p53有助于缺乏葡萄糖的细胞存活7，我们研究了去除正常培养基中发现的其他营养物质是否会导致p53的差异反应+/+和p53−/−HCT116细胞。去除非必需氨基酸丝氨酸和甘氨酸会损害p53的增殖+/+细胞，p53−/−细胞的增殖能力明显下降()并严重丧失生存能力(). 在RKO细胞中也观察到p53在丝氨酸和甘氨酸缺乏期间对生长和存活的作用(补充图2a-c)和主要MEF(补充图2d). 通过单独去除丝氨酸或甘氨酸，我们确定丝氨酸缺失是饥饿表型的主要原因()，因为仅去除甘氨酸不会产生有害影响。虽然丝氨酸和甘氨酸可以通过SHMT相互转化，但丝氨酸到甘氨酸的转化通过甲基四氢叶酸（THF）的产生支持增殖(补充图1). 然而，相反的反应（甘氨酸到丝氨酸）消耗甲基-THF，这可能是为什么过量甘氨酸被证明抑制增殖的原因9,10正如预期的那样，去除赖氨酸（一种必需氨基酸）不会引起差异反应，这与p53的增殖同样不相容+/+和p53−/−单元格(补充图2e)。
p53在丝氨酸饥饿期间促进细胞存活和增殖在体外和体内一HCT116细胞生长在完全培养基（含丝氨酸和甘氨酸）或缺乏这些氨基酸的等效培养基中（三个重复孔的平均数）。b条，HCT116细胞的活性通过分析G1以下DNA含量（n=3）和c（c），PI排除（n=3）。d日使用LC-MS测定喂食完整培养基的HCT116细胞的丝氨酸相对消耗量（三个微孔的平均值与新鲜培养基的平均值）。e（电子），裸鼠皮下注射HCT116细胞（p53+/+右侧，p53−/−左翼）；饮食中添加或不添加丝氨酸和甘氨酸。绘制肿瘤体积图，直到每组第一只动物达到实验终点（*p<0.05，对照饮食组vs.–Ser和Gly组；**p53 p<0.05+/+与p53相比−/−内部–Ser&Gly组）。（f）、饮食组实验终点前的Kaplan-Meier生存率曲线图（平均生存率；对照组=33.3天（n=10），-Ser&Gly=53.2天（n=8），对数秩p=0.001，Wilcoxon p=0.003）。克，糖酵解和SSP基因的表达（三重qPCR的平均值）。小时，喂食含有U的丝氨酸和甘氨酸缺陷（−）培养基的HCT116细胞中的细胞内丝氨酸水平-13C-葡萄糖通过LC-MS测量（三个孔的平均值）。所有误差条均为SEM。
通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析细胞培养基，发现p53快速消耗丝氨酸+/+和p53−/−单元格()而甘氨酸摄取量低(补充图2f). 最近对NCI-60癌细胞株的筛选显示，SHMT表达升高和甘氨酸摄取增加与快速增殖相关11值得注意的是，所有60个品系的丝氨酸消耗量均大于甘氨酸，其中7个品系加倍时间最短（<22h），平均丝氨酸消耗是甘氨酸的7.7倍11此外，倍增时间最短、甘氨酸摄取量最高的细胞也消耗了大部分可用丝氨酸11这增加了这些高增殖细胞转换为消耗甘氨酸的可能性，因为它们耗尽了可用的丝氨酸。总的来说，这表明癌细胞贪婪地消耗丝氨酸，丝氨酸可能通过SHMT的高表达转化为甲基-THF和甘氨酸。
与必需氨基酸不同，非必需氨基酸的长期消耗是可以容忍的体内.小鼠对缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食耐受性良好(补充图3a)LC-MS证实血清丝氨酸和甘氨酸水平显著下降，但其他氨基酸水平没有下降(补充图3b). 在喂食对照饮食的动物中，HCT116细胞迅速形成肿瘤，p53之间的肿瘤体积没有显著差异+/+和p53−/−肿瘤(). 然而，喂食缺乏丝氨酸和甘氨酸的匹配饮食的动物显示两种基因型的肿瘤体积显著减少，并且在肿瘤大小或溃疡终点之前存活的时间显著延长(). 与我们的在体外研究表明，丝氨酸和甘氨酸饥饿对p53的影响更大−/−与p53相比，异种移植物体积显著减少+/+丝氨酸和甘氨酸缺乏动物的肿瘤()。
哺乳动物细胞合成丝氨酸从头开始通过将糖酵解中间体3-磷酸甘油酸导入合成的“磷酸化途径”12，通量主要由丝氨酸需求控制13(补充图1). SSP通过提供蛋白质、核苷酸、肌酸、卟啉、磷脂和谷胱甘肽生物合成的前体来支持合成代谢，SSP在一些乳腺癌中上调14,15,16最近的一项研究表明，丝氨酸饥饿激活SSP17; 我们发现，丝氨酸饥饿诱导PHGDH和PSAT1的p53依赖性上调，PSPH适度增加(,补充图4a和b). p53的失败−/−因此，在丝氨酸饥饿期间增殖的细胞不能归因于SSP酶表达不足。p53已被证明下调PGAM18–可能会将3-磷酸甘油输送至SSP。然而，在丝氨酸饥饿过程中，PGAM的表达变化不大(补充图4a和b). 与激活SSP的能力一致，p53+/+和p53−/−已实现的单元格从头开始丝氨酸合成，使用U检测-13-C-葡萄糖标记(). 然而，p53−/−细胞丝氨酸水平较低，表明这些细胞适应能力存在缺陷从头开始丝氨酸合成。因此，我们试图探索细胞适应丝氨酸饥饿的机制。
mTOR通路感知氨基酸的可用性，虽然丝氨酸饥饿降低了mTORC1活性，但p53中的mTORC2活性保持在非常相似的水平+/+和p53−/−单元格(补充图5). 这表明丝氨酸饥饿对mTORC1的影响是p53依赖性的，因此不太可能促进p53敏感性的增强−/−细胞。最近发现丝氨酸标记细胞中mTORC1活性的类似维持，并通过PKM2表达促进17.丝氨酸激活PKM219丝氨酸饥饿后PKM2活性降低导致上游糖酵解中间体的积累，从而转移到SSP20为了平衡PKM2抑制后较低的糖酵解，细胞增加丙酮酸进入TCA循环的流量，需要缺乏PKM的细胞显示出增加的O2支持升高OXPHOS的消耗20.两个p53+/+和p53−/−细胞显示磷酸烯醇丙酮酸（PEP）水平升高，丙酮酸和乳酸水平降低，表明丝氨酸饥饿后PKM2活性降低(). 线粒体ATP合酶抑制剂寡霉素的治疗证明了氧合酶在丝氨酸饥饿期间的重要性()它完全抑制丝氨酸衍生p53的生长+/+细胞。由于p53支持OXPHOS三,21,22，我们考虑了p53−/−细胞无法在丝氨酸饥饿时上调OXPHOS。
丝氨酸饥饿不同程度地改变p53的能量代谢+/+和p53−/−细胞一在U-13最后2小时的C-葡萄糖。使用LC-MS检测糖酵解中间产物的相对细胞内数量（三个孔的平均值）。b条HCT116细胞在添加或不添加丝氨酸、甘氨酸和寡霉素1ng/ml的情况下生长（平均三个孔）。c（c）测定HCT116细胞在48小时丝氨酸和甘氨酸饥饿后的耗氧率（n=3，*p<0.05）。d日HCT116细胞中TCA循环中间产物的相对细胞内水平，HCT116缺乏丝氨酸和甘氨酸（在U的持续存在下-13C-葡萄糖）通过LC-MS（三个重复孔的平均值）进行分析，并且e（电子），在长期饥饿后，与U-13最后一小时添加的C-葡萄糖（三个重复微孔的平均值）。（f）测定HCT116细胞（n=3）的ATP水平。克，HCT116 p53−/−（1ex）细胞生长在完整培养基或缺乏丝氨酸和甘氨酸的培养基中，无论是否含有5mM丙酮酸（平均三个孔）。所有误差条均为SEM。
正如预期，p53−/−细胞显示较低的O2消耗量大于p53+/+细胞在喂养条件下。令人惊讶的是，p53−/−细胞对丝氨酸饥饿的反应是O增加2消耗，而p53+/+细胞显示较低的O2消费(). 对TCA循环的代谢流量进行更深入的分析表明+/+和p53−/−在丝氨酸饥饿的即时反应中，细胞糖酵解TCA循环流量增加，p53的这种反应随时间而逆转+/+细胞，但在p53中维持−/−单元格(). 这与O的变化有关2丝氨酸饥饿期间观察到的消耗，表明p53的初始反应+/+和p53−/−丝氨酸耗竭类似，但p53−/−细胞维持一种表明PKM2活性低的代谢模式，包括O升高2消费。
我们预测，对丝氨酸饥饿的即时反应中糖酵解的中断会阻碍ATP的生成，实际上，两个p53中的ATP水平都会下降+/+和p53−/−单元格(). 我们认为，随着丝氨酸饥饿降低丙酮酸的糖酵解通量，增加丙酮酸水平（通过添加外源丙酮酸）可能会通过进一步增加TCA循环的通量来缓解ATP短缺。我们观察到p53的增殖明显恢复−/−添加丙酮酸后的细胞(). 丝氨酸标记p53的LC-MS分析−/−喂食未标记丙酮酸的细胞（存在U-13-C-葡萄糖）证实TCA循环流量增加(补充图6). 然而，这种增强的TCA循环流量不足以完全恢复增殖()。
丝氨酸有助于通过甘氨酸合成嘌呤，甘氨酸通过IMP并入GMP和AMP。丝氨酸饥饿导致p53中的GMP和AMP水平降低+/+和p53−/−单元格(). 先前的研究表明，GMP缺失可以激活p53依赖性G1阻滞23,24一直以来，我们发现丝氨酸饥饿导致p53表达轻微升高，同时伴随着p53靶蛋白p21更显著但短暂的升高(). p53的治疗+/+低剂量麦考酚酸（GMP合成抑制剂）的细胞复制了这种微妙的p53-p21反应(补充图7a和b). 染色质免疫沉淀法证实了丝氨酸饥饿期间p53向p21启动子的募集(). 由于只观察到p53表达的适度增加，我们推测p53是通过翻译后修饰激活的，而不是Mdm2抑制。虽然我们的数据与核苷酸耗竭引起的p53激活一致，但AMPK的激活(补充图7c)由于ATP水平较低，也可能导致p53反应7。
丝氨酸饥饿导致p53向p21启动子募集并激活短暂的p21依赖性G1阻滞一，LC-MS用于量化丝氨酸和甘氨酸喂养（Com）和饥饿（-SG）HCT116细胞（三个孔的平均值）中细胞内嘌呤核苷酸GMP和AMP的总相对量。b条p53和p21蛋白表达在p53中定量+/+HCT116细胞经western blot和红外结合二级抗体检测（n=3）。c（c）对p53进行染色质免疫沉淀（ChIP），qPCR检测两个p53响应元件（-2350bp和-1450bp）和p21启动子的转录起始区（+50bp）（n=3）。d日用BrdU标记、PI染色、流式细胞仪检测细胞周期（n=3）。e（电子），p21在p53中被瞬时敲除+/+使用si-RNA的HCT116细胞（三个重复孔的平均值）。（f），p21−/−HCT116细胞（保留野生型p53+/+)在含有或不含有丝氨酸和甘氨酸的培养基中生长（三次孔的平均值）。所有误差条均为SEM。
正如预期的那样，p53激活后+/+缺乏丝氨酸和甘氨酸的细胞最初表现为G1期细胞聚集和S期细胞减少，这与p21表达增加有关(). 48小时后，这些细胞恢复正常的细胞周期。相比之下，p53−/−细胞未能建立强烈的G1阻滞，显示S期逐渐减少（对应于亚G1细胞的增加-)并且没有恢复正常的细胞周期(). 因为p21是p53诱导G1期阻滞的主要介导者25，我们检测了p53中p21缺失的影响+/+细胞。p21−/−细胞表现出与p53相似的细胞周期反应−/−单元格()这表明p21的诱导可能是适应丝氨酸饥饿的关键。事实上，p53+/+siRNA缺失p21的细胞在没有丝氨酸的情况下无法增加数量（类似于p53−/−细胞，)p21基因缺失的细胞的反应更为剧烈()。
接下来我们考虑了p53是否+/+和p53−/−细胞在饥饿条件下利用低水平的细胞内丝氨酸的方式不同。我们特别分析了嘌呤核苷酸和谷胱甘肽合成之间的平衡，这两者都需要丝氨酸/甘氨酸。LC-MS显示24小时后，p53−/−细胞保留通量从头开始丝氨酸/甘氨酸转化为IMP（M+7），但这在p53中被抑制+/+单元格(). 用U重新喂入丝氨酸保护细胞-13C、，15N-L-丝氨酸证实了p53中丝氨酸持续流入IMP、GMP和AMP−/−单元格(补充图8a). 然而，在丝氨酸标记的p53中+/+尽管细胞内丝氨酸丰富，但补充的标记丝氨酸到核苷酸的通量被阻断。这表明p53-p21诱导的细胞周期阻滞对丝氨酸饥饿反应的一个特征是抑制核苷酸合成，这是p21的一个已知功能26,27还原型谷胱甘肽（GSH）是主要的细胞抗氧化剂，我们发现p53中的GSH水平显著下降+/+和p53−/−丝氨酸标记细胞(). 然而，与核苷酸相比，p53+/+在饥饿期间，细胞维持并随着时间的推移增加了谷胱甘肽合成的通量。引人注目的是，这种谷胱甘肽通量的维持在p53中没有发现−/−和p21−/−细胞(&补充图8b). 因此，p53的总GSH水平恢复+/+但不是p53−/−或p21−/−细胞(&补充图8c)。
p53-p21激活使丝氨酸缺失的细胞优先于核苷酸合成谷胱甘肽一，LC-MS用于检测IMP和b条HCT116细胞经完整培养基（Com）或缺乏丝氨酸和甘氨酸的培养基（-SG）培养24小时，U存在-13最后2小时的C-葡萄糖，以及c（c），在U在场的情况下，在指定的时间内给SG介质-13最后一小时的C-葡萄糖（三个重复微孔的平均值）。d日HCT116细胞在含有或不含有丝氨酸和甘氨酸的情况下生长，或e（电子）在缺乏丝氨酸和甘氨酸的培养基中加入5mM谷胱甘肽（GSH），在过氧化氢（H）存在下培养48小时2O（运行）2)最后24小时。（f）用氧化活化荧光染料处理HCT116细胞，并进行流式细胞术分析。克，HCT116 p53−/−（1ex）细胞在含有或不含有丝氨酸、甘氨酸、丙酮酸5mM（Pyr）和/或GSH 5mM或N-乙酰半胱氨酸0.2mM（NAC）的情况下生长（三个孔的平均值）。所有误差条均为SEM。
p53的失败−/−细胞恢复谷胱甘肽水平的同时也增加了耗氧量，这表明这些细胞会积累增加的胞内活性氧水平。p53具有良好的抗氧化功能1,6，但过氧化氢处理表明p53−/−细胞只比p53稍敏感+/+正常情况下的氧化应激(). 虽然丝氨酸和甘氨酸饥饿增加了这两种基因型对过氧化氢处理的敏感性，但这种影响在p53中更为显著−/−单元格()，并通过添加GSH进行救援(). 氧化活化荧光染料染色证实p53细胞内活性氧增加−/−丝氨酸饥饿期间的细胞(&补充图9a). 为了评估活性氧在限制增殖中的重要性，我们测试了外源性谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸的影响。而单独抗氧化剂治疗可适度改善丝氨酸保护型p53的增殖−/−细胞，其中一种ROS抑制治疗几乎完全挽救了丝氨酸保护型p53的增殖−/−细胞与丙酮酸结合(). 我们证实外源性谷胱甘肽不会导致细胞内甘氨酸或丝氨酸的积累，这表明通过增加细胞内谷胱甘氨酸库可以实现解救(补充图9b). 将谷胱甘肽添加到丝氨酸保护的p53中+/+细胞并没有显著促进增殖，支持了p53的理论+/+细胞能够独立维护GSH池(补充图9c)。
因此，我们的数据显示p53的敏感性−/−细胞对丝氨酸的消耗是由于糖酵解受损和活性氧升高共同作用的结果。尽管有或无p53的细胞对丝氨酸缺失的初始反应相似，但p53+/+细胞经历p21依赖性G1阻滞，允许有限水平的从头开始丝氨酸被引导至谷胱甘肽生产以对抗氧化应激。p21的缺失（同时保留p53）导致对丝氨酸缺失的严重敏感性()这表明p53反应的其他臂的激活可能导致这些细胞的死亡。我们的数据还表明，p53缺陷细胞参与更高速率OXPHOS的能力并不完全缺陷，但这些细胞中的OXPHOS可能受到防止ROS生成的要求的限制。这一观察结果与癌细胞采用有氧糖酵解（Warburg效应）以避免代谢活性氧生成的建议相一致28最近有研究表明，活性氧水平升高抑制PKM229，解释了为什么p53−/−在丝氨酸饥饿期间，细胞表现出持续的PKM2抑制。
总之，我们的研究强调了p53在代谢应激反应中协调代谢重塑的重要性。我们证明丝氨酸摄取支持Warburg效应，表明许多癌细胞可能对丝氨酸耗竭表现出一定的敏感性，尤其是那些缺乏p53的癌细胞。然而，很可能其他基因改变（如PHGDH扩增14-16)可能绕过其他癌细胞中的丝氨酸依赖性。综上所述，我们的工作表明了丝氨酸耗竭的治疗效用——或者通过从饮食中去除丝氨酸，或者通过酶耗竭体内或其他方式–值得进一步调查。
方法
细胞培养
除非另有说明，否则化学品来自Sigma-Aldrich，细胞培养试剂来自Gibco（Invitrogen）。HCT116 p53+/+/p21+/+[父母]，p53−/−（1ex）【p53外显子2缺失】，p53−/−（3ex）【p53外显子2、3和4的缺失】、p21−/−和RKO p53+/+和p53−/−这些细胞是B.Vogelstein教授（约翰霍普金斯大学）送的礼物30.垃圾匹配野生型和p53−/−MEF（传代<4）是从配对p53的E14.5胚胎中制备的+/负极老鼠31（C57Bl6/J背景，>20代）。将细胞保存在37°C的加湿5%CO中2在空气中，HCT116和RKO细胞储存在含有2mM L-谷氨酰胺和10%FBS的McCoys 5A培养基（26600）中（PAA实验室）。在实验中，细胞接种在含有10%FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM（21969）中。配制完整（Com）培养基，以密切匹配DMEM的营养成分（含0.4mM丝氨酸和0.4mM甘氨酸）；完整培养基包括补充了1×MEM维生素（11120）的MEM（21090）、10%透析的FBS（Hyclone，Thermo Scientific）、2mM的L-谷氨酰胺、额外的D-葡萄糖（至25mM）、0.4mM的丝氨酸和0.4mM甘氨酸。在饥饿实验中，细胞被喂食相同的培养基配方，不含丝氨酸和甘氨酸（-SG培养基）。
增殖测定
HCT116和RKO细胞接种在24孔板（8×10）中4/well），12孔板中的MEF（p53+/+2 × 104/嗯，p53−/−1 × 104/井）在DMEM中培养，并使其生长16-24h。然后用PBS清洗细胞，并接受补充有规定营养素和/或药物的完整或-SG培养基。为了保持恒定的营养水平并去除从死细胞中释放出来的营养物质，每24小时更换一次培养基。细胞计数采用CASY TT细胞计数器（Innovatis，Roche Applied Science）进行。用Metaffetene SI（Biontex）转染p21的siRNA（sc-29427，Santa Cruz Biotechnology，UGUCAGAACCGGCUGGGGGA和UCCCCAGCGGGUUCUCACA）或非靶向对照（sictr，ON-TARGETplus，Dharmacon D-001810-10-20，UGUUACAUGUCUACA，UGUACAUGCUAA，UGOUCAUGUUCGA和UGUGUCUUACAUUUUUCCUA）在DMEM中放置24小时，然后清洗并添加完整的或-SG介质。
异种移植物
双侧皮下注射3×106在8周CD-1-Foxn1上进行HCT116细胞努雌性小鼠（查尔斯河）；第53页+/+右侧与p53−/−（1ex）在左侧。注射后立即将小鼠置于对照饮食（n=10）（含有丝氨酸和甘氨酸，作为氨基酸混合物的一部分）或缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食（n=10）（试验饮食，国际产品供应）-可根据要求提供配方。这些日粮具有相同的热值和相同的总氨基酸含量。动物被关在无菌IVC笼中，每周监测三次，当肿瘤达到预定大小的临床终点（体积=（长×宽2)/2） 或溃疡。所有动物工作均经道德审查程序（格拉斯哥大学）批准，并按照1986年《英国动物（科学程序）法案》（PPL 60/4181）和2010年欧盟指令进行。
蛋白质印迹
细胞接种在6孔板中，并在DMEM中生长约40h。用PBS清洗细胞，然后接受完整的或-SG培养基。接种时滴定细胞数，使其在蛋白质分离时达到~90%的融合。在含有完全蛋白酶抑制剂（Roche）的RIPA缓冲液中制备细胞裂解物，通过PAGE解析并转移到硝化纤维素中。主要抗体：Phosho-p70S6K（9206）和total-p70S6K（2708），Phospho-S6（2215）和toll-S6（22.17），AMPKα（2532）和Phospho-AMPKα（2535）均来自细胞信号技术，PHGDH（Sigma Life Science，HPA021241），PSAT1（Novus Biologicals，21020002），PSPH（sc-98683），CDK4（sc-260），p53 DO-1（sc-126），p21（sc-397）和PGAM1（sc-130334）全部来自圣克鲁斯生物技术公司。二级抗体为IRDye800CW或IRDye6980LT偶联抗体（LiCor Biosciences），使用Odyssey红外扫描仪（LiCorBioscinces）检测，并使用Odysey软件进行定量。
耗氧量（OCR）
XF24细胞外通量分析仪（SeaHorse Bioscience）记录了OCR。HCT116细胞在XF平板中在完整或-SG培养基中培养48小时（测量时为90-100%融合液）。平衡后记录OCR，CCCP（0.5uM）和抗霉素（1.5uM）处理后，使用这些值计算基础OCR和最大OCR。所有OCR测量值均采用逐孔血细胞仪细胞计数进行标准化。
过氧化物敏感性分析
HCT116细胞接种在DMEM的12孔板中。16-20小时后，用PBS冲洗细胞，并接受完全或丝氨酸和甘氨酸缺乏培养基。24小时后，用含有规定浓度过氧化氢的匹配培养基替换培养基，再清洗24小时后用光学显微镜拍摄细胞图像。我们注意到细胞数量对过氧化物敏感性有很大影响；因此，仔细滴定细胞接种，以便在添加过氧化氢时，不同实验条件下的细胞数量相等。
ROS检测
将CellROX深红色试剂（Invitrogen）添加到细胞培养基中30分钟。对于流式细胞术，通过用PBS-EDTA洗涤，然后用PBS-EDTA和胰蛋白酶（0.025%）处理来分离细胞，并在FACSCalibur细胞仪（BD Bioscience）上进行分析。对于共聚焦显微镜，使用倒置共聚焦荧光显微镜（Fluoview FV1000，Olympus）对活细胞成像。
液相色谱-质谱（LC-MS）
HCT116细胞（0.5–1.5×106)在DMEM的6孔板的三个重复孔中播种，在重复板中播种进行细胞计数。16-24小时后，用PBS清洗细胞，并在规定的时间内接受完整的或-SG培养基。对于葡萄糖流量实验，介质被HEPES缓冲的Krebs-Ringer溶液替换为25mM U-13C-D-葡萄糖（剑桥同位素）、10%透析FBS、1×MEM氨基酸（11130）、2×MEM维生素和2mM L-谷氨酰胺。对于丝氨酸通量实验，用完整的培养基替换培养基，用丝氨酸替换0.4mMU-13C、，15N-L-丝氨酸（剑桥同位素）。用PBS清洗细胞，用甲醇/乙腈/dH提取代谢物2O（5:3:2）（2–4×106细胞/ml）。样品快速冷冻，在4°C下解冻，在16000g下旋转15分钟，收集上清液并通过0.45um PTFE膜（Millipore）过滤。在牺牲时采集血清样本；将20ul血清添加到980ul提取缓冲液中，并如上制备。根据Accela自动采样器和Accela 600泵（Thermo Scientific），在Orbitrap Exactive（赛默科技）上进行LC-MS分析。Exactive在极性开关模式下工作，正电压4.5kV，负电压3.5kV。色谱柱硬件由Sequant ZIC-pHILIC色谱柱（2.1×150 mm，5um）与Sequent ZIC-pHILIC保护柱（2.1 x 20 mm，5um）（默克）耦合组成。流速为100uL/min，缓冲液由A的乙腈（ACN）和20 mM（NH）组成4)2一氧化碳三，0.1%NH4H中的OH2B的O梯度在20分钟内从80%到40%ACN，然后在20%ACN下清洗，然后在80%ACN下重新平衡。使用LCquan软件（Thermo Scientific）对代谢物进行鉴定和量化。根据5ppm范围内的准确质量，代谢物得到了肯定的鉴定，并通过与标准保留时间的一致性进行了进一步验证。
定量PCR
引物：PGK-F:CTGTGGCTTGCATACCT，PGK-R:CGAGTGACAGCCTCTCTCGCCAGCATACA，PHGDH-F:ATCTCTCACGGGTGTG，PHGDH-R:AGGCGCATCAGTGTC，PSAT1-F:CGGTCCGAATAGAGGTG，PSAT-R:AACCACGACGTAGA，PSPH-F:GAGCGGACTCTTTTAAGC，PSPH-R:CAGGAGGTGAGCTGC，SHMT-F:CCCCATTGAACACT，SHMT-R:GGATCACATTTTTTTT CACTCC，PKM2-F:CTCGGGCTGAGGAGT，PKM2-R:AATTGCAAGTGGTGATGGCA，Actin-F:TCC ATCATGAAGTGACG，Actin-R:TACTCTGCTTGCTGATCCAC。反应使用SYBR Green master-mix在7500快速实时PCR系统上进行（均为应用生物系统）。
染色质免疫沉淀
如前所述进行分析32.电池（6–8×105)接种在DMEM中的6孔板中，让其生长约40小时，然后用PBS洗涤，接受完整或-SG培养基培养15小时，添加羟基脲（HU，0.4mM）作为阳性对照。
细胞周期分析
对于亚G1分析，细胞按照上述方法生长并从平板上分离，然后固定并用碘化丙啶（PI，50ug/ml）染色30min。为了进行细胞周期分析，将BrdU（Invitrogen）添加到活细胞中100分钟，并如前所述进行检测32流式细胞术在FACSCalibur细胞仪上进行。
PI排除
将PI加入细胞培养基（1ug/ml）中5min。收获非粘附细胞和粘附细胞，并在FACSCalibur细胞仪上通过流式细胞术进行分析。
ATP测定
将等分的细胞悬浮液添加到加热至99°C的TE缓冲液（pH 7.75）中，并使用Veritas Microplate光度计（Turner Biosystems）上的ATP测定试剂盒（Invitrogen）进行分析。对细胞悬液进行计数，使细胞数量正常化。
统计
生存率通过非参数分布分析（右删失）进行评估，使用Minitab 16（Minitab Ltd）上计算的对数秩和Wilcoxon检验。使用Microsoft Excel进行以下t检验比较（v12.3.4）：饮食组之间的肿瘤体积；不成对，一条尾巴。饮食组肿瘤体积；成对，一条尾巴。饮食组之间的血清氨基酸；不成对，一条尾巴。基因型内耗氧率；成对，一条尾巴。基因型间耗氧率；不成对，一条尾巴。
