中风后炎症是治疗的靶点还是工具？

肿瘤坏死因子

实验性中风中研究最广泛的细胞因子是促炎和免疫调节细胞因子TNF。它以分泌型（solTNF）和跨膜型（tmTNF）存在，也参与反向信号传导[87]. solTNF来源于tmTNF，它被蛋白酶ADAM-17（也称为TNF-α转化酶（TACE））裂解[14]. tmTNF和solTNF信号通过两种不同的受体TNFR1和TNFR2传递，这两种受体在细胞表达和下游效应方面都有显著差异。虽然solTNF以高亲和力结合这两种受体，但它优先结合TNFR1（解离常数[K_d日]20 pM）与TNFR2([K_d日]约400 pM），因为TNFR2的分离速度比TNFR1快30倍[69]. 这引发了配体传递假说，即solTNF与TNFR2的结合很快传递给TNFR1。TNFRs与tmTNF或甚至TNF拮抗剂的结合可以通过tmTNF诱导反向信号传导，导致细胞激活、细胞因子抑制或tmTNF承载细胞的凋亡（在[49]). 虽然TNFR1几乎在所有细胞上表达，但TNFR2的表达仅限于免疫系统细胞、胶质细胞和内皮细胞。TNF的促炎作用可能通过solTNF–TNFR1信号传导介导，导致激活两个主要的、众所周知的途径。一种主要通过激活转录因子核因子-κB（NF-κB）诱导抗凋亡基因。第二条信号通路导致细胞自杀程序的激活，包括程序性细胞死亡、凋亡的原型，也包括程序性坏死（坏死）的执行[179]. 在生理条件下，除非转录、翻译或NF-κB通路被阻断，否则TNF不会诱导细胞死亡。与TNFR1不同，TNFR2与诱导凋亡无关，但通过NF-κB活化优先促进细胞生长和再生。TNFR1可以通过solTNF或tmTNF的结合激活，而TNFR2只能通过tmTNF完全激活[68,69]. TNFR1和TNFR2胞外结构域的蛋白水解裂解增加了进一步的复杂性[182]，在TNFR激活后增加（审查人[1]). 脱落的可溶性TNFR1和solTNFR2外结构域可以与TNF结合，尽管亲和力较低，因此可以作为TNF的天然抑制剂。

淋巴毒素α（LTα）是另一种在免疫调节中起重要作用的TNFR激动剂，它还结合TNFR1和TNFR2，主要介导NF-κB介导的信号转导[134].

实验性脑卒中中的肿瘤坏死因子

生理条件下，中枢神经系统中TNF的低基线水平通过调节谷氨酸能突触传递和可塑性在神经元功能中发挥重要作用[164]. 此外，TNF调节与认知和行为有关的神经网络[9]因此，在健康和中风CNS中，TNF都很重要。多项检查已到位，以微调TNF的产生和活性，包括调节TNF公司转录和翻译水平的基因表达以及TNF的调节性脱落[117]及其受体[135].

全基因组关联研究表明，TNF/TNFR1在中风发病机制中具有特殊作用，该研究发现，TNF/TNFR1在脑卒中发病机制中的多态性TNF公司增加中风易感性的基因[178]. pMCAO后，TNF急剧显著上调，在12-24小时达到峰值（图2a） ，并保持升高数天（图1d） 使TNF在急性和慢性缺血以及缺血后神经元可塑性中发挥关键作用（由[91]). TNF在实验性卒中后早期主要由小胶质细胞产生，在后期由巨噬细胞维持[20,32,92,94]尽管其他类型的细胞如室管膜、星形胶质细胞和神经元细胞也被报道在缺血状态下产生TNF（由[91]).

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图2

pMCAO后急性期细胞因子和细胞因子受体上调的时间分布。一pMCAO小鼠同一缺血半球中TNF、LTα、TNFR1和TNFR2 mRNA的时间分布图。b条pMCAO后IL-1β、IL-1α、IL-1Ra、IL-1R1和IL-1R2 mRNA时间分布的图示。c（c）pMCAO后IL-6、IL-6R和gp130 mRNA时间分布的图示。数据以mRNA水平相对增加的形式呈现，与未经处理的对照组相比。TNF、TNFR1和TNFR2 mRNA数据来自[93,94]，而LTαmRNA数据是在与[94]. LTα的序列塔克曼探针为AGGAGGGAGTTGTTGCTCAAAGAGAGACA，LTα阳性引物为CTGCTGCTCACCTTTGGGG，LTα反义引物为TAGAGGCACTGGGGGAT。IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-1R1和IL-1R2 mRNA数据来自[33]. IL-6、IL-6R和gp130 mRNA数据来自[70]. 注意对数Y（Y）轴。gp130标准糖蛋白130，伊利诺伊州白细胞介素，白介素-6R白介素-6受体，书信电报α-淋巴毒素-α，TNF公司肿瘤坏死因子，TNFR公司肿瘤坏死因子受体

转基因小鼠的使用对于确定TNF在缺血性中风发病机制中的作用是非常宝贵的。常规TNF-敲除（KO）小鼠[92]和条件TNF-KO小鼠，消融髓细胞（包括小胶质细胞）中的TNF[31]pMCAO后，与对照组小鼠相比，梗死面积更大，行为缺陷更严重。这表明小胶质源性TNF在缺血性卒中中具有神经保护作用，这种作用似乎通过TNFR1介导[92,170]. 有趣的是，失去TACE介导的卵裂阻止solTNF脱落的小鼠（因此只表达tmTNF）比其同窝小鼠梗死面积小[104]表明去除solTNF而保留tmTNF对缺血性卒中具有神经保护作用。

最后，LTα基因的多态性(长期协议)与中风易感性增加有关[178]提示LTα在卒中的发病机制中也起作用。然而，小鼠pMCAO后急性期的LTα水平似乎保持相对稳定（图2a、 Lambertsen等人，未发表的数据），表明脑源性LTα在中风后炎症反应中没有主要作用。

抗肿瘤坏死因子治疗实验性脑卒中

目前使用的美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局批准的抗肿瘤坏死因子疗法阻断了solTNF和tmTNF（表2). 这些疗法似乎可以缓解疲劳和抑郁症状，这些症状可能与慢性炎症疾病有关[177]. 尽管有报道称接受椎管外依那西普治疗的中风或创伤性脑损伤患者的神经系统结果有所改善[172,174]（表1)目前使用的抗肿瘤坏死因子治疗药物中，没有一种与组织纤溶酶原激活剂治疗相结合被批准为神经保护策略。这可能是因为以solTNF和tmTNF为靶点会使患者容易患心血管疾病和脱髓鞘疾病[151]这与TNFR1基因中单核苷酸多态性的发现一致(TNFRSF1A）模仿抗肿瘤坏死因子治疗的效果，是发展为多发性硬化症的危险因素[67]. 与野生型小鼠相比，不仅TNF-KO小鼠，而且TNF-R1 KO小鼠发生更大的梗死[92,170]，这要求在使用当前批准的抗肿瘤坏死因子治疗药物时采取预防措施，并强调需要更具体的抗肿瘤转移因子治疗药物。

很少有专门针对solTNF（XPro1595、XEN345，可能还有R1antTNF）的治疗药物进行临床前测试（表1,​,22和图三a） 并保持通过tmTNF–TNFR1/2的信号完整。在pMCAO后30分钟，单次静脉注射XPro1595（一种显性阴性solTNF抑制剂）或依那西普10 mg/kg的对比研究表明，与pMCAO1后1天和5天的载体相比，这两种化合物都影响了炎症反应，改善了运动功能和运动学习技能，但对梗死体积无影响[30]. 这表明仅以solTNF为靶点可能对中风后炎症的治疗有效。同样，最近的研究结果表明，局部而非全身施用XPro1595可以挽救实验性脊髓损伤后的危险组织，而依那西普没有效果[129]表明局部施用XPro1595可以抑制CNS中局部存在的solTNF。显然，需要更多的研究来阐明XPro1595是否能够挽救濒临破产的组织。然而，考虑到人类中风后感染的普遍性，保持tmTNF信号完整可能会降低感染风险。

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图3

已批准和选定的实验性细胞因子和细胞因子受体激动剂和拮抗剂的作用机制示意图。一–c（c）TNF公司(一)，IL-1(b条)和IL-6(c（c）)通过其受体和已批准和选定的新型抑制剂的作用机制发出信号。使用蛋白质休息室路径数据库修改数字(网址：www.proteinlounge.com).抗体抗体，gp130标准糖蛋白130，icIL-1α细胞内白细胞介素-1受体拮抗剂，伊利诺伊州白细胞介素，白细胞介素-1Ra白细胞介素-1受体拮抗剂，白细胞介素1受体1白介素-1受体1型，白细胞介素1受体2白细胞介素1受体2型，白细胞介素-1受体激动剂IL-1受体辅助蛋白，sIL-1受体捕获可溶性IL-1受体辅助蛋白，白介素-6R白介素-6受体，sgp130型可溶性糖蛋白130，溶胶IL-6R可溶性白细胞介素-6受体，solTNF公司可溶性肿瘤坏死因子，tmTNF（tmTNF）跨膜肿瘤坏死因子，TNF公司肿瘤坏死因子，TNFR公司肿瘤坏死因子受体

虽然在中风后急性期保留神经保护性TNFR1信号似乎相关，但TNFR1在多发性硬化小鼠模型中也起到维持慢性炎症的作用，TNFR2对髓鞘重塑很重要[18]. 尽管还需要更多的研究来阐明神经元TNFR1信号在中风后急性期的作用，但TNFR1特异性拮抗剂[R1antTNF，DMS540，TROS(TNF受体1消声器)，ATROSAB公司(拮抗性TNF受体1-特异性抗体)]（表2)保持TNFR2信号传导，对于改善中风慢性期的神经元和突触重塑至关重要。

由于其体积较大，许多生物TNF抑制剂不能穿过BBB，必须进行修饰，以使BBB能够穿透并进入脑实质。其中一种药物是cTfRMAb-TNFR（表2)使用转铁蛋白受体（TfR）在BBB上转运TNFR[197]. 在一项临床前研究中，在tMCAO模型中，静脉注射cTfRMAb-TNFR与依那西普进行比较，当闭塞后90分钟注射时，梗死体积减少，脑卒中后1天和7天神经缺损减少，而依那西普无影响[167]（表1). 尽管cTfRMAb-TNFR和依那西普都是TNFR2融合蛋白，但作者将cTfRM的有益作用归因于该蛋白的修饰，使其能够通过BBB转运[15].

在另一项临床前研究中，sTNF-αR1（solTNFR1）（表2)在光凝性卒中后，经皮质内注射1周，可以保护卒中后大脑皮层剥夺诱导的轴突可塑性[98]（表1). 这种效应归因于sTNF-αR1与TNFR1受体竞争solTNF，支持了消融solTNF对缺血性中风有益的假设。这与一项临床前研究一致，该研究表明，tMCAO后6小时动脉内注射过表达solTNFR1的树突细胞可减少中风后3天的梗死面积和炎症[186]（表1).

白细胞介素-1

IL-1家族由11个成员组成（IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36-γ、IL36-Ra、IL-37和IL-38[43]). 尽管结构和功能相似，而且有共同祖先的证据[143]到目前为止，只有IL-1α、IL-1β和IL-1Ra在缺血性卒中中被广泛研究。

IL-1α和IL-1β均表达并翻译为前体（pro）蛋白。ProIL-1α具有生物活性，但缺乏使其离开细胞的信号肽[143]. IL-1α是一种兼具核和细胞质功能的“双功能”细胞因子，但来自坏死细胞的危险信号可以促进IL-1α的分泌[48]导致中性粒细胞募集和炎症加剧[24]. 细胞凋亡导致IL-1α转移到细胞核，在那里与染色质结合，这是一种已知的抑制炎症的机制[34]. IL-1α被认为是一种早期危险信号，通过IL-1受体1型（IL-1R1）调节广泛的炎症反应[48,143]. 损伤后，IL-1α的蛋白水解通过钙蛋白酶和可能的炎性体的作用发生[194]. 膜结合的未处理IL-1α以旁分泌方式作用于IL-1R表达细胞[42]调节血管生成、细胞增殖、衰老、凋亡、迁移和细胞因子的产生([149]并由审核[43]).

与proIL-1α相比，proIL-1β是一种生物非活性蛋白，proIL-2β和成熟IL-1β均在细胞外出现[143]表明分泌后可以进行加工。ProIL-1β被caspase-1（或IL-1转化酶）裂解[143]它被炎症小体的组装激活，而炎症小体是由损伤相关的分子模式信号触发的[72]. ProIL-1β也可以被中性粒细胞丝氨酸蛋白酶如蛋白酶3和弹性蛋白酶切割[123].

IL-1的天然调节因子是IL-1Ra，它存在于两种结构变异体中，即分泌的IL-1Re和细胞内IL-1Rea（icIL-1Ra），两者都以IL-1R1为靶点[6]. icIL-1Ra亚型的研究较少，但被认为在细胞内发挥多种功能[6]例如调节IL-1α的作用和/或作为proIL-1β的调节器[102]. IL-1Ra由单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞表达[105]，小胶质细胞[33]和其他单元格[42].

IL-1α/β通过IL-1R1诱导其生物效应，在几乎所有脑细胞上以低数量（<100）表达[42]. IL-1与IL-1R1的结合允许白细胞介素-1受体辅助蛋白（IL-1RAcP，IL-1R3）的结合，该蛋白是受体/激动剂信号复合物的关键成分[6,143]. IL-1RAcP的招募和结合将IL-1R1和IL-1之间的低亲和力结合转化为高亲和力结合，从而实现进一步的信号转导[65]. IL-1信号复杂但有效，在触发完全反应之前，需要占用<10个受体/细胞[166]. 这意味着IL-1Ra需要以100–1000倍摩尔过剩量存在，以控制其生物学特性[42].

IL-1R2与IL-1R1具有相同的结构特征，但缺乏允许信号转导的细胞质域。IL-1R2作为诱饵受体与IL-1结合[42,143]. IL-1R2由与IL-1R1相同的细胞表达，但在单核细胞和中性粒细胞中尤其丰富[42,45]. IL-1R2与细胞溶质中的IL-1α结合，防止其在坏死细胞释放时与IL-1R1相互作用[196]. 所有IL-1R也以可溶性形式存在[90].

白细胞介素-1在实验性脑卒中中的作用

IL-1是中风病理学的主要参与者（图1g、 h）。至于TNF公司基因的多态性伊利诺伊州-1安培基因与缺血性中风易感性增加有关[199]而在伊利诺伊州-1B年基因与降低中风风险有关[13]，尽管这仍然有争议[193,199]. 中的多态性IL1RN号基因不影响中风风险[199]，但血浆IL-1α增加，并伴有IL1RN号基因增加中风后感染的风险[10].

到目前为止，重点是了解IL-1β在实验性中风模型中的作用，然而数据表明，IL-1α也在pMCAO后6–24小时在小鼠中显著上调（图2b）[33]tMCAO后7天[149]在中风诱导的神经炎症中起重要作用[33,171]. 在啮齿动物实验性中风后，血小板和小胶质细胞表达IL-1α[33,40]. 实验性卒中后6 h血小板衍生IL-1α的急性表达[33]支持IL-1α驱动神经血管炎症并促进中性粒细胞浸润缺血脑的研究结果[171]. 在pMCAO后24小时，小胶质细胞是IL-1的主要产生者，大约50%产生IL-1α的小胶质细胞共同表达IL-1Ra，17%共同表达IL-1β，表明IL-1β和IL-1α主要是由缺血脑中分离的小胶质瘤群产生的[33]. 因此，除了少数产生IL-1α/β的小胶质细胞外，血小板中的IL-1α可能会在中风发作后早期影响IL-1/IL-1Ra之间的平衡[33]. IL-1α和IL-1Ra在小胶质细胞中共同表达的研究结果支持了icIL-1Ra可以调节细胞内IL-1α的作用的观点[113].

IL-1β在中枢神经系统中组成性表达[42]在那里发挥神经营养因子样活性[161]或调节离子通道的表达和活性[181]. 缺血性卒中后IL-1β急剧上调（图1)[32,33,37]在12-24小时达到峰值（图2b） 主要在小胶质细胞和巨噬细胞中[32,37]后来在星形胶质样细胞中[183].

IL-1已被证明会加重中风病理（表1)正如转基因小鼠在神经元中过度表达caspase-1的显性负性形式所证明的那样[54]，caspase-1 KO小鼠[73]和IL-1α/βKO小鼠[17]这都表明实验性卒中后梗死体积减少。早期研究表明，重组IL-1β的给药加剧了损伤，这提供了额外的支持[99]脑室内注射IL-1Ra抗血清也是如此[101]. tMCAO前全身给予IL-1β通过中性粒细胞和血小板依赖性机制降低再灌注，使啮齿类动物的预后恶化[109].

此外，IL-1Ra是一种急性期蛋白[55]阻止IL-1的作用。给予IL-1Ra减轻大鼠tMCAO和pMCAO后的缺血性脑损伤[59,137]和老鼠[175]（表1)pMCAO后，IL-1Ra过度表达的小鼠梗死体积减少，而IL-1Ra-KO小鼠梗死体积增加[33].

抗白细胞介素-1治疗实验性和人类缺血性卒中

IL-1Ra是唯一针对IL-1诱导炎症的治疗剂（图三b） 在缺血性中风的随机临床试验中进行了测试（表1). 在临床前中风模型中，重组（r）IL-1Ra在中枢神经后具有保护作用[137]和外围设备[59]与静脉注射抗IL-1β抗体（Ab）类似[191]或IL-1Ra在大鼠MCAO后可减少梗死体积[99,137]和小鼠的pMCAO[121].

虽然IL-1Ra在大鼠全身给药后可以到达大脑[66]并调节实验性中风后的长期功能恢复[62]其在中风患者中的应用已被证明具有挑战性。药代动力学研究表明，rIL-1Ra缓慢穿过BBB[71]在循环中的半衰期很短[64]因此，很难在大脑中达到治疗性IL-1Ra浓度[57].

在急性中风患者中使用静脉注射重组人（rh）IL-1Ra（在中风发作的前6小时内给药）的第一项随机、双盲、安慰剂对照试验显示，与安慰剂相比，中性粒细胞计数、血浆CRP和IL-6降低，探索性疗效分析表明，接受rhIL-1Ra治疗的患者在中风三个月后残疾程度最低或无残疾[51]. 最近，SCIL-STROKE（缺血性卒中皮下白细胞介素-1受体拮抗剂）II期试验通过皮下注射IL-1Ra结合静脉溶栓，显示血浆IL-6水平降低，而卒中后三个月的神经恢复未受影响[159]. 探索性疗效分析表明，IL-1Ra通过减轻炎症而对临床结果产生的预期有利影响可能被一种负面影响所抵消，这种负面影响可能表现为与阿替普酶的相互作用[159].

白细胞介素-6

另一种具有多效性功能的强效促炎细胞因子是IL-6，它在多种细胞类型上表达，包括单核细胞、神经元和胶质细胞（图1j、 k）[52,70]. IL-6的多效性可以用IL-6引起不同的细胞反应来解释，这取决于经典途径还是跨信号途径被激活[152]. 这取决于IL-6受体系统，该系统由IL-6受体（IL-6R）、可溶性IL-6R（sIL-6R）和糖蛋白130（gp130）组成，由于其细胞质域负责信号转导。可溶性IL-6R由TACE/ADAM17从IL-6R中裂解而成[141]或通过翻译不同的IL-6R mRNA剪接变体[103].

在经典的信号转导中，IL-6与膜结合的IL-6R结合并形成复合物，后者随后招募gp130。当IL-6与sIL-6R结合，然后与膜锚定的gp130结合时，发生转位[141]. 与IL-6R不同，IL-6R由神经元、小胶质细胞、中性粒细胞、单核细胞、肝细胞和CD4表达⁺T细胞，从而限制了经典信号传递到少数组织[58]，gp130在体内广泛表达（由[145])，增加IL-6靶细胞的谱。越位通常受到严格监管[185]并且可以被gp130的可溶性形式（sgp130）抵消，该可溶性形式由gp130 mRNA的选择性剪接产生，并存在于血清中[85]. 一旦IL-6释放到血液中，它可以结合sIL-6R和sgp130[150]，立即干扰IL-6转基因[58]. 由于sgp130水平远高于sIL-6R，因此在生理条件下不会发生转基因。

经典的IL-6信号被认为具有抗炎和保护作用[185]而转signaling是IL-6介导的促炎效应的原因[147,152].

白细胞介素-6在实验性卒中中的作用

IL-6在正常中枢神经系统中表达，通过经典信号通路作为神经营养因子影响神经元的稳态（由[147]). 小鼠和大鼠的缺血性中风导致IL-6水平在6到12小时内显著增加（图1和​和2c），2c） IL-6R和gp130在3天内[三,70]. IL-6在实验性卒中中具有神经保护作用[192]尽管这仍有争议[29]. 在人类中风患者中，IL-6血清水平在最初24小时内升高，并已被证明与梗死面积和存活率显著相关[11,157]. sIL-6R没有观察到类似的相关性[46,70]. 虽然对缺血性脑死亡后IL-6表达的研究很少，但一项研究表明，在中风后急性期的梗死中，IL-6水平已经升高，并在以后的时间点保持升高[126]. 支持脑源性IL-6的神经保护作用的研究结果表明，IL-6对中风后神经发生具有积极作用，可导致长期功能恢复[111].

抗白细胞介素-6治疗缺血性卒中

与使用非特异性TNF拮抗剂治疗的患者类似，使用IL-6抑制剂治疗的非神经性患者感染风险增加（在[169]). 临床中风研究表明，sIL-6R与白细胞浸润程度相关[85]sIL-6R中和抗体是有益的[146]. 相比之下，抗IL-6R抗体靶向膜结合形式的IL-6R和sIL-6R，因此对经典和反式信号传导的影响相同（图三c和表2).

如果经典的IL-6信号传导是保护性的，而转signaling是有害的，那么通过给药嵌合蛋白sgp130Fc可以选择性中和潜在的有害转Signaring（图三c和表2). Sgp130Fc是一种融合蛋白，包含人类gp130的胞外结构域和人类IgG1的Fc片段。这使得sgp130Fc能够与IL-6/solIL-6R复合物结合，但不能单独与sIL-6R结合[86]，其中spg130Fc阻止了转位[52]（图2c） ●●●●。这种对跨信号通路的特异性抑制，即sgp130，不会损害经典信号传导，可能是未来中风研究中一种有前景的治疗工具。

Silas Arlt Tvingsholm在图形设计方面的帮助得到了认可，Claire Gudex在校对方面也得到了认可。这项工作得到了丹麦独立研究、医学科学委员会（DFF-4183-00033 to KLL）、霍尔斯列夫基金会（BHC）、伦德贝克基金会（R54-A5539和R173-2014-955 to KLL、R67-A6383 to BHC和R126-A11512 to BF）以及诺沃北欧基金会（NNF12OC0002215 to BF。