癌症相关成纤维细胞通过调节顺铂耐药性澳大利亚安盛银行3在肺癌细胞中

2.2. 细胞培养

人类肺癌细胞系A549、H661和SK‐MES‐1购自美国类型培养库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞在DMEM培养基（GIBCO BRL，Grand Island，NY，USA）中生长并保持在37°C，5%CO₂培养基中添加10%FBS。

2.3. 基质成纤维细胞的分离培养

如前所述，从原发肿瘤组织中分离出肿瘤相关成纤维细胞。¹¹CAF在DMEM/F12培养基中培养，添加10%FBS，37°C，5%CO₂为了制备CAF条件培养基（CAF‐CM），CAF培养48小时；收集CAF‐CM并在1500℃下离心10分钟克去除细胞碎片。所有体外实验均进行三次，CAF小于10代。

肺癌组织取自天津医科大学总医院（中国天津TMUGH）的患者，他们接受了手术，没有化疗治疗史。收集和使用标本时，所有患者都获得了知情同意，该研究得到了TMUGH机构审查委员会的批准。

2.4. 细胞活力测定

按照制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8（CCK‐8，日本熊本道津道）评估细胞活力。简单地说，肺癌细胞的密度为8‐10×10^三96孔板中的细胞/孔；然后用0‐80μmol/L CDDP处理48小时。CCK‐8检测细胞活力，中位抑制浓度IC₅₀使用GraphPad Prism 5.0软件（美国加利福尼亚州La Jolla）计算值。

2.5. 流式细胞术评估细胞凋亡

用CDDP处理肺癌细胞24小时。治疗后，按照制造商的说明，使用Annexin V‐FITC凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）检测凋亡细胞。简单地说，用PBS清洗细胞并将其重新悬浮在结合缓冲液中。然后将Annexin V‐FITC和PI添加到细胞中，然后在室温下黑暗培养15分钟。在FACSAria流式细胞仪上进行凋亡分析（Becton Dickenson，San Jose，CA，USA）。

2.6. RNA干扰和转染

siRNA双链体购自Genepharma（中国上海）。ANXA3的siRNA双链序列为：5′-GG‐ACAAGCGCAAAUGAATT‐3′，反义：5′-UUCAUUGUCUCCTT‐3'。将肺癌细胞以2.5×10的密度接种到6孔板中⁵细胞/孔，用含有Lipofectamine 2000（Invitrogen，California，USA）的siRNA双工体转染，并在进一步分析之前培养48小时。

我们自己构建了pcDNA3.1（+）‐ANXA3质粒。将肺癌细胞以2.5×10的密度镀入6孔板⁵细胞/孔；用Lipofectamine 2000将2μg pcDNA3.1（+）‐ANXA3转染到A549和H661细胞中，并在进一步分析之前培养48小时。

2.7. 定量聚合酶链反应

使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从细胞或组织中提取总RNA。根据制造商的说明，使用TaKaRa试剂盒（中国大连）进行逆转录。使用Power SYBR Green Master Mix（ABI，Foster City，CA，USA）在ABI Prism 7900HT序列检测系统（ABI）上通过定量PCR（qPCR）测量基因表达。ANXA3的引物为：正向ACAGCGACTGTTA；背面为TCACTAGGCCACGATGAGA。如前所述进行PCR反应，¹²在以下条件下：95°C持续10分钟，然后进行40次95°C循环15秒和60°C循环34秒。GAPDH被用作内部控制。

2.8. 蛋白质印迹

如前所述进行蛋白质印迹。¹³简单地说，使用含有蛋白酶抑制剂（Sigma‐Aldrich）的RIPA裂解缓冲液从细胞中提取蛋白质。通过运行12%的SDS‐PAGE分离蛋白质，并转移到硝化纤维素膜上（Millipore，Bedford，MA，USA）。在室温下，用5%的脱脂牛奶封闭膜1.5小时。然后在4°C下用一级抗体探测细胞膜过夜，并在37°C下与HRP偶联二级抗体进一步孵育1.5小时。最后，按照制造商的说明，使用ECL Western Blotting System对蛋白质带进行可视化。

2.9. RNA测序

从CAF和NF中提取总RNA使用RNeasy Kit（Qiagen），如下所示制造商的说明。BGI（中国深圳）在BGISEQ‐500上进行了RNA测序。

2.10. 体内肿瘤研究

BALB/c裸鼠取自中国医学科学院肿瘤研究所（中国北京）。异种移植实验按照天津医科大学动物护理和使用委员会的指导方针进行。每个治疗组由5只小鼠组成；3 × 10⁶A549电池或3×10⁶A549细胞与9×10混合⁶将CAF（比例1:3）重新悬浮在100μL PBS中，并皮下注射到小鼠体内。注射后1周开始，每周测量肿瘤质量，肿瘤体积计算为：体积（mm^三)=天²×D/2，其中D和D是最短和最长的直径。当肿瘤体积达到约50 mm时^三，小鼠用CDDP（3 mg/kg体重）治疗，而对照组用生理盐水治疗。6周后，处死小鼠，解剖肿瘤组织并提取mRNA和蛋白。

3.2. 癌症相关成纤维细胞提高肺癌细胞中ANXA3的表达水平

肿瘤相关成纤维细胞和核因子根据其基因表达谱具有不同的特征和作用。我们通过应用RNA序列（RNA-Seq）方法比较了CAF和NF之间的mRNA表达谱。我们的RNA-Seq数据显示，与NF相比，CAF中有219个基因上调，而与NF比较，CAF的158个基因下调（图2A） ●●●●。基因本体分析将这些调控基因分为三类：生物过程、细胞成分和分子功能（图2B） ●●●●。在生物过程类别中，大多数基因与细胞和单有机体过程有关；在细胞成分类别中，大多数基因与细胞部件和细胞器有关；在单有机体过程类别中，大多数基因与结合和催化活性有关。

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图2

癌症相关成纤维细胞(CAF公司)提高了澳大利亚安盛银行3在肺癌细胞中。A、 B，基因表达CAF公司和正常成纤维细胞(法国试验标准)由评估核糖核酸‐顺序。进行差异基因表达和本体论分析。C、 的表达式澳大利亚安盛银行3对CAF公司和法国试验标准western blotting检测。D、 信使核糖核酸的表达式澳大利亚安盛银行3对CAF公司和法国试验标准被检测到定量PCR.E，表示澳大利亚安盛银行western blotting检测肺癌细胞株中3个。F、 的表达式澳大利亚安盛银行3在肺癌细胞中CAF公司‐厘米被western blotting检测到

因为CAF增强了肺癌细胞对顺铂的耐药性，所以我们重点关注参与肿瘤发展的上调基因。我们发现ANXA3在CAF中上调。为了验证RNA-Seq结果，我们进行了western blot和qPCR分析，以确定ANXA3的表达。与RNA-Seq的结果一致，CAF中ANXA3的蛋白和mRNA水平均显著升高（图2C、 D）。

为了确定CAF是否影响肺癌细胞中ANXA3的表达，我们首先检测了A549、H661和SK‐MES‐1细胞系中的ANXA3表达。我们的结果表明，ANXA3在所有3种细胞系中均表达，并且ANXA3的表达水平在SK‐MES‐1细胞中远高于A549和H661细胞（图2E） ●●●●。接下来，我们用CAF‐CM培养A549、H661和SK‐MES‐1细胞，并测定肺癌细胞中ANXA3的表达。图2F表明，CAF‐CM孵育显著增加了所有3种肺癌细胞株中mRNA和蛋白水平的ANXA3水平。

尽管CAF‐CM孵育增加了肺癌细胞中的ANXA3水平，但我们需要进一步证明癌细胞中ANXA3的增加是否是由于CAF中的ANXA3分泌所致。我们通过过度表达或RNAi敲低来控制CAF中的ANXA3水平。我们发现，当ANXA3在CAF中过度表达时，其在肺癌细胞中的水平相应增加（图三A） ；然而，当RNAi敲除降低ANXA3水平时，其在肺癌细胞中的水平也降低了（图三B） ●●●●。此外，我们在培养基中操纵了ANXA3水平。将ANXA3重组蛋白添加到培养基中，以模拟含有ANXA3的CAF‐CM。图三C表明ANXA3重组蛋白提高了癌细胞中ANXA3的水平。我们进一步将ANXA3中和抗体添加到CAF‐CM中，我们发现阻断CAF中的ANXA3分泌可减弱ANXA3上调（图三C） ●●●●。这些结果表明，癌细胞中ANXA3水平通过CAF中的ANXA3分泌而升高。

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图3

提升的表达澳大利亚安盛银行3在肺癌细胞中的表达是由澳大利亚安盛银行3癌相关成纤维细胞分泌(CAF公司). A、 B、，焦虑症3例过度表达或敲除CAF公司，的CAF公司‐厘米收集并与肺癌细胞孵育。的表达式澳大利亚安盛银行western blotting检测肺癌细胞中3个。C、 重组澳大利亚安盛银行3已添加到DMEM公司和肺癌细胞一起孵育。的表达式澳大利亚安盛银行western blotting检测肺癌细胞中3个。澳大利亚安盛银行将3个中和抗体（500 ng/mL）添加到CAF公司‐厘米和肺癌细胞一起孵育。的表达式澳大利亚安盛银行western blotting检测肺癌细胞中3个

3.3. ANXA3介导癌相关成纤维细胞对肺癌细胞顺铂耐药性的影响

为了研究ANXA3在CAF增强化疗耐药中的作用，我们对肺癌细胞中ANXA3的表达进行了调控。由于A549和H661细胞表达较低水平的ANXA3，而SK‐MES‐1细胞表达较高水平的ANXA3，因此我们在A549和H661细胞中过度表达了ANXA3。然后用顺铂治疗肺癌细胞。在图中4很明显，ANXA3的过度表达显著增强了耐药性，IC₅₀A549细胞从14.63μmol/L增加到28.94μmol/L，H661细胞从11.76μmol/L增加到36.83μmol/L。相反，ANXA3敲除增加SK‐MES‐1细胞的敏感性；集成电路₅₀从21.40μmol/L降至10.23μmol/L.接下来，我们将ANXA3中和抗体添加到CAF‐CM中，我们发现CAF中ANXA3分泌的阻断减弱了CAF引起的癌细胞对顺铂的耐药性（图5). 总之，这些结果表明，CAF通过上调肺癌细胞中ANXA3的表达增强了顺铂抵抗。

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图4

澳大利亚安盛银行3介导癌相关成纤维细胞对肺癌细胞顺铂耐药性的影响。A、 A549和H661细胞转染pANXA公司3，和SK公司‐人工编码站‐1个细胞被转染澳大利亚安盛银行3-硅核糖核酸双工；澳大利亚安盛银行3的表达通过蛋白质印迹进行分析。B、 C，用0‐80μmol/L顺铂处理转染细胞48 h后，通过CCK公司‐8分析。数值代表平均值±标准偏差来自3个独立实验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001

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图5

癌症相关成纤维细胞(CAF公司)增强肺癌细胞对顺铂的耐药性。肺癌细胞在CAF公司‐厘米具有澳大利亚安盛银行3中和抗体（500 ng/mL），用0‐80μmol/L顺铂处理48小时。通过以下方法检测细胞活力CCK公司‐8分析。数值代表平均值±标准偏差来自3个独立实验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001

3.4. 癌症相关成纤维细胞通过上调ANXA3激活JNK/survivin通路

大量研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在细胞增殖、细胞存活和耐药性中起着重要作用。JNK是MAPK家族的成员，与肿瘤的发展密切相关。这促使我们探索CAF对JNK通路的影响。

用顺铂治疗肺癌细胞，有无CAF‐CM预处理。与单纯顺铂治疗相比，CAF‐CM显著增加了ANXA3和p‐JNK的表达。相反，CAF‐CM降低了凋亡相关基因裂解caspase 8和caspase 3以及survivin的表达，后者被顺铂激活（图6A） ●●●●。我们在A549和H661细胞中进一步过表达ANXA3，然后用顺铂处理细胞。我们发现ANXA3升高了p-JNK水平，降低了裂解的caspase-8、caspase-3和survivin水平，其作用与CAF相似。然而，当SK‐MES‐1细胞中ANXA3表达被RNAi降低时，JNK激活被抑制，顺铂对caspases激活的作用被逆转（图6B） ●●●●。

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图6

癌症相关成纤维细胞(CAF公司)激活了JNK公司/survivin通路上调焦虑症3.A、A549和H661细胞与CAF公司‐厘米24小时，然后用15μmol/L顺铂处理36小时。蛋白质表达用蛋白质印迹法检测。B、 A549和H661细胞转染pANXA公司三。SK公司‐人工编码站‐1个细胞被转染澳大利亚安盛银行3‐硅核糖核酸双联，然后用15μmol/L顺铂处理36小时。western blotting检测蛋白表达

为了进一步评估JNK/survivin信号通路在CAF对顺铂耐药的影响中的作用，我们通过用JNK特异性抑制剂预处理肺癌细胞来抑制JNK活性SP600125型1小时，然后用CAF‐CM培养细胞。我们发现抑制JNK可以有效地消除CAF或ANXA3对顺铂耐药性的影响（图7A、 B）和JNK/survivin通路的激活（图7C） 在肺癌细胞中。

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图7

JNK公司/Survivin途径介导癌相关成纤维细胞的作用(CAF公司)肺癌细胞对顺铂的耐药性。A、 A549和H661细胞在CAF公司‐厘米并用2μmol/L预处理JNK公司抑制剂服务提供商600125持续1 h，然后用0‐40μmol/L顺铂治疗48 h。通过以下方法检测细胞活力CCK公司‐8分析。B、 A549和H661细胞转染pANXA公司3和预处理2μmol/L服务提供商600125治疗24小时，然后用0‐40μmol/L顺铂治疗48小时。细胞活力通过CCK公司‐8分析。C、 蛋白质表达通过western blotting检测。D、 细胞用Annexin染色/圆周率治疗后用流式细胞仪检测凋亡细胞。数值代表平均值±标准偏差来自3个独立实验*P（P） < 0.05; **P（P）<0.01***P（P） < 0.001

流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡的作用。我们的结果表明，CAF有效地保护细胞免受顺铂诱导的凋亡，而JNK特异性抑制剂对JNK的抑制可延缓这种作用（图7D） ●●●●。总之，这些结果表明，CAF通过ANXA3上调激活JNK/survivin通路，增强了肺癌细胞的顺铂耐药性。