巨噬细胞靶向治疗通过释放I型干扰素反应增强化疗疗效

肿瘤患者CSF-1R阻断K14cre；加拿大存托凭证1^前/后;Trp53基因^前/后小鼠增强铂类化疗的抗癌作用

接下来，我们测试了抗CSF-1R与两种作用方式不同的常规化疗药物（顺铂，一种以铂为基础的抗癌药物，可交联DNA并诱导凋亡）和多西紫杉醇（一种通过稳定微管干扰细胞分裂的抗有丝分裂剂）联用的抗癌效果。TAM的减少证实了在化疗和抗CSF-1R治疗荷瘤KEP小鼠期间成功阻断CSF-1R通路(图1c、d和补充图2a、b). 有趣的是，与顺铂/对照抗体治疗的小鼠相比，抗CSF-1R与顺铂协同作用，导致生存期延长(图1f). 相反，在多西他赛/抗CSF-1R治疗的小鼠中未观察到治疗协同作用(补充图2c). 顺铂/抗CSF-1R的治疗协同作用与KEP肿瘤的更多坏死相关(图1g)但没有更多的半胱天冬酶3⁺凋亡细胞(补充图2d). 也许还涉及其他细胞死亡机制，或者我们的分析时间对于这个参数来说是次优的。此外，抗CSF-1R单药治疗，以及在较小程度上与顺铂联合治疗，减少了BrdU的数量⁺增殖细胞(图1h). CD31的数量和周细胞覆盖率无明显变化⁺在分析的时间点观察微血管、肿瘤内DNA双链断裂的数量和肿瘤内顺铂加合物的形成(补充图2e-h). 正如预期的那样，这些参数在多西紫杉醇设置中没有改变(补充图2i-m).

为了评估抗CSF-1R介导的治疗协同作用是否是顺铂独有的，或者是否可以扩展到具有类似作用机制的药物，我们测试了另一种含铂药物奥沙利铂，发现联合CSF-1R阻断也提高了奥沙利铂的生存益处(图1i和补充图2n). 这些数据表明，抗CSF-1R与基于铂的化疗药物协同作用，以延长乳腺肿瘤荷瘤KEP小鼠的生存期。

CSF-1R抑制改变K14cre；加拿大存托凭证1^前/后;Trp53基因^前/后肿瘤

巨噬细胞是炎症性TME的关键调节器²⁸因此，我们开始评估抗CSF-1R对KEP肿瘤天然免疫景观的影响。尽管CD11b大量减少⁺80层/四层⁺抗CSF-1R的TAM，高达肿瘤内CD45的20%⁺免疫细胞仍表达巨噬细胞标志物F4/80(图1d). 这种存活的CD11b的详细分析⁺80层/四层⁺人群显示，与CD11b相比，这些细胞表达炎性单核细胞标记物Ly6C的比例增加⁺80层/四层⁺对照抗体治疗肿瘤中的细胞(图2a和补充图3a). 此外，幸存的CD11b⁺80层/四层⁺与瘤内CD11b相比，顺铂/抗CSF-1R治疗的肿瘤细胞表达高水平的共同刺激分子CD80、CD86、轻度升高的MHCII水平、降低的趋化因子受体CCR2和CX3CR1水平以及升高的PD-L1水平⁺80层/四层⁺顺铂/对照抗体处理小鼠的细胞(图2b-g). 也在独立的原位移植中K14cre；Trp53基因^前/后乳腺肿瘤模型，瘤内CD11b⁺80层/四层⁺抑制CSF-1R后残留的髓细胞表现出与抗CSF-1R-治疗的KEP肿瘤相应的表型改变(图2h-m). 因此，抗CSF-1R会耗尽大部分CD11b⁺80层/四层⁺TAM，而少量CD11b⁺80层/四层⁺具有独特表型的细胞存活下来。为了探索这些存活细胞是否来源于循环单核细胞，我们转移了tdTomato⁺将单核细胞转化为对照抗体或抗CSF-1R治疗的荷瘤KEP小鼠。4天后，浸润CSF-1R肿瘤的转移单核细胞经治疗而非对照抗体治疗后，动物部分获得了存活的肿瘤内CD11b的表型⁺80层/四层⁺细胞群(即CX3CR1缺失和PDL1表达升高）(补充图3b-d). 这些发现表明存活的CD11b⁺80层/四层⁺抗CSF-1R治疗肿瘤中的细胞可能来源于新招募的循环单核细胞，但不能排除其他机制。

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图2

F4/80的特性⁺自发性细胞的流式细胞术K14cre；加拿大存托凭证1^前/后;Trp53基因^前/后肿瘤和原位移植K14cre；Trp53基因^前/后抗CSF-1R治疗后的肿瘤。

（a）CD11b的百分比⁺80层/四层⁺终末期KEP肿瘤中表达Ly6C的免疫细胞（未经治疗的5只动物，抗CSF-1R的3只动物，顺铂的6只动物，顺铂/抗CSF-1的5只小鼠）。（b-c）CD80的几何平均荧光强度（gMFI）（b）和CD86（c）F4/80上的表达式⁺SiglecF公司^-KEP肿瘤中的细胞（顺铂/对照ab n＝4只动物、顺铂/抗CSF-1R n＝6只动物）。（d）表达MHCII的F4/80的百分比⁺SiglecF公司^-F4/80上MHCII的细胞和gMFI⁺SiglecF公司^-在KEP肿瘤中（顺铂/对照组n=5只动物，顺铂/抗CSF-1R组n=6只动物）。gMFI是通过从MHCII阳性人群的gMFI中减去MHCII阴性人群的gMMFI来计算的。（e-g）CCR2的gMFI（e）、CX3CR1（f）和PD-L1（g）F4/80上的表达式⁺Siglec F公司^-KEP肿瘤中的细胞（CCR2和CX3CR1:顺铂/对照ab n=4只动物，顺铂/抗CSF-1R n=6只动物；PD-L1:顺丁/对照ab n=4只，顺铂抗CSF-1 R n=5只动物）。（小时-分钟） K14cre；Trp53基因^前/后将（KP）肿瘤块原位移植于FVB小鼠乳腺脂肪垫。（h）CD11b的百分比⁺80层/四层⁺SiglecF公司^-在时间点处死的KP肿瘤中表达Ly6C的免疫细胞。（i-m）CD80的gMFI（i），CD86（j），CCR2（k）、CX3CR1（l）、和PD-L1（米）F4/80上的表达⁺SiglecF公司^-时间点处死KP肿瘤中的细胞（n=8只动物/组，CCR2除外：对照组n=7只动物，抗CSF-1R组n=6只动物）。gMFI值显示在b-c、e-g和i-m公司通过从全染色的gMFI中减去荧光的gMFIs减去一（FMO）染色来确定。数据显示于a-m公司均为平均值±SEM，采用双尾Mann-Whitney检验进行统计分析。

然而，在治疗的KEP肿瘤中，巨噬细胞与中性粒细胞的比率约为3:1，而在抗CSF-1R治疗的肿瘤中，无论有无顺铂，这个比率都是相反的(图1d，e). 然而，抑制CSF-1R后，肿瘤内中性粒细胞的绝对数量没有增加(补充图3e). 抗-CSF-1R治疗诱导单核细胞增加，肿瘤内嗜酸性粒细胞和肥大细胞数量轻度但无显著变化(补充图3f-h). 这些数据共同表明，顺铂/抗CSF-1R协同作用伴随着肿瘤髓系免疫格局的变化。最值得注意的是，抗CSF-1R治疗导致CD11b存活人群⁺80层/四层⁺表型改变的细胞。

巨噬细胞阻断通过释放肿瘤内I型干扰素信号增强顺铂反应

更好地描述抗CSF-1R存活的瘤内CD11b的表型⁺80层/四层⁺细胞，对CD11b进行下一代RNA测序（RNA-Seq）分析⁺80层/四层⁺从顺铂/对照抗体或顺铂/抗CSF-1R治疗的肿瘤中分离的细胞。前400个可变基因的层次聚类显示CD11b⁺80层/四层⁺来自顺铂/抗CSF-1R治疗肿瘤的细胞显示出不同的转录组特征，主要特征是参与I型IFN信号传导和I型IFN-产生的基因大量富集，而细胞周期相关基因减少(图3a、b). 有趣的是，其余CD11b中CSF-1R的表达水平较低⁺80层/四层⁺来自顺铂/抗CSF-1R治疗肿瘤的细胞（FC:-2,04；p值=3,63x10^-5)也许可以解释为什么这些细胞会抵抗抗CSF-1R治疗。同时，我们还对流式Ly6G进行了RNA-seq⁺Ly6C型^低的从顺铂/对照抗体和顺铂/抗CSF-1R治疗的KEP小鼠肿瘤中分离出的中性粒细胞。该数据集中前400个可变基因的分层聚类显示，抗CSF-1R治疗也对肿瘤相关中性粒细胞的转录组谱有显著影响(补充图4a). 为了确保中性粒细胞中的这些转录组改变不是抗CSF-1R对中性粒细胞的直接影响，而是巨噬细胞靶向的间接结果，我们对早期生长受体2的靶基因进行了基因集富集分析（GSEA）(第二阶段)，CSF-1R信号下游的转录因子²⁹。在表达第二阶段抗CSF-1R中性粒细胞与对照抗体治疗肿瘤的靶基因(补充图4b)表明中性粒细胞不受抗CSF-1R的直接影响。有趣的是，BiNGO对前100个上调和下调基因的分析以及差异表达基因的Ingenuity Pathway分析显示，与顺铂/抗CSF-1R治疗的肿瘤相比，从中性粒细胞中分离出的与I型IFN信号相关的基因丰富(补充图4c，d和补充表3). 这些数据表明，顺铂/抗CSF-1R的治疗益处伴随着肿瘤内CD11b中I型IFN刺激基因（ISG）的诱导⁺80层/四层⁺细胞和中性粒细胞。

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图3

CSF-1R抑制改变TAM表型并在肿瘤微环境中诱导I型IFN信号。

（a）CD11b间前400个可变基因的层次聚类⁺80层/四层⁺从经顺铂/对照ab和顺铂/抗CSF-1R治疗的KEP肿瘤中分离出的细胞（n=4只动物）（n=2个生物独立样本，每组5只小鼠）。FC：≥1,5；带FDR校正的p值：≤0,05。使用双向方差分析进行统计分析。（b）使用反应基因集比较CD11b对GSEA进行BubbleGUM可视化⁺80层/四层⁺顺铂/抗CSF-1R治疗肿瘤的细胞与顺铂/对照抗体治疗肿瘤的巨噬细胞。与中相同的小鼠一（标准化富集分数（NES）≥1，FDR值：0.25≤）。使用加权Kolmogorov–Smirnov-like统计量计算浓缩分数。（c）的成绩单伊夫纳（n=6只动物/组）和Ifnb公司（顺铂/对照组中5只动物，顺铂/抗CSF-1R组中6只动物）和（d） 第三阶段,钻机1和第一类在第二次顺铂注射后1天分离的KEP乳腺肿瘤中，用qPCR检测并归一化为β-肌动蛋白（n=6只动物/组）。（e-g）的成绩单伊夫纳和Ifnb公司KEP乳腺肿瘤(伊夫纳：n=对照组ab中的5只动物，n=抗CSF-1R中的6只动物；Ifnb：n=3只动物在对照组ab中，n=5只动物在抗CSF-1R中）（e），原位移植K14cre；Trp53基因^前/后乳腺肿瘤(Ifna公司：n=对照组ab中的7只动物，n=抗CSF-1R中的8只动物；国际单项体育联合会：n=7只动物/组）（f）皮下接种MC38肿瘤（n=7只动物/组）（g）用对照ab和抗CSF-1R处理后，用qPCR检测并归一化为β-肌动蛋白。对肿瘤大小为100mm的小鼠进行分析²（KP）或治疗开始后12天（MC38）。（h）的成绩单伊夫纳（n=4只动物/组）和Ifnb公司CD11b中（顺铂组4只动物，顺铂/抗CSF-1R组3只动物）⁺80层/四层⁺用qPCR检测从终末期KEP肿瘤中分离的细胞，并将其归一化为β-肌动蛋白。中的图形c-h公司显示ΔCt值的平均值±SEM，并使用双尾Mann-Whitney检验进行统计分析。

我们假设这些瘤内免疫人群中ISG的富集是由于CSF-1R阻断后KEP肿瘤中I型IFN水平增加的结果。事实上，通过使用引物对所有基因进行杂交伊夫纳基因，mRNA表达伊夫纳，但不是Ifnb公司与顺铂/对照抗体治疗的小鼠相比，顺铂/抗CSF-1R治疗的KEP小鼠的肿瘤中(图3c). 与此相一致，各种细胞内模式识别受体的mRNA水平第三阶段,钻机1和第一类与顺铂/对照抗体治疗相比，顺铂/抗CSF-1R治疗的肿瘤中其信号诱导产生I型IFN的上调(图3d). 值得注意的是，抗CSF-1R后I型IFN表达的增加与化疗无关，因为肿瘤内IFN表达同样增加伊夫纳仅在抗CSF-1R上观察到表达(图3e)或使用多西他赛/抗CSF-1R(补充图5a). 我们还确认了伊夫纳-和两个ISG，第15期和Oas1a公司-在独立患者接受抗CSF-1R治疗后K14cre；Trp53基因^前/后-基于肿瘤移植模型和接种MC38结直肠癌肿瘤²¹(图3f，g和补充图5b，c). 这些数据表明，抗CSF-1R在TME中诱导I型IFN。

为了寻找I型干扰素的细胞来源，我们对顺铂和顺铂/抗CSF-1R治疗的KEP肿瘤的不同细胞群进行了流式分类(补充图5d)并进行了比较伊夫纳和Ifnb公司转录水平。浆细胞样树突状细胞（pDCs）因其产生I型干扰素的能力而闻名，然而，由于KEP肿瘤中存在的pDCs很少，不到肿瘤内总免疫人群的0.1%(补充图5e，f)，我们无法恢复足够质量的RNA。同样，我们也没有从分选的CD31中获得足够质量的RNA⁺内皮细胞。只有CD11b⁺80层/四层⁺免疫细胞数量增加伊夫纳CSF-1R阻断后的表达水平(图3h和补充图5g，h). 与这些一致体内调查结果，在体外抗CSF-1R适度诱导骨髓源性巨噬细胞伊夫纳培养24小时后的水平(补充图5i). 这些分析表明肿瘤内CD11b的存活人群⁺80层/四层⁺细胞是顺铂/抗CSF-1R治疗的KEP肿瘤中IFNα的重要来源。

为了剖析I型干扰素信号在顺铂/抗CSF-1R治疗益处中的功能意义，我们在KEP小鼠中阻断了干扰素-α/β受体亚单位1（IFNAR1）。虽然阻断I型干扰素信号不会影响顺铂的抗癌疗效，但抗IFNAR1治疗完全消除了顺铂/抗CSF-1R治疗的协同作用(图4a). 这些发现表明，在荷瘤KEP小鼠中以抗CSF-1R的巨噬细胞为治疗靶点，可以释放肿瘤内I型IFN信号，从而增强顺铂的治疗效果。

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图4

CSF-1R阻断可增加用艾马曲单抗治疗的癌症患者肿瘤内I型IFN信号的表达，对顺铂/抗CSF-1R在肿瘤细胞中的协同治疗至关重要K14cre；加拿大存托凭证1^前/后;Trp53基因^前/后小鼠模型。

（a）顺铂/对照ab、顺铂/抗CSF-1R治疗的KEP小鼠的Kaplan-Meier肿瘤特异性生存曲线（与图1f)、顺铂/抗IFNAR1（n=15只动物）或顺铂/反CSF-1R/抗IFNAR1（n=21只动物）。顺铂/抗CSF-1R与顺铂/对抗CSF-1R/抗IFNAR1的比较，p=0.0064（双尾对数库检验）。（b）艾美珠单抗（抗CSF-1R）治疗患者（n=31名患者）28个I型干扰素刺激基因（ISG）肿瘤内表达水平的Log2比值与治疗前表达水平标准化。（c）艾美珠单抗治疗患者肿瘤中11个具有统计学意义的上调I型ISG表达水平的方框图（与图4b). 比较治疗前（基线）肿瘤活检与治疗中（emactuzumab）活检的表达水平。最上面的线是最大值，方框的顶部是第三个四分位数，中心线是中位数，方框的底部是第一个四分位数，最下面的线是最小值。RPKM，每百万个映射读数中每千碱基外显子的读数。P值通过双尾Student t检验确定。

Emactuzumab治疗诱导癌症患者肿瘤内I型IFN刺激基因

为了验证我们的临床前研究结果，即CSF-1R阻断剂在患者体内释放肿瘤内I型IFN信号，我们比较了用人源化抗人CSF-1R单克隆抗体Emactumab（RG7155）治疗晚期实体瘤的癌症患者治疗前和治疗中肿瘤活检组织中ISG的表达水平({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01494688”，“term_id”：“ncT0149488”}}NCT01494688号)^21,30在治疗开始前和治疗4周后对肿瘤活检进行基因表达谱分析。我们评估了一组28个ISG的表达水平，这些ISG是根据我们KEP小鼠模型的RNA-seq结果选择的(图3a和补充图4a、c、d和补充表3). 与治疗前的活检相比，治疗中的emactuzumab活检中所有28个选定ISG的瘤内表达均增加，其中11个ISG显著上调(图4b、c). 因此，与我们的临床前研究一致，这些临床发现表明，CSF-1R阻断是增强肿瘤内I型IFN信号传导的强大策略。

体内干预研究

在开始治疗之前，将携带自发性乳腺肿瘤的KEP小鼠随机分为治疗组。小鼠腹腔注射嵌合（仓鼠/小鼠）抗CSF-1R抗体（克隆2G2，慕尼黑罗氏创新中心，单次加载剂量60 mg/kg，然后每周30 mg/kg）；对照抗体（IgG1，MOPC21，慕尼黑罗氏创新中心，单次加载剂量60 mg/kg，然后每周一次30 mg/kg）；抗Ly6G抗体（1A8，单次加载剂量400μg，然后每周三次100μg，BioXCell）；抗IFNAR1（MAR1-5A3，每周三次100μg，BioXCell）；抗CD8（2.43，单次加载剂量400μg，随后每周三次100μg，BioXCell）；抗NK1.1（PK136单次加载剂量400μg，随后100μg，每周三次，BioXCell）；IgG2a（C1.18.4单次加载剂量400μg，随后每周三次100μg，BioXCell）。每隔一周静脉注射MTD剂量的顺铂（5 mg/kg，Accord Healthcare Limited），共4个周期；每周静脉注射MTD剂量的多西紫杉醇（15 mg/kg，Accord Healthcare Limited），共4个周期；每10天静脉注射一次MTD剂量的奥沙利铂（6mg/kg，在NaCl中稀释，Fresenius Kabi），共3个周期。

当乳腺肿瘤达到25mm时，开始抗-CSF-1R、对照抗体、抗Ly6G、抗CD8和抗NK1.1治疗²当乳腺肿瘤达到50mm时，开始抗IFNAR1、顺铂、多西紫杉醇和奥沙利铂治疗²对于生存曲线实验和终末期分析，抗体治疗一直持续到肿瘤或累积肿瘤负荷达到225mm²对于生存曲线实验，事件被定义为具有225mm的累积肿瘤大小的动物²受检小鼠的主要死亡原因是溃疡性肿瘤或顺铂诱导的顺铂治疗小鼠的肾毒性。

对于时间点分析，在第二次化疗注射（治疗反应期）后一天或肿瘤大小为100mm时处死小鼠²在化疗-幼稚小鼠中。为了评估肿瘤细胞增殖，在处死前90分钟腹腔注射BrdU（50 mg/kg）。

将KP肿瘤块原位移植到10-12周龄FVB/N雌性小鼠的乳腺脂肪垫中。在开始治疗之前，将小鼠随机分为实验组，并使用上述对照抗体或抗CSF-1R进行治疗。从25毫米的肿瘤开始治疗²一直持续到肿瘤达到100毫米²当小鼠被处死时。

MC38肿瘤由慕尼黑罗氏创新中心提供。将MC38细胞皮下注射到C57Bl6/N小鼠体内，当肿瘤体积达到100mm时^三用上述对照抗体或抗CSF-1R治疗。第二次治疗后5天处死小鼠²¹.

干预研究K14cre；加拿大存托凭证1^前/后;Trp53基因^前/后-基于自发转移模型

先前详细描述了基于KEP的原位自发转移模型²⁷简单地说，将KEP肿瘤块（1x1 mm）原位移植到10-12周龄FVB/N雌性小鼠体内。乳腺肿瘤一旦达到225毫米大小，就进行手术切除²之后，对小鼠进行监测，并在它们因临床上明显的转移性疾病而达到人类终点时处死。乳腺肿瘤达到5mm后，用对照抗体或抗CSF-1R治疗荷瘤小鼠²（连续设置）或乳腺切除术后三天（辅助设置）。抗体治疗一直持续到受体小鼠出现转移性疾病引起的临床症状(例如呼吸窘迫）。

组织学、免疫组织化学、免疫荧光和RNA就地杂交

除NKp46 IHC外，所有组织化学和免疫组织化学分析均由阿姆斯特丹NKI的动物病理学机构进行。NKp46免疫组织化学在格拉斯哥英国癌症研究所Beatson研究所的组织学核心设施进行。为了进行组织化学分析，福尔马林固定组织按所述进行处理、切片和染色²⁷简单地说，将组织固定在10%中性缓冲福尔马林中24小时，包埋在石蜡中，在4μm处切片，并用HE染色以进行组织病理学评估。H&E幻灯片使用Aperio ScanScope（Aperio，Vista，CA）进行数字处理。为了定量评估肿瘤中失去生存能力的区域，使用ImageJ对载玻片进行分析，方法是量化肿瘤总面积中非生存区域（定义为失去细胞的区域）的百分比。肥大细胞的组织化学用甲苯胺蓝进行。

为了进行免疫组化分析，石蜡切片被切割并脱蜡。抗体和抗原检索方法在补充表1在OCT中嵌入的冰冻组织上进行顺铂加合物染色。通过两名独立操作员以盲法计算每个肿瘤的五个高倍视野（FOV），手动对阳性细胞进行定量。使用BX43立式显微镜（Olympus）对样品进行可视化，并使用cellSens Entry软件（Olymbus）在明亮区域采集图像。

根据肺部和淋巴结中有无转移结节的显微镜下表现，计算携带转移的自发KEP小鼠的百分比。在转移模型中，肺中转移结节的数量是基于细胞角蛋白8的表达。分析中包括出现明显转移性疾病的小鼠，排除因原发肿瘤局部复发而被处死的小鼠。

采用NKI-AvL核心设施分子病理学和生物银行（CFMPB）对RATHER队列中浸润性小叶癌乳腺癌患者的FFPE材料进行CD68表达（1:2000，克隆KP1，Dako）的免疫组织化学分析^58,59在NKI注册。根据国家档案材料使用指南，并经NKI-AVL翻译研究委员会（TRB）批准，使用匿名档案组织。

对FFPE材料进行免疫荧光分析。初级和次级抗体列表见补充表1切片用DAPI进行复染，并用徕卡SP5共聚焦显微镜进行可视化。使用LAS AF软件（Leica）拍摄图像，通过计算α-SMA获得数值⁺CD31型⁺细胞和总CD31⁺由2名独立研究人员在每个肿瘤的6个区域中培养细胞。

现场检测Csf-1型mRNA使用RNAscope®2.0 FFPE分析（高级细胞诊断，INC）进行，并根据制造商的建议进行⁶⁰.

流式细胞术

KEP肿瘤在冷藏PBS中收集，并按说明进行处理⁶¹简单地说，使用McIlwain组织切碎器（Mickle实验室工程）对样品进行机械切割，并在37°C的无血清培养基中用3 mg/ml A型胶原酶（Roche）和25μg/ml DNase I（Sigma）在摇动水浴中酶解1h。清洗后，用荧光结合抗体对细胞进行染色(补充表1). 对于颗粒酶B的细胞内染色，在含有8%FCS、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.5%β-巯基乙醇、50 ng/ml PMA、1μM离子霉素和Golgi-Plug（1:1000；BD Biosciences）的IMDM中刺激单细胞悬浮液，在37°C下刺激3 h。在表面抗原染色后，样品被固定和渗透（BD Biosciences），并对细胞内蛋白质进行染色。使用Diva软件（BD Biosciences）在BD LSRII或BD LSRFortessa流式细胞仪上进行数据采集，并使用FlowJo软件版本9.9.6进行数据分析。

肿瘤内细胞群的分离

在两个化疗周期（±100 mm）后的第1天，从KEP小鼠中获取原发性乳腺肿瘤²)或在末端（±225 mm²)如上所述生成单细胞悬浮液。CD11b的富集⁺如前所述，使用磁性柱（Miltenyi Biotec）对细胞进行检测⁶¹简言之，将单细胞悬浮液用抗CD11b-APC（1:200；克隆M1/70，eBioscience）染色20分钟，并根据制造商的说明（Miltenyi Biotec）与磁性抗APC微珠孵育。CD11b型⁺根据制造商的说明，用LS柱（Miltenyi Biotec）分离细胞。对于在治疗反应期从肿瘤中分离巨噬细胞和中性粒细胞，富集的CD11b⁺用Ly6G-FITC抗体（1:200；克隆1A8，BD Biosciences）、F4/80-PE抗体（1:2000；克隆BM8，eBioscision）和Ly6C-ef450抗体（1:400；克隆hk1.4，eBioscience）对部分进行染色。在PBS中以1:100的比例添加LIVE/DEAD®可固定的水死细胞染色剂（ThermoFisher Scientific），以排除死细胞。CD11b型⁺80层/四层⁺巨噬细胞和F4/80^-赖氨酸6G⁺Ly6C型^低的中性粒细胞用BD FACSARIA II分类器和DIVA软件（BD Biosciences）分离。

为了从终末期肿瘤中分离细胞群，我们分离了肿瘤内CD11b⁺和CD11b^-如上所述，通过磁性细胞分选细胞。CD11b^-和CD11b⁺如中所述对级分进行染色补充表1.CD11b⁺80层/四层⁺巨噬细胞，CD11b⁺80层/四层^-赖氨酸6G^-Ly6C型⁺单核细胞，CD11b⁺80层/四层^-赖氨酸6G⁺Ly6C型^低的中性粒细胞，CD11b^-CD45型⁺CD11c公司^-淋巴细胞和CD11b^-CD45型^-CD31型^-用BD FACSARIA FUSION分类器和DIVA软件（BD Biosciences）分离肿瘤细胞。

单核细胞过继性转移

收集雌性mTmG小鼠的前腿、后腿和臀部，并冲洗骨髓。骨髓细胞用Fc Block（1:50，CD16/CD32，BD Biosciences）孵育，用抗Ly6G-APC（1:200，克隆1A8，Biolegend）染色，因此使用磁性柱（Miltenyi Biotec）对中性粒细胞进行阴性选择，如前所述⁶¹.Ly6G^-然后用荧光结合抗体对部分进行染色(补充表1). 封锁世系之后⁺细胞（CD3、CD8、CD4、NKp46、Ter119）、Siglec F⁺，Sca1⁺和cKIT⁺细胞，td番茄⁺CD11b型^整数赖氨酸6G^-Ly6C型⁺使用BD FACSARIA FUSION分拣机和DIVA软件（BD Biosciences）分离单核细胞。1.5到2 x 10之间⁶td番茄⁺将单核细胞过继性转移到用对照抗体或抗CSF-1R治疗的荷瘤KEP小鼠的尾静脉。抗体治疗从25毫米的肿瘤开始²第二次抗体注射后一天（间隔一周），转移单核细胞。四天后处死KEP小鼠，分离肿瘤进行流式细胞术分析。抗体列于补充表1.

CRISPR/Cas9介导的基因破坏和集落形成分析

IFNAR1通过lentCRISPRv2瞬时转染从自发性KEP乳腺肿瘤细胞系中敲除⁶²包含IFNAR1特异性sgRNA靶向外显子1（sgRNA1:5'-GCTCGCTGTGGGCGG-3'）。转染24h后，细胞暴露于嘌呤霉素48h。细胞用IFNAR1-PE（1:200，克隆MAR1-5A3，eBioscience）染色，IFNAR1阴性细胞用BD FACSARIA FUSION sorter和DIVA软件（BD Biosciens）分选。

将250个KEP和IFNAR1 KO KEP细胞一式三份接种在24孔板中，第二天用更高浓度的重组IFNα1（Biolegend）处理细胞7天。第5天，添加4μM或8μM顺铂。第7天，清洗细胞，将其固定在冰镇甲醇中，并用0.05%结晶紫培养。为了定量，将结晶紫溶于10%乙酸中20 min，并在590nm处测量吸光度。

骨髓源性巨噬细胞

为了产生骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），从WT小鼠后腿采集骨髓细胞，在含有8%FCS、100 IU/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和20ng/ml重组M-CSF（Peprotech）的RPMI培养基中培养7天。分化后，收获BMDM并将其接种在24孔板（400000个BMDMs/孔）中，并培养过夜。第二天早上，将BMDM暴露于来自KEP癌细胞系的条件培养液（CM）中，其中含有8μg/ml的对照抗体或抗CSF-1R抗体，持续24小时。CM是通过在含有8%FCS、100 IU/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的RPMI中培养KEP癌细胞（80-90%融合）24小时获得的。用Isolate II RNA Mini Kit（Bioline）和定量RT-PCR分离BMDM的RNA伊夫纳如下所述执行。

RNA分离和定量RT-PCR

使用Trizol（Invitrogen）从KEP小鼠的分选细胞和肿瘤中分离RNA。根据制造商的建议，样品用DNase I（Invitrogen）处理，然后用Qiagen RNeasy Mini Kit进行RNA清理。用Nanodrop（Thermo Scientific）定量分离的RNA。使用寡核苷酸（dT）引物，使用克隆的AMV第一链cDNA合成试剂盒（Invitrogen）将RNA转化为cDNA。使用500 nM引物，通过SYBR green real-time PCR分析每孔20 ng的cDNA(补充表2)使用LightCycler 480热循环器（罗氏）。样品重复运行，只有当双工样品的Ct值之间的差异小于1个周期时才进一步考虑。β-actin作为参考基因。

Luminex细胞因子阵列

使用BioRad细胞裂解缓冲液制备肿瘤和乳腺，并根据制造商的建议，使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Fischer Scientific）测定裂解产物的蛋白质浓度。使用Bio-Plex Pro™细胞因子23-Plex试剂盒（BioRad）测定蛋白裂解物中的CSF-1浓度，并根据制造商的说明进行测量。使用Bio-Plex Manager 6.0软件（Bio-Read）在Bio-Plex 200阅读器上进行数据采集和分析。

RNA测序和数据分析

患者活检中IFN刺激基因的表达评估

I型干扰素刺激基因的选择基于我们的KEP小鼠顺铂/抗CSF-1R模型的RNA-seq结果。这些基因属于下列生物过程补充表3。我们通过分析使用人源化抗人CSF-1R单克隆抗体埃马曲单抗（RG7155）进行临床1期试验的患者的配对基线和治疗中肿瘤活检的RNA-Seq数据，评估了抗CSF-1R对人类肿瘤中这些选定基因的影响。活检取自一项多中心、开放标签研究(临床试验.gov标识符{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01494688”，“term_id”：“ncT0149488”}}NCT01494688号). 患者每两周接受一次艾美珠单抗静脉滴注。收集31例患者的肿瘤活组织检查，这些患者患有广泛的不同类型的实体恶性肿瘤，无论是单独使用emactuzumab还是联合使用紫杉醇治疗（乳腺过度表达[n=13]和卵巢癌[n=7]样本）。本研究是根据《赫尔辛基宣言》、当前国际人类使用药物注册技术要求协调会议（ICH）指南以及所有适用的监管和道德要求进行的。该研究符合所有涉及人类参与者的研究相关道德规范。所有患者在进行研究相关程序之前均提供了书面知情同意书。如前所述进行RNA提取、RNA-Seq和数据分析⁶⁹.

这项工作得到了欧盟（FP7 MCA-ITN 317445 TIMCC）、荷兰癌症学会（NKI10623）、欧洲研究理事会（ERC整合奖INFLAMET 615300）、全球癌症研究（AICR 11–0677）、荷兰科学研究组织NWO VIDI（917.96.307）和Oncode的支持。KK由OOA/NWO钻石拨款支持。KEdV是EMBO青年调查员。JLS是卓越集群ImmunoSensation的成员。JLS部分由DFG支持（SFB704，卓越集群免疫传感）。我们感谢M.D.Wellenstein、H.Garner、S.Bissinger、J.Borst和T.Schumacher进行了有益的讨论。我们感谢Michael Hauptmann对小鼠生存曲线统计分析的建议。我们感谢临床研究人员J.-Y.Blay、C.Gomez-Roca、J.-P.Delord、M.Toulmond、C.le Tourneau和A.Italiano使用emactuzumab、M.Cannarile、B.Quackenbush和A.Jegg进行临床试验，感谢他们在罗氏的转化医学支持。我们感谢英国比森癌症研究所的组织学核心机构对小鼠肿瘤组织进行NKp46免疫组化。我们感谢K.Wartha、S.Klarenbeek和I.Peters Rit的技术援助，以及参与RATHER项目的研究人员慷慨提供人类ILC组织切片。我们感谢荷兰癌症研究所的流式细胞仪设施、动物设施、动物病理设施和核心设施分子病理学和生物银行（CFMPB）。