异常。我们通过对与内源性Q5ser或K4me3Q5ser-肽相对应的m/z进行靶向MS,提高了检测血清甲酰基物种的选择性和敏感性。由于5-羟色胺化肽的信号强度较低,并且通常在噪声范围内,我们通过使用这些肽的D5标记合成版本作为洗脱时间控制来提高检测的特异性。我们通过观察特定片段离子在0.02公差限内的MS/MS,确认了在全MS中获得的与血清酰化H3(3-8)肽m/z相对应的低水平信号确实是正确的物种。在这些条件下,在非浓缩样品中未检测到血清甲酰肽。因此,对于H3K4me3丰度约为0.005%的代表性样品,相对于H3的所有其他肽(3-8氨基酸),我们推断H3Q5ser和H3K4me3Q5user丰度较低;然而,它们之间的差异程度无法准确定义。
当标记为IP’d时,检测到内源性Q5ser和K4me3Q5ser-肽通过上述所有标准。然而,在整个过程中,有关其他H3(3-8)肽的信息丢失,无法推断出相关的化学计量。在技术允许在一步中以同等亲和力富集该肽的所有修饰形式之前,无法测量化学计量。最后,虽然5-羟色胺标记的丰度不高体内(至少与该肽的一些其他形式(例如未修饰的H3 3–8)相比,我们仍然相信其作为与H3K4me3结合相互作用的组合增强器的功能重要性,其本身是一种非常重要的低丰度修饰。
蛋白质印迹
蛋白质在18%或4-12%NuPAGE™双三蛋白凝胶(Invitrogen)上电泳,并转移到硝化纤维素膜上。在4°C下与一级抗体(如下所列)孵育过夜之前,总是通过直接蓝色染色(0.1%水溶液,单位为毫升)来确认有效转移(根据使用的一级抗体,所有膜都被5%牛奶或5%牛血清白蛋白封闭)。对于竞争分析,抗体在室温下与指示肽以5:1的肽对抗体浓度预先孵育1小时。在与肽预先孵育后,在室温下将膜与抗体/肽孵育过夜。
然后清洗膜,并用过氧化物酶标记的二级抗体(1:2000–1:10000,取决于使用的一级抗体)孵育。使用Immobilon Western化学发光HRP底物(Millipore)观察带。在适当的情况下,用NIH Image J软件对条带进行量化,并将条带标准化为总组蛋白H3,以控制相等的负载。
肽斑点印迹
在硝酸纤维素膜上滴定时,肽被点缀。将膜干燥约1小时,直到随后在DPBS中再水化并用直接蓝色染色以获得相等的肽负载。然后在5%的牛奶-PBST中封闭膜,并用适当的一级和二级抗体孵育。
国际商会/国际卫生理事会
国际商会
为了评估5-PT的潜在细胞渗透特性,HeLa细胞在12孔组织培养板中培养。在达到约80%的汇合点后,抽吸生长培养基,并在预热的DMEM培养基(10%FBS和1%pen/strep)中应用5-PT(500μM),并在37°C下培养3小时。作为阴性对照,还评估了未经5-PT(仅含载体)处理的细胞。孵育后,从每个孔中取出培养基,并在RT下加入500μl在DPBS中的3.7%甲醛15分钟。然后取出固定剂,用在DPBS中的3%BSA洗涤孔两次。为了使细胞透化,向每个孔中加入500μl在DPBS中的0.5%Triton X-100,并在RT下孵育20分钟。随后用DPBS中3%的BSA清洗微孔。反应混合物由5μM Alexa Fluor picolyl azide™(Thermo Fisher;cat#{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“C10641”,“term_id”:“1535712”,“term_text”:“C10641”}}第10641页)将含有0.1 mM硫酸铜和硫酸铜保护剂预混料(50:50)的Click-iT™反应缓冲液添加到每个孔中,包括阴性对照。然后将平板在RT下孵育30分钟,并保护其免受光照。接下来去除反应混合物,并用DPBS中的3%BSA再次清洗微孔。去除最终清洗液,用DAPI孵育细胞,作为核共染色。使用标准协议执行hPSC/5-HT神经元和RN46A-B14细胞ICC。使用共焦显微镜(蔡司LSM 780或蔡司艾里扫描显微镜)观察免疫荧光。
国际控股公司
经心灌注无菌PBS和2%多聚甲醛(PFA)后,从小鼠脑中收集脑组织。大脑在2%PFA中进一步固定24小时,并在30%蔗糖中再培养2天。使用Leica CM3050 S低温恒温器在40μm处切割固定大脑。在1X TBS中清洗游离DRN切片,然后在RT中封闭1小时。然后在RT中将脑切片与以下主要抗体孵育过夜:H3K4me3Q5ser(1:250)、NeuN(1:1000)、TPH2(Abcam ab121013;1:250)和5-HT(1:5000)。然后在TBS中清洗切片3次,并在4°C下与Alexa Fluor®二级抗体(1:500)孵育过夜。DAPI用作核共染色。使用共焦显微镜(Zeiss LSM 780)观察免疫荧光。
RNA分离和qPCR
细胞颗粒和组织在Trizol(Thermo Fisher;cat#15596026)中均质,并按照制造商的说明进行处理。使用RNeasy微柱(Qiagen;cat#74004)进一步纯化RNA,并且纳米滴分光光度计确认RNA 260/280和260/230的比率大于1.8。使用BioRad iScript试剂盒(目录号1708891)反向转录RNA。使用SYBR Green通过qPCR定量cDNA。每个反应均以技术副本或一式三份的形式进行,并按照ΔΔCt方法进行分析,如前所述,使用适当的标准化控制43。引物序列可在补充数据表34.
染色质免疫沉淀(ChIP)
脑组织和细胞颗粒(10×106/n个)组织交联并淬火。样品在进行分解和超声波处理之前彻底清洗,如前所述24然后将样品与与M-280镝结合的特定抗体(7.5μg/样品)在4°C的旋转器上孵育过夜。第二天,清洗、洗脱和反向交联免疫沉淀物。在RNA和蛋白质消化后,使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化DNA片段。
图书馆准备
DNA和RNA纯化后,根据Illumina协议制备RNA-seq和ChIP-seq文库,并在Illuminia HiSeq2500或4000 Sequencer_High Output mode v4上测序。
ChIP-seq峰值呼叫和差异分析
对于RN46A-B14细胞中的H3K4me3、H3K4me3Q5ser和Taf3 ChIP-seq,使用Bowtiev2.2.0的默认设置将原始测序读数与大鼠基因组(rn6)对齐。仅保留唯一映射的读取。使用SAMtoolsv0.1.19过滤对齐,以删除重复读取。使用MACSv2.1.1执行峰值调用(标准化为各个输入)44使用默认设置并过滤FDR<0.05和折叠变化>1.2;窗口大小设定为300bp。从小鼠大脑(H3K4me3)读取原始序列与。H3K4me3Q5ser)使用HISATv0.1.6b的默认设置与小鼠基因组(mm10)对齐。只保留了唯一映射的读取。使用SAMtoolsv0.1.19对校准进行过滤,以消除重复读取,使用MACSv2.1.1在默认设置下执行峰值调用(归一化为各个输入),并对FDR<0.05和折叠变化>1.2进行过滤。人类PSC的原始测序读数与。使用HISAT2v2.1.0的默认设置,5-HT神经元(H3K4me3Q5ser)与人类基因组(hg38)对齐。同样,只保留唯一映射的读取。使用SAMtoolsv1.8过滤对齐以消除重复读取,使用MACSv2.1.1使用默认设置执行峰值调用(归一化为各个输入),并过滤FDR<0.05和折叠变化>1.2。使用diffReps对H3K4me3和H3K4me3Q5ser(针对所有检测的细胞/组织)进行差异分析19窗口大小为1kb。使用默认的q值截止值0.05,然后使用折叠变化截止值1.2。使用diffReps包中的区域分析工具,将峰和差异位点进一步注释到邻近基因或基因间区域。
RNA-seq分析及其与ChIP-seq的相关性
使用TopHat2v2.1.0将RN46A-B14细胞的原始测序读数映射到rn645。根据Ensembl v81注释,使用HTSeq-count获得映射到基因的读取数。使用DESeq2软件包进行差异表达分析46(v1.6.3),FDR截止值为0.05。使用HISAT v0.1.6b将从小鼠大脑中获得的原始RNA-seq读数映射到mm10。StringTie v1.2.1用于根据Ensembl v84获得基因级FPKM值。使用HISAT2v2.1.0将从人类细胞获得的原始RNA-seq读数映射到人类基因组(hg38)。根据Ensembl v90注释使用HTSeq-count获得基因映射读取数。使用DESeq2软件包(v1.6.3)进行差异表达分析,同样以FDR<0.05为界。基于基因名称将RNA-seq差异列表与ChIP-seq差异列表进行比较,并使用GeneOverlap绘制热图(https://github.com/shenlab-sinai/gene重叠/)包。请注意,使用了一个更为保守的>2.5的折叠变化截止值来生成5-HT神经元/PSC diffReps的比值比热图与。基因表达,以避免在选定的比较中包含假阳性“down”事件。
构造/病毒
H3.3(野生型与。Q5A)-Flag HA(C-Ter)通过聚合酶链式反应和酶限制性内切酶切克隆到pCDH RFP载体中。纯化后的质粒被送往GENEWIZ进行序列验证。然后将H3.3-pCDH-RFP质粒送往Cyagen Biosciences进行慢病毒包装。表达NLS标记野生型或突变型(W241A)人类TGM2的pShooter pCMV/nuc/myc载体47由盖尔·约翰逊博士(罗切斯特大学医学中心)亲切提供。
RN46A-B14病毒感染
分化前,将RN46A-B14细胞分裂并接种于~0.7–0.8×106在涂有基质凝胶的10cm组织培养板上的密度,并在前面描述的分化培养基中生长。在第1天,在生长培养基中用慢-H3.3 WT或慢-H3.3Q5A(1:1000稀释)转导细胞。第4天,细胞接受条件培养基改变(1:1)。分化后,用0.05%胰蛋白酶离心收集RN46A-B14细胞,多次洗涤并在无钙的Dulbecco PBS(DPBS)中冰块上重建RNA-seq,或固定在盖玻片上进行显微镜评估。
RN46A-B14轴突长度评估
用RFP、HA和DAPI抗体对病毒感染的固定细胞进行神经生长分析(RFP用于长度评估)。以盲法对细胞进行成像。由于RN46A-B14细胞以线性杆状构象生长,因此使用ImageJ软件测量了总轴突长度(即每个细胞的长度总和)。
一般统计和研究设计
进行单向方差分析,以确定涉及两种以上治疗条件的实验的显著性(与随后的Dunnett’s事后(post-hoc)测试)。除Tgm2i qPCR外,所有其他统计比较均采用双尾学生t检验(使用了单尾学生的t检验)。对于没有统计数据的数据,除非另有说明,否则实验重复多次(通常≥3次)以确保再现性。所有涉及统计的数据均以平均值±SEM表示。
样本量、随机化和盲法
根据样本间变异性确定足够的样本量。在整个手稿中,我们基于95%的一般置信区间来确定结果的重要性。在适当的情况下,将细胞或动物随机分为组(根据分化条件、化合物/药物/病毒治疗和/或基因型进行分离)。此外,从动物身上采集的用于ChIP-seq分析的组织被随机汇集,以提供充足的组织用于生化程序,并将差异降至最低。必要时,研究人员对基因型、病毒治疗条件等条件不了解。
参与者信息
Lorna A.Farrelly,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
罗伯特·汤普森,美国新泽西州普林斯顿市普林斯顿大学化学系08540。
赵帅,北京结构生物学高级创新中心,教育部蛋白质科学重点实验室,清华大学医学院基础医学系,北京100084,中国,清华大学清华-北京生命科学联合中心,北京100084。
Ashley E.Lepack,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
杨柳,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
纳塔拉詹·巴努,美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系表观遗传学研究所,宾夕法尼亚州费城,邮编:19104。
张柏超,北京结构生物学高级创新中心,教育部蛋白质科学重点实验室,清华大学医学院基础医学系,北京100084,中国,清华大学清华-北京生命科学联合中心,北京100084。
Yong-Hwee E.Loh,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
Aarthi Ramakrishnan,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
克里希纳·C·瓦多达里亚,美国加州拉霍亚索尔克生物科学研究所遗传学实验室,邮编92037。
Kelly J.Heard,美国加州拉霍亚索尔克生物科学研究所遗传学实验室,邮编92037。
加利娜·埃里克森,美国加州拉霍亚索尔克生物科学研究所遗传学实验室,邮编92037。
中田聪,美国纽约州洛克菲勒大学生物化学与分子生物学实验室,邮编:10065。
Ryan M.Bastle,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
布拉德利·J·卢卡萨克,普林斯顿大学化学系,美国新泽西州普林斯顿08540。
亨利·泽布罗斯基,三世,美国纽约州纽约市洛克菲勒大学蛋白质组学资源中心。
纳塔利娅·阿列尼娜,德国柏林13125号Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine(MDC)。
迈克尔·巴德,德国柏林13125号Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine(MDC)。
奥利维尔·伯顿,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
罗伯特·罗德,美国纽约州洛克菲勒大学生物化学与分子生物学实验室,邮编:10065。
亨利克·莫利纳,美国纽约州纽约市洛克菲勒大学蛋白质组学资源中心。
弗雷德·盖奇,美国加州拉霍亚索尔克生物科学研究所遗传学实验室,邮编92037。
李深,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029。
本杰明·加西亚,美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系表观遗传学研究所,宾夕法尼亚州费城,邮编:19104。
李海涛,北京结构生物学高级创新中心,教育部蛋白质科学重点实验室,清华大学医学院基础医学系,北京100084,中国,清华大学清华-北京生命科学联合中心,北京100084。
汤姆·W·缪尔,美国新泽西州普林斯顿市普林斯顿大学化学系08540。
伊恩·梅泽,美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所费斯伯格神经科学系,邮编:10029;美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院药理学系,邮编:10029。