神经营养素发出信号已知对细胞存活和分化至关重要的分子外周神经元和中枢神经元(1,2). 然而，最近的证据表明表明这些多肽分子也服务于其他重要的角色。考虑到它们是以依赖活动的方式发布的(三,4)，有人建议他们在活动依赖性突触可塑性(5,6). 一些研究已经揭示了脑源性神经营养因子（BDNF）的重要作用在突触的生理变化过程中，如长时程增强海马体（LTP）(7–9)和皮层(10). 此外，依赖于活动的形态变化，如结构突触前轴突终末在脊髓损伤形成过程中的重排眼优势柱或树状乔木的形成已证明受BDNF监管(11–13)（有关概述，请参见参考文献。6和14).
已经使用不同的方法来研究BDNF的作用在可塑性过程中，尤其是在海马LTP期间。首字母实验测试了外源性BDNF对突触的影响传递和突触可塑性。BDNF应用程序生成了Schaffer侧支CA1突触传递显著增强成人海马脑片中的突触(7). 然而外源性神经营养素与生理性的差异很大释放，就时空属性和绝对属性而言值，通常超过生理浓度几个数量级。因此，为了更好地理解生理学神经营养素的作用，研究内源性神经营养因子。证据表明海马LTP期间内源性BDNF由使用传统或条件淘汰技术的研究BDNF基因或其相应受体酪氨酸激酶trkB(8,15–17).
为了研究神经营养素的更急性作用研究使用特异性Abs或trkB-IgG融合体阻断神经营养素作用(18–20). 急性干扰BDNF信号转导野生型动物切片制备导致显著减少LTP中。与使用转基因小鼠的遗传方法相比实验使时间分辨率显著提高研究内源性神经营养素的作用。然而，即使在这些实验中，时间分辨率也不是足以确定在突触增强。可以设想两种情况：BDNF需要为LTP的发生提供更长的时间，一致我们称之为“放任”的缓慢机制，或者，或者，在短时间内可能需要BDNF突触增强诱导过程中的窗口，与快速机制，对此我们将使用“指导性”一词
原则上，功能块Abs适合回答关于BDNF的时间要求的问题。然而，尤其是在致密组织中，如切片制备、缓慢扩散无法确定阻塞的确切开始行动。相反，Abs的定时和局部激活及其功能块活动将允许干扰在所需时间点和位置的内源性蛋白质，从而保持激活与实际渗透无关组织。因此，我们研究的目标是生成一个工具这将使我们能够快速抑制内源性BDNF突触增强诱导期间的水平和使用该工具进一步阐明BDNF在突触可塑性中的作用。收件人为此，我们试图生成一个“笼状抗体”通过紫外线照射随意激活。
材料和方法
BDNF Abs。
我们使用功能阻断小鼠单克隆抗体（克隆号21或9，免疫球蛋白G2B型)针对BDNF和之前提出具有特征的(21). 抗体在室温下与生物素化重组蛋白G（Sigma）至少1h，浓度比为4:1或1:1（Ab/蛋白G）。混合物然后用0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 9.5）稀释，以便总蛋白的最终浓度为0.2 mg/ml将化合物6-硝基藜芦酰氯甲酸盐（NVOC-Cl）（Fluka）添加到二恶烷（Fluka）中2%（vol/vol）的最终浓度为0.2 mMNVOC-Cl，允许反应在室温下进行30分钟温度。笼形程序的更多详细信息，例如禁锢的程度和禁锢后抗体的处理反应，作为支持信息发布在PNAS网站上(网址：www.pnas.org).
用于ELISA或生物检测的抗体的辐照使用6-W手持式365nm紫外线灯，体积为4–10μl。低功率手持式灯需要较长的开盖时间才能完成重新激活Ab（例如，图中的3小时。B类). 有关的更多详细信息辐照水平作为支持信息发布在PNAS网站(网址：www.pnas.org).
功能阻断单克隆抗体对神经营养素BDNF。(A类)笼架图示与NVOC-Cl的反应：抗体上赖氨酸的游离氨基为通过与胺反应笼状化合物的反应进行改性。A类当氮形成时，会形成化学稳定但不易光化的氨基甲酸酯一种游离胺攻击NVOC-Cl的羰基碳以取代氯化物。辐射引起内部氧化还原反应，生成亚硝基苄和一种不稳定的氨基甲酸脱羧以再生游离胺。(B类)酶联免疫吸附法证明修饰后抗体与BDNF的结合减少与笼子组和它的成功复活紫外线。这个笼状抗体的剩余信号（21%）反映了非特异性结合（见正文）。填充条显示未辐照的抗体；开条显示辐照后的活性。(C类)用于测试笼状或非笼状抗体阻断活性的生物测定。（巴=100μm）(左侧)鸡结节神经节在BDNF和笼状抗体存在下培养的神经元。(赖特)添加辐照后的平行制备阿布(D类)改变功能块的量化属性。填充条：具有的存活细胞的百分比未辐照抗体；开条，添加后存活细胞的百分比辐照过的抗体。
ELISA–BDNF免疫分析。
ELISA是根据Dynex的标准程序进行的（弗吉尼亚州尚蒂利）微氟2板，根据好。为了测试笼状或非笼状抗体对BDNF的亲和力将含有蛋白质G/Ab复合物的整个溶液添加到Ab浓度为100 ng/孔的孔（在1%BSA中稀释）并在4°C下培养过夜。抗体/蛋白G-生物素复合物用亲和素-β-半乳糖苷酶（Sigma）检测4-甲基伞形花序基-β-半乳糖苷（Sigma）作为荧光底物并用Fluoroskan II读卡器（Titertek，亚利桑那州亨茨维尔）。
用NVOC包被罗丹明绿修饰抗体。
NVOC标记的罗丹明绿（分子探针）与BDNF抗体偶联根据制造商的说明。抗体溶液（10 mg/ml）在0.1 M的碳酸钠（pH 9）中，用1/10体积的10mg/ml NVOC标记的罗丹明绿在DMSO中放置1小时温度。将反应混合物短暂离心上清液在PBS中用Centricon C-30洗涤两次荧光，测量辐照点的平均荧光以及前后周围未照射区域光活化。对荧光进行背景值校正，归一化为最大荧光，并对所有荧光进行平均实验。使用这种化合物进行测量的基本原理光活化和扩散特性在支持信息中的详细信息(网址：www.pnas.org).
生物测定用神经元培养。
从鸡胚节状神经节中获得感觉神经元胚胎第7/8天(22). 神经节用胰蛋白酶和在涂有聚鸟氨酸/层粘连蛋白的48周板（Costar）上培养10%马血清。在不同的浓度和固定BDNF浓度（0.5 ng/ml）。存活率定义为(N个−N个基线)/(N个最大−N个基线)，其中N个是计数的细胞数，N个基线存在未修饰抗体时存活的细胞数量，和N个最大观察到的最大存活率只有BDNF存在（即没有Ab）。至少使用了两口井并在每个实验中按实验条件进行测试。
切片的制备和灌注。
急性海马横切片（400μm厚）由NMRI/SV129株雌性WT小鼠（4-6周龄）前面描述的技术(20). 切片保持在人工脑脊液（ACSF）的标准条件：124 mM氯化钠/3 mM KCl/1.25 mM千赫2人事军官4/2百万硫酸镁4/26 mM氯化钠三/2.5mM氯化钙2/10 mM葡萄糖；室温，含95%O的氧化2和5%一氧化碳2.使用硅化管和烧杯，将BSA（最终浓度0.2 mg/ml）添加到ACSF中减少非特定绑定。每天新鲜制备笼养Abs然后在ACSF中稀释。切片在Ab/BSA溶液中孵育术前1-2小时（总容量5 ml，无灌注）录制。在闭环实验中，总体积为30 ml的ACSF已使用。ACSF被保存在冰水浴中，以减少随着时间的推移，介质的劣化。最初，我们使用闭环系统并向灌注的ACSF中添加Abs或控制溶液（灌注速率2 ml/min）。后来，我们停止将Abs添加到灌流液以减少所需的抗体数量，且仅在孵育时使用切片和开环灌注系统。
电生理学。
海马切片放置在潜水式记录室中（32°C），兴奋性突触后场电位（EPSP）在刺激Schaffer时记录在CA1树突状区域抵押品。在至少200μm以下的深度进行记录切片表面靠近物镜和UV的侧面照明。数据的收集、存储和分析定制的虚拟仪器技术软件（国家仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州）。实验是盲目进行和分析的。初始坡度随时间测量现场EPSP，并将其标准化为基线（平均值TBS前的响应），并绘制为平均值±SEM。作为统计测试，未配对的单尾学生吨测试（假设方差不相等）用于5分钟内的平均值实际时间点之前的时间段。在每个实验中天，相应实验系列的两种条件都是仔细斟酌的。我们排除了不稳定的录音和实验，其中诱导增强后产生的大群体峰人为的大型长期有形资产。
切片中的光激活。
对于海马切片中Ab的照射，我们使用100-W水银灯（蔡司）安装在倒置的外荧光路径上显微镜。辐照束居中并聚焦于记录电极。相同的膜片开口用于所有电生理实验，导致斑点大小约为直径800-μm。TBS前后，照射2次分钟，每0.5秒一次，持续时间为50毫秒。在TBS期间使用范式（持续时间，250ms；间隔，1s）。每次之后实验，目标相对于记录电极经强辐照验证（持续时间2秒；间隔时间5秒，持续1.5分钟）。这个当物镜和电极正确居中和对齐。
结果
开发一个笼式协议以实现可逆失活针对BDNF的功能阻断抗体。
最初，我们优化了将功能阻断BDNF抗体。我们使用了一个抗体来对抗BDNF已成功应用于研究特定角色的实验内源性BDNF在突触中的作用增强作用(20). 抗体与感光剂反应保护化合物NVOC-Cl（6-硝基藜芦酰氯甲酸盐）以受控方式使抗体失活，然后恢复其活性辐射诱导光解的功能块活性笼状化合物(23–25). NVOC-Cl优先与自由基反应高pH值下的氨基，因此几乎只针对赖氨酸蛋白质内（图。A类). 目标是随机修改对绑定到BDNF与笼子组。反应条件由以BDNF为抗原，单侧ELISA检测抗体。的确，用笼状抗体检测BDNF显示信号减少。然而，这种下降可能是由于一级抗体与BDNF或二级抗体与改良的原代BDNF抗体(26). 为了确保仅从BDNF结合位点Abs笼中获得的测量信号在任何化学物质之前与生物素化蛋白G孵育修改。生物素-蛋白G/Ab复合物的检测亲和素-β-半乳糖苷酶使我们能够明确地发现BDNF亲和力的变化，因为生物素没有被NVOC-Cl修饰。最初，我们对是否有可能恢复进行了定性测试辐照笼状抗体的结合活性。一些样品微升暴露在低强度的无聚焦紫外线下手持紫外线灯，需要较长的照射时间。这个实验结果如图所示。B类.酶联免疫吸附试验将读数标准化为未修改的对照。抗体的反应用笼状化合物阻断其与BDNF的结合。剩下的ELISA信号是由背景活性引起的，因为未受辐射笼养对照c-myc或荧光素酶抗体均产生类似的非特定信号（未显示数据）。该结果表明BDNF抗体与其抗原的结合可以通过以下方式阻止用笼状化合物进行改性。然而，更重要的是通过辐照改性剂可以完全逆转还原Ab与紫外线（λ=365 nm）结合，恢复结合活动至原始水平（见图。B类，打开酒吧）。
为了在生物系统中确认这些结果，我们在一个鸡结状神经节分离神经元存活试验。这些神经元需要BDNF的存在才能存活和突起生长不良(22)从而为生物检测提供了一种敏感的方法活性BDNF。我们在BDNF存在下培养神经元以已知有效浓度添加改性或未改性抗体阻断BDNF活性。图。 C类和D类向大家展示大多数神经元在笼状抗体的存在下存活（图。C左). 然而，笼状物的光活化抗体导致大多数神经元死亡（图。C右),表明抗体的阻断活动已恢复到水平与未修改的Ab相当(P（P）<0.02；成对的，成对的吨测试50×）。从两个不同的因此，分析系统证明具有光敏基团的BDNF抗体是可能的，并且该抗体可以抑制BDNF的生物作用。
海马切片组织中Abs的光激活。
这些结果表明，我们的方法原则上是可行的，但这项研究的目的是研究急性脑切片。因此，它评估致密组织的无盖化效率很重要通过紫外线照射和光活化的扩散特性抗体，因为快速扩散可能会降低其有效性浓度。图。A类显示海马切片中辐照点的大小。现场有一个直径约800μm，包括枝晶和体细胞CA1区，但没有到达CA3中的细胞体。收件人可视化光活化和扩散，我们使用NVOC标记的罗丹明绿色，一种用相同的笼基修饰的染料，并将其与BDNF Abs以确保类似的扩散性能。图。 B类和C类显示罗丹明绿的荧光脉冲光（λ=365 nm）照射后出现照射时间为18秒。照射后1小时内斑点的强度慢慢降低到初始值的62%（图。 B–E类). 这种减少是由扩散引起的，而不是光漂白，因为荧光同样减少当曝光次数减少到只有两次时获得（图。E类，□）.之后的荧光量1小时预测BDNF阻断实验的≈60%原始抗体浓度可以预计在开盖后1小时。这个结果表明，扩散不是主要障碍该方法对于研究时间脑源性神经营养因子在突触可塑性过程中的作用需求所需的时间分辨率。
海马脑片中的光激活。(A类)插图生理实验的设置。辐照点（用32倍物镜制作）放置在CA1区。（巴=750微米）(B–E类)抗体在切片中的扩散通过NVOC标记的罗丹明绿与BDNF抗体偶联进行评估。这个光激活范式与LTP中使用的相同实验。(B–D类)内部光活化示例切片。(B类)辐照前的面积光活化(C类)辐照后立即，以及(D类)照射后60分钟。（巴=125μm）(E类)相对荧光的平均时间过程光敏点。荧光随时间缓慢下降显示了光活化分子浓度的降低通过扩散。每隔10分钟测量荧光强度(●,n个=7）或之后仅一次60分钟（□，n个=7）证明漂白不是荧光衰减的原因。
笼状BDNF抗体对大鼠突触电位的影响光激活后海马CA3-CA1通路。
随后，我们测试了LTP是否以及在何种情况下受到改性BDNF Ab.胞外非包被的影响在小鼠海马脑片的CA1区进行记录与抗体孵育1-2小时。突触电位通过刺激Schaffer侧枝循环诱发TBS之前和之后。因为我们之前已经表明针对BDNF的功能阻断抗体导致LTP降低(20)，我们首先测试了我们是否可以观察到突触的同样减少未经修饰的活性物质与修饰的未辐照的，因此可能是非活性的抗体未修改和修改的Ab之间的最佳差分效果，我们测试了三种不同的抗体浓度。同意在生物测定和ELISA中获得的结果（数据未显示），我们发现低浓度（1μg/ml）和高浓度（4μg/ml在LTP上只产生了很小的差异或没有差异，而在中等浓度为2μg/ml时差异。用2μg/ml笼中抗体明显大于用未修改的Ab（图。; TBS后60分钟：改良抗体，143±6%，n个= 11; 未修改的Ab，123 ± 6%,n个= 9;P（P）< 0.05).这种浓度效应很可能是因为笼状抗体具有残留的结合活性，只有在高浓度时才明显浓度，而在低浓度下，抗体太少发挥可衡量的效果。
海马脑片CA1–Schaffer侧支通路中的LTP存在笼子（▴）或未修改（□）BDNF-Ab（浓度2μg/ml）。TBS之后（用▾符号表示），突触增强是在用笼状Ab处理的切片中与未修改Ab。插入描述了两条EPSP轨迹笼养抗体实验，前10分钟（稀迹），后60分钟（浓迹）跟踪）TBS。
接下来，我们用光激活了切片中的笼状抗体TBS，以测试是否快速立即抑制BDNF导致突触增强的任何变化。间歇脉冲刺激[闪光间隔（IFI）0.5 s，闪光持续时间（d）选择50ms]以减少潜在的光毒性损伤。这个辐射范式对基线传播无影响（数据未显示）。照射，在TBS前2分钟开始，以允许足够的在TBS期间，光激活抗体继续累积强辐照IFI=1s，d=250ms）并延长（IFI=0.5 s，d=50 ms）待定。两组切片均用改良的BDNF抗体孵育，但据报道，在增强时只有一组受照上述范例。图。A类表明突触光激活基团的增强作用显著降低与未照射对照组比较TBS（TBS后50分钟：笼状抗体，138±3%，n个=17; 无盖抗体，129±4%，n个= 13;P（P）< 0.05). 这表明阻止BDNF活动LTP诱导前后的短时间足以影响显著增强，支持快速指导效果BDNF。
TBS照射期间抗体的光活化效应在TBS前2分钟启动，在TBS后2分钟停止（由虚线）。(A类)打开BDNF抗体（□）在50分钟内显著降低突触增强程度TBS后与未经辐照的实验相比。(B类)对照实验显示无显著差异在无盖（□）和笼式（▴）BSA之间。
为了控制辐射本身造成的非特定影响用笼状牛血清白蛋白作为对照蛋白重复同样的实验（图。B类). 辐照与未辐照切片的比较显示两组几乎完全重叠组的增强作用没有明显小于未照射组（TBS后60min：笼状BSA，130±6%，n个=14；无套管BSA，125±5%n个= 14;P（P）= 0.6). TBS后不久的微小差异可能反映出辐射本身或光活化反应副产物。此控件指示笼状BDNF-Ab的作用是针对抗体和不是由辐照本身引起的。
在第二个实验中，我们进一步提高了时间分辨率并测试了仅从开始的较短辐照范式的效果TBS前（7 s；间隙间隔，500 ms；d，50 ms）和与之前一样，在TBS期间和之后继续。在这种情况下，两个囚禁的Abs，一个对抗c-myc，一个对抗BDNF，都是光激活的相互比较。图。显示光激活BDNF存在时的突触反应与c-myc对照抗体相比，抗体的增强程度更低（10分钟TBS后：myc-Ab，149±7%，n个= 15; BDNF抗体，133 ± 5%,n个= 14;P（P）< 0.05).然而，效果明显小于前一次仅持续了TBS后的前10–15分钟（60分钟TBS后：myc-Ab，127±4%，n个= 15; BDNF抗体，123 ± 6%,n个= 14;P（P）= 0.3). 这个减少可以很容易地通过缩短光激活范式，总共只有700毫秒的激活时间TBS前的时间与第一次实验中的12秒相比，必然导致活化抗体数量减少。因此减少辐射的时间分辨率是以减少辐射为代价的效果。尽管如此，因为这些实验和其他所有实验一样，都是完成的盲目地，这一范式也揭示了一个显著但很小的影响。
与图中相似的实验。，带光激活启动TBS前7秒。在这种情况下，改良的c-myc抗体（针对人c-myc 9E10表位）作为对照。打开BDNF-Ab（□）在最初15分钟内降低了电位与对照组比较（▴）。
讨论
关于BDNF时间要求的以往研究在突触增强期间，要么缺乏时间分辨率或仅在TBS后表现出BDNF的参与(19). 我们的方法提供了一种精确计时内源性BDNF，从而使我们能够专注于角色在TBS期间发生BDNF。此处报告的实验证明在LTP诱导时间足以显著降低水平突触增强。这些结果强烈表明TBS期间释放的内源性BDNF是一个关键成分突触增强。显然，我们的实验并不排除BDNF还可能具有许可效应，但它们提供了据我们所知，第一次证明内源性BDNF在突触可塑性。使用uncaging方法也使我们能够至少在有限程度上满足BDNF的空间要求在增强过程中。CA1区的限制性光活化排除了BDNF对CA3细胞的体细胞或树突区室的作用。
关于BDNF在突触中的作用的一个尚未解决的主要问题可塑性和增强性与其时间作用有关。鉴于BDNF对突触增强和可塑性及其活性依赖性释放(三,4)导致了建议BDNF可以充当快速信使，这是它有助于启动观察到突触强度的变化。到目前为止，大多数实验都可以不区分快速和慢速效果内源性BDNF。唯一的，虽然相当间接，已经提供了有利于BDNF快速作用的实验支持通过实验利用外源性BDNF诱导快速生理变化(27). 原则上，可以发生这些变化几分钟内。BDNF在毫秒内产生更快的效果卡菲茨最近描述了这一范围等。(28)，谁发现BDNF在海马神经元中的局部快速应用可以诱导神经元快速去极化，与兴奋性神经递质谷氨酸。确定是否事实上，内源性BDNF对突触增强，对急性阻断BDNF活性至关重要几秒钟内。根据我们的方法提供的时间分辨率，在突触增强过程中需要BDNF活性在关键时间点，即TBS期间进行评估这种方法的优点是只在几分钟左右阻止BDNF活动TBS的时间（与之前实验中的小时相比），我们仍然观察到增强显著减少。此外从第一个时间点开始，立即出现减少TBS后，进一步强调BDNF快速作用的证据支持BDNF快速发布的想法。
尽管在TBS期间BDNF释放的直接证据仍然缺失，可以合理地假设，这种强烈的重复刺激诱导增强可以触发BDNF的释放，类似于描述为强去极化刺激，如KCl或谷氨酸(三,4,29). 另一种不同的解释是，我们认为可能性较小θ-突发活动导致对BDNF的敏感性增加。一些研究事实上，已经提供了细胞对神经营养素依赖于神经元的活动水平(30,31).然而，到目前为止，这种效果只在实验中得到了证明使用外源性BDNF结合相对较长的暴露时间。在无论如何，后一种可能性也与快速行动一致BDNF在突触可塑性中的表达
实验的时间分辨率。
与以前的方法相比，我们的方法的一个主要优点是它可以控制BDNF阻断的开始精确度。最初，我们担心激活的抗体会迅速扩散离开辐射区，从而防止建立足够水平的功能阻断抗体。笼状罗丹明绿偶联BDNF的光激活荧光Abs对海马组织中的抗体，从而证明激活的抗体在TBS和此后不久。
很难很好地估计光激活抗体与内源性BDNF的比较。通过省略2分钟照射来缩短照射时间TBS前（见图。)明显降低了对增强的影响。这个观察表明，在这个实验中功能阻断Abs是不饱和的。2分钟预赛的范例-而激活后最初被选择来激活Abs数量，同时尝试保留可接受的时间分辨率。长脉冲和短脉冲间隔不能因为他们被发现由于累积紫外线而具有光毒性暴露。据推测，Abs的有限激活是图中两条曲线之间的适度差异。A类,特别是在以后的时间点。
尽管在我们的实验中，阻塞的开始是暂时的定义时，其偏移量定义不太明确，因为原因多种多样。这些包括(我)未知绑定Ab常数和未知Ab浓度与BDNF中(ii（ii）)扩散机制，不断减少光激活抗体的数量，以及(三)它不是明确需要多少抗体来削弱增强作用。它是我们的方法可能也会影响照射后BDNF的水平；因此，我们不能排除可能还需要BDNF正如之前的研究所建议的那样，诱导LTP后(19). 在任何例，BDNF急性失活及其对增强作用与BDNF在诱导增强。
抗体笼。
我们的实验表明，修饰的抗体与BDNF。尽管使用NVOC-Cl笼组进行了修改与BDNF的结合显著减少，阻断作用没有完成。4μg/ml抗体在电生理中的应用实验得出的曲线在统计上没有差别将改良的抗体与未改良的对照组进行比较。这个观察结果可以用残余结合活性来解释浓度更高，足以抑制突触增强。这一解释得到了来自ELISA和存活生物测定实验（数据未显示）。两种可能场景可以解释剩余的绑定活动。要么是与笼子组的修改程度大致相同对于所有Ab分子，导致每种分子的亲和力相等地降低BDNF抗原的单个Ab分子，或者抗体可以由对BDNF具有不同亲和力的抗体组成。无论机制如何，NVOC-Cl限制不仅会转换正电荷侧链变成非极性侧链，但也可能引入空间位阻，因为仅仅存在额外的芳香族部分。因此，笼子反应的影响很大取决于赖氨酸残基的存在和贡献抗体-抗原结合。
到目前为止，关于笼状蛋白用于生物系统受到限制(25,32). 例如，NVOC-Cl用于G-actin的可逆阻断聚合活性(24)，至控制GAL4VP16在生活中的转录活性果蝇属胚胎(33)，或研究利用caged蛋白激酶或它们的抑制剂(34). 最近通过生产抗体与抗原或抗体与蛋白质结合强度的变化A类(26); 然而，笼养的抗体没有用于进一步的实验。我们的结果证明了用光稳定性笼群作为抑制特异性理想状态下生物系统中的内源性蛋白质时间点和位置。这里我们显示BDNF有一个立即数，可能具有指导意义，在突触可塑性中的作用。此外，这该方法应使研究其他生物活性物质成为可能迄今为止未被发现的不同体系中的多肽分子时空控制。
