内分泌学。2019年4月；160(4): 947–963.
NADPH氧化酶介导膜雄激素受体诱导的神经变性
, ,和
Mavis A A Tenkorang女士
德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心健康老化研究所生理解剖系
Phong Duong公司
德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心健康老化研究所生理解剖系
丽贝卡·坎宁安
德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心健康老化研究所生理解剖系
德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心健康老化研究所生理解剖系
2018年12月19日收到；2019年2月22日验收。
摘要
氧化应激（OS）是包括帕金森病（PD）在内的几种神经退行性疾病的共同特征。PD在男性中的发病率高于女性，这表明可能与雄激素有关。根据OS的存在，雄激素可能具有神经保护或神经损伤作用。具体而言，在OS环境中，雄激素通过膜相关雄激素受体（mAR）加剧OS诱导的损伤。为了研究雄激素在OS信号传导和神经退行性变中的作用，睾酮和雄激素受体激活对主要OS信号级联、NADPH氧化酶（NOX）1和NOX2的还原形式以及Gα问/肌醇三磷酸受体（InsP三R） ，进行了检查。为了创造一个OS环境，将永生化神经元细胞系暴露于H2哦2在细胞可渗透/细胞不可渗透雄激素之前。使用不同的抑制剂来检测G蛋白、mAR、InsP的作用三R、 和NOX1/2对OS生成和细胞存活率的影响。睾酮和DHT/3-哦-羧甲基肟（DHT）–BSA增加H2哦2-诱导OS和细胞死亡，表明与mAR有关。此外，经典AR拮抗剂并不能阻止睾酮在OS环境中的负面作用。因为没有已知的mAR特异性拮抗剂，所以使用AR蛋白降解剂ASC-J9来阻断mAR作用。ASC-J9阻断了睾酮的负面影响。为了确定mAR介导的OS相关信号，本研究检测了NOX1、NOX2、Gα问.NOX1、NOX2和Gα问只有抑制NOX才能阻止睾酮诱导的细胞丢失和OS。没有阻止G的影响α问或G蛋白活化对睾酮的负面影响。这些结果表明雄激素诱导的OS是通过mAR–NOX复合物而不是mAR–Gα问复杂。
帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病(1)预计到2030年，这种疾病的发病率将增加到约200万(2). PD的两个主要神经病理学特征是存在路易体和大脑黑质致密部多巴胺能神经元的丢失。当黑质内约80%的多巴胺能神经元丢失时，已确立的运动症状（静止性震颤、僵硬、运动迟缓）就会显现出来(三,4). 由于不存在用于PD诊断的实验室生物标记物或成像，因此PD诊断是一种临床诊断，需要至少存在两种已确定的运动症状。
虽然帕金森病的病因仍不清楚(5)，氧化应激（OS）与PD的发展和进展有关(6). OS是PD发病的早期事件，可先于黑质多巴胺能神经变性(7–9). 黑质致密部富含多巴胺能神经元（约25000个细胞）(10–12)，而这种组合可能是其易受操作系统攻击的基础。多巴胺及其代谢物具有高度反应性，因为多巴胺会自动氧化，产生自由基，导致黑质细胞的脆弱性(13,14). 除了多巴胺自身氧化外，主要的细胞OS信号级联也有助于多巴胺能神经元的脆弱性，如还原形式的NAD磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）和钙（Ca2+)神经毒性(15,16). NOX1和NOX2亚型可增加OS生成并在神经变性中起作用(17–21)包括PD中多巴胺能神经元的丢失(22,23). 确实，NOX可以影响钙2+释放和反之亦然(24–33). 例如，OS可以调节ryanodine受体和肌醇三磷酸受体（InsP三Rs）参与细胞内Ca2+通过典型G蛋白偶联受体（GPCR）G从内质网释放α问信号通路(30–33). 此外，抑制NOX可以阻断Ca2+信号(28). 因为这些信号通路可以诱导前馈环路，所以失调可能导致黑质脆弱性，最终导致PD。因此，确定影响前馈环路的机制至关重要。
帕金森病发病率和流行率的性别差异也得到了承认(34–38). 男性患PD的可能性是女性的1.5到2倍(36,39,40). 此外，在OS信号传导方面也观察到了性别差异。总的来说，男性的循环OS水平高于女性，NOX1和NOX2水平也高于女性(41–45). 事实上，性激素（雌激素、雄激素）可以影响OS的生成。众所周知，雌激素对OS的损伤具有保护作用(46,47). 然而，睾酮和DHT等雄激素在神经退行性变中的作用尚未得到广泛研究。
目前关于雄激素对细胞作用的研究结果模棱两可，其中雄激素被发现对细胞具有保护或破坏作用(48–52). 睾酮水平低是男性神经退行性疾病的危险因素(53–55). 然而，其他研究发现，睾酮可以诱导神经元丢失(56–60). 我们的实验室观察到，睾酮可能具有神经保护或神经损伤作用，这取决于细胞环境中OS的存在(58,60). 具体来说，我们发现睾酮在两种情况下都是氧化应激源体内和在体外研究(58–64). 根据细胞内OS的水平，睾酮诱导的OS可能通过预处理机制起到神经保护作用(58,65,66)或通过加剧现有操作系统损坏而造成的破坏(58–60,64,67–69). 使用细胞免疫雄激素(例如，睾酮与BSA结合），我们发现睾酮可以通过膜相关雄激素受体（mAR），特别是雄激素受体（AR）变体AR45，增加细胞OS，AR45缺失其调节N-末端结构域(58,60,70). 然而，由mAR启动的特定OS信号通路尚不完全清楚。为了解决这一知识空白，本研究调查了mAR诱导N27多巴胺能细胞系神经变性的机制。具体而言，NOX1/NOX2和G的作用α问/InsP公司三研究了R在OS环境中介导雄激素诱导的神经退行性变。
材料和方法
试剂
AR拮抗剂比卡鲁胺（编号B9061）从ApexBio Tech获得。AR降解剂（ASC J9，HY-15194）和NOX2抑制剂（编号GSK2795039）从MedChem Express购买。罗布青素（编号4663）和二苯碘氯化铵（DPI；编号0504）来自Tocris Bioscience。NOX1抑制剂（编号ML171）购自EMD Millipore。InsP公司三R抑制剂（2-APB；编号100065）和Gα问G蛋白抑制剂（BIM-46187；编号533299）购自Calbiochem。国内生产总值βS三锂盐（编号G7637）从Sigma-Aldrich/Millipore获得。抗体，包括MOX1（sc-25545用于NOX1）(71)，NOX2（sc-130543）(72)，山羊抗兔（sc-2004）(73)，山羊抗鼠（sc-2005）(74)，AR C19（sc-815）(75)、和Gα问（sc-365906）(76)来自圣克鲁斯生物技术公司。3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（GTX627408）(77)从GeneTex购买。二甲基亚砜（DMSO）来自VWR International，PBS来自Quality Biological。从Thermo Scientific公司购买了Pierce™双茚二酸蛋白检测试剂盒。蛋白质凝胶（编号456-1093）和Mini-PROTEAN TGX（编号456-9036）购自Bio-Rad实验室。蛋白质A–Sepharose（CL-4B）来自GE Healthcare。RPMI 1640是从HyClone购买的。青霉素/链霉素和TrypLE select（10×）从Gibco获得。胎牛血清（FBS）和我-谷氨酰胺是从康宁公司获得的，炭化的FBS是从亚特兰大生物制品公司获得的。泰特-丁基H2哦2（A13926）和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二甲四唑溴化铵（MTT；编号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“L11939”，“term_id”：“143914”，“term_text”：“L21939”}}L11939)是从阿尔法·埃萨尔那里购买的。从Cell Technology获得荧光硫醇检测试剂盒（编号FLTHIO100）。Super Signal West Femto化学发光基板购自Thermo Scientific。睾酮（编号A6950-000）和DHT/3-哦-羧甲基肟/BSA（DHT-BSA，编号A2574-050）是从甾体化合物中获得的。睾酮由100%乙醇中的储备溶液制成，而DHT-BSA则在培养基中制备。除G外的所有抑制剂α问蛋白质）由DMSO中的储备溶液制成。在所有载体对照组和治疗组中，二甲基亚砜和乙醇的最终浓度<0.001%。
细胞培养
永生化1RB3AN27（N27）多巴胺能神经元细胞系取自胎鼠中脑组织(78). 该细胞系表达酪氨酸羟化酶（TH），一种多巴胺能神经元的标记物，以及缺失调节性N末端结构域的AR的膜相关剪接变体AR45(58,69,70,79–81). N27细胞按照之前发表的方法进行培养(60). 细胞生长在添加有10%FBS和1%青霉素（100 U/mL）和链霉素（100μg/mL）的RPMI 1640培养基中，37°C，5%CO2细胞以6×10的密度播种496周细胞培养板中的每孔（用于细胞活力测定），6×104每100-mm培养皿（用于OS分析），以及1×106每100毫米培养皿（用于共免疫沉淀和蛋白质印迹研究）。为了确保N27细胞系的质量和完整性，我们在所有实验中只使用16到19代之间的传代。我们还根据形态学、倍增时间和对第三种-丁基H2哦2和睾丸激素(58,60).
实验设计
将细胞以6.0×10的密度放置在96个细胞培养板中4在添加10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中每孔细胞数，并在37°C、5%CO下培养24小时2在～80%的汇合处，将培养基改为RPMI 1640培养基，并加入炭样剥离的FBS，以消除混杂变量(例如，荷尔蒙）。由于培养基中仍含有盐、葡萄糖、氨基酸和其他营养物质，因此将细胞保存在炭化的FBS中不会对细胞活力产生负面影响(58,60,82). 本研究中使用的抑制剂（和相关载体对照）在H2哦2细胞暴露于10μM H2哦2持续2小时。H的浓度2哦2足以达到20%的细胞损失，这是达到雄激素对细胞产生负面影响的OS阈值所必需的。H之后2哦2暴露后，雄激素作用于细胞4小时。基于我们之前的研究(58,60)本研究中使用的雄激素浓度为100 nM睾酮和500 nM DHT-BSA。DHT-BSA浓度增加了五倍(即，500 nM）用于解释由于DHT-BSA（11个DHT分子与1个BSA分子结合）的结构导致的DHT受体结合减少。此外，这些雄激素浓度适合检测AR剪接变异体AR45，该变异体与全长AR对雄激素具有相似的亲和力(83).
细胞活力
如前所述，通过MTT分析测定细胞活力(60). 简单地说，将N27细胞以6.0×10的密度接种到96个细胞培养板中4每个孔中的细胞/mL。按照中所示进行处理。通过抽吸培养基并在每个孔中用100μL不含酚红的RPMI 1640培养基和木炭剥离的FBS孵育细胞，然后在37°C和5%CO下用20μL 5 mg/mL MTT孵育细胞，来检测细胞活力2持续3小时。在595 nm处读取吸光度。实验在三个不同的平板上重复至少三次；每个n是每个治疗组在一个平板上的八个孔的平均值。比色强度与活细胞的数量成正比。
实验设计。将N27细胞置于96个细胞培养板中，并在37°C和5%CO中培养2持续24小时。对所有抑制剂和AR降解剂进行两小时的预处理。在80%的汇合处，细胞暴露于OS或H2哦2持续4h，然后进行睾酮治疗。
氧化应激
如前所述，使用荧光硫醇检测试剂盒测量还原硫醇的水平(60,69). 细胞以6.0×10的密度在100-mm×20-mm细胞培养皿中培养4每个板的细胞数。与我们的细胞活性实验类似，在80%的汇合率下，细胞在H之前用抑制剂或载体处理2小时2哦2但他们只接触睾酮2小时，而不是4小时。此方法允许在细胞丢失之前测量OS。然后，用温和的裂解缓冲液（10×TrypLE select）在冰上裂解细胞，收集到试管中，高速离心1分钟，然后去除胰蛋白酶。将荧光硫醇裂解缓冲液（200µL）添加到每个试管中，均质并离心（10000 rpm）5分钟。收集上清液。还原硫醇（OS的反测量值）在细胞裂解物中定量（1.0×105细胞/mL）。至少进行了三个独立的实验，并在488 nm激发波长和525 nm发射波长下测量了荧光。
细胞裂解物和均质
遵循我们的实验设计()，将细胞置于冰上，用PBS洗涤，并使用Nonide P-40裂解缓冲液与二硫苏糖醇（1µM）、EDTA（1 mM）、磷酸酶和蛋白酶抑制剂（1:100）混合物进行裂解。将裂解产物均质并在4°C下以12753 rpm离心20分钟。然后去除上清液并分析蛋白质浓度。根据制造商的说明，使用Pierce bicinchonic acid蛋白质检测试剂盒测量蛋白质浓度。
协同免疫沉淀
对于联合免疫沉淀研究，以确定分子量约为40至50 kDa的蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用，方案稍作修改，将IgG带从45 kDa移动到100 kDa。将Nonide P-40裂解缓冲液中的细胞裂解液与各种一级抗体在4°C下搅拌培养过夜。第二天，将细胞裂解液和一级抗体混合物放在冰上，并添加珠浆（蛋白a–含有PBS的Sepharose珠）。将混合物在4°C下培养4小时，以最大速度离心2分钟，并抽吸上清液。为了从珠子中分离附着在第一抗体上的蛋白质，2×莱姆利样品加载缓冲液，含有β-巯基乙醇加入混合物中，并在37°C水浴中培养30分钟。在高速离心2分钟后，使用感兴趣蛋白质的各自抗体通过Western blotting测定蛋白质-蛋白质相互作用。
蛋白质印迹
在所有实验中，Bio-Rad AnykD或4%至20%的预制凝胶中加载20µg蛋白质，但使用37 5µg蛋白的联合免疫沉淀除外。实验是根据我们之前发布的协议进行的(70). 在室温25 mA下用SDS-PAGE分离蛋白质。然后，在50 V下过夜将蛋白质转移到4°C的聚偏二氟乙烯膜上。在搅拌下用Tris-buffered生理盐水和吐温20（TBST）快速清洗膜，并在室温下在TBST中的5%脱脂牛奶中培养以阻止非特异性结合。然后，用特定的一级抗体培养细胞膜（1:500稀释MOX1、NOX2和ARC19，1:1000稀释Gα问) (71,72,75,76)在TBST中加入1%脱脂牛奶，在4°C下过夜。在摇床上用TBST清洗两次膜10分钟，并在相应的二级抗体中培养30分钟（山羊抗兔和山羊抗鼠的1:1000稀释液）(73,74)在室温下，在TBST中加入1%脱脂牛奶。在清洗两次膜10分钟后，使用Super Signal West Femto化学发光分析检测蛋白带。使用Syngene G:BOX系统和FluorChem HD2 AIC软件对蛋白质条带强度进行成像。使用美国国立卫生研究院ImageJ密度计软件通过密度计测量蛋白质带密度，并将其归一化为GAPDH（1:10000稀释）。
统计分析
所有分析均使用IBM SPSS Statistics版本21软件进行。结果表示为平均值±SEM，aP（P）值≤0.05表示存在统计显著性差异。使用抑制剂、氧化应激源和激素作为独立因素，通过双向或三向方差分析进行比较。Fisher最小显著差异事后（post-hoc）分析用于评估不同组之间的差异。每个实验用不同的细胞培养物重复至少三次。
结果
mAR与NOX1、NOX2和G相互作用α问
此前，我们发现mAR，即AR45剪接变异体，定位于质膜内的脂筏(70)表明mAR是一个通信枢纽的组成部分，可以促进其与膜相关蛋白的相互作用，从而启动细胞信号(例如，操作系统信号）。确定mAR(即，AR45）与膜相关NOX1/NOX2和G的配合物α问/InsP公司三R OS信号级联，我们对N27细胞裂解物进行共免疫沉淀。免疫沉淀感兴趣的特定蛋白，NOX1的一级抗体(即、MOX1）、NOX2和AR45(即，AR-C19）(71,72,75)使用了。接下来，我们使用G的一级抗体来探索蛋白质与蛋白质的相互作用α问、NOX1、NOX2和AR45(71,72,75,76)表明AR45与NOX1和NOX2络合。与我们之前的出版物一致，AR45与G复合α问(70). 尽管AR45与G耦合α问，NOX1或NOX2与G之间没有蛋白质相互作用α问观察到(). 仅观察到45kDa的AR45蛋白，表明共免疫沉淀研究正在确定蛋白质与mAR的相互作用。
AR45、NOX1和NOX2的免疫共沉淀以确定蛋白质复合物。使用特定抗体沉淀NOX1、NOX2和AR45蛋白质，然后用相应的NOX1，NOX2，和AR45抗体进行探测，以确定蛋白质-蛋白质相互作用。NOX1、NOX2和AR45相互作用形成蛋白质复合物。（A） G公司α问与AR45耦合，但不与NOX1或NOX2交互。（B） 睾酮可以与mAR、AR45结合，并通过其与NOX1、NOX2和G的蛋白质相互作用激活多种信号通路α问在一个脂筏里。图中显示了Caveolin（紫色）、flotillin（蓝色）和磷脂（橙色）。Co-IP，共免疫沉淀；WB、Western blot。
睾酮的有害作用不是通过经典的基因组途径介导的
我们之前发表的研究表明，经典AR拮抗剂氟他胺并没有阻断睾酮的负面作用(58). 在本研究中，我们使用经典AR拮抗剂比卡鲁胺加强了我们的发现。比卡鲁胺与AR的配体结合囊结合，并通过未能诱导正确的构象变化来抑制AR(84,85). 因此，为了证实睾酮的有害作用不是通过经典的细胞溶质AR介导的，使用了比卡鲁胺AR拮抗剂。正如预期的那样，睾酮不会影响细胞活力()、和H2哦2细胞活力显著降低(F类1,16= 799.2,P（P）< 0.05). OS与激素之间的显著相互作用表明，在OS存在的情况下，睾酮进一步降低了细胞活力(F类1,16= 165,P（P）< 0.05). AR拮抗剂比卡鲁胺对细胞活力无影响，与OS环境无关。此外，比卡鲁胺并没有阻止睾酮在OS环境中对细胞活力的负面作用。
睾酮的有害影响不是通过经典的基因组途径介导的。睾酮本身并不影响细胞活力。H（H）2哦2诱导～20%的细胞丢失，睾丸激素加重了细胞丢失。（A） AR拮抗剂比卡鲁胺在OS环境中不能阻止睾酮的负面影响。（B） 睾酮没有改变AR45的表达。AR降解剂ASC J9显著降低了AR45的表达，而与睾酮的存在无关。（C） ASC J9阻断了OS环境中睾酮诱导的细胞丢失，但不影响H2哦2-诱导细胞丢失。结果以平均值±扫描电镜（SEM）的形式报告。结果通过方差分析（ANOVA）确定，然后是Fisher最小显著差异事后（post-hoc）测试*P（P）与所有组相比≤0.05；#P（P）≤0.05 vs对照组；+P（P）与HT组相比≤0.05。B、 比卡鲁胺；C、 车辆控制；H、 H（H）2哦2; HT，后处理T；J9，ASC J9；T、 100 nM睾酮。
由于经典AR拮抗剂不影响睾酮的作用，因此使用AR降解剂ASC J9降解细胞溶质和mAR。ASC J9通过干扰AR和AR协调剂之间的相互作用选择性地促进AR降解，而不影响AR mRNA的表达(86). 为了确保ASC J9降解mAR蛋白（45 kDa(70,87,88). 与我们之前的调查结果一致(70)，睾酮没有改变mAR蛋白的表达(). 相反，ASC J9显著降低了mAR的表达(F类1,8个= 10.6,P（P）<0.05），不考虑睾酮暴露(). 为了确定在OS环境中降解mAR是否会影响睾酮的负面影响，在暴露于H之前，用ASC J9预处理N27细胞2小时2哦2和睾丸激素(). 正如预期的那样，观察到OS暴露对细胞存活率的显著负面影响(F类1,28= 167.1,P（P）< 0.05). 此外，氧化应激源和睾酮治疗之间的显著交互作用(F类1,28= 8.2,P（P）<0.05）以及氧化应激源、激素和降解物之间(F类1,26= 4.5,P（P）<0.05）。具体来说，H2哦2诱导～20%的细胞丢失，睾酮加剧H2哦2-诱导细胞丢失。AR降解剂阻止了睾酮对OS环境中细胞活力的负面影响。然而，AR降解剂不影响H2哦2-诱导细胞丢失。
G蛋白和InsP的作用三睾酮诱导的神经退行性变中的R
因为AR45与G复合α问() (70)，确定Gα问在操作系统环境中睾丸激素的破坏作用中起着重要作用。规范的GPCR Gα问信号通路，参与细胞内钙2+通过赖氨酸受体和InsP从内质网释放三Rs，可以增加OS(89). 为了检验这一途径，G蛋白活性被GDP阻断βS三锂，Gα问BIM-46187和InsP三R被2-APB阻断。在使用GDPβS三锂是一种GDP类似物，可阻断G蛋白活性，这是氧化应激源的显著作用(F类1,29=206.8，P（P）<0.05），激素(F类1,29= 51,P（P）<0.05），以及氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,29= 40.6,P（P）<0.05）。正如预期的那样，我们没有观察到睾酮单独的影响，也没有观察到H的显著影响2哦2细胞活力～20%细胞损失。睾酮在氧化应激源的存在下，导致细胞活力进一步降低。然而，GDPβS三锂既不阻断H2哦2也没有睾酮在操作系统环境中的负面影响。
G蛋白和InsP的作用三睾酮诱导的神经退行性变中的R受体。（A和B）GDPβGDP模拟物S三锂和G BIM-46187α问在OS环境中，抑制剂不能保护细胞免受睾酮的有害影响。（C） InsP公司三R抑制剂2-APB能够阻止睾酮在OS环境中的破坏作用。结果以平均值±扫描电镜（SEM）的形式报告。结果通过方差分析（ANOVA）确定，然后是Fisher最小显著差异事后（post-hoc）测试*P（P）与所有组相比≤0.05；#P（P）≤0.05 vs对照组；+P（P）与HT组相比≤0.05。C、 车辆控制；G、 国内生产总值βS三锂；Gq，BIM-46187；H、 H（H）2哦2; HT，后处理T；一、 2-APB；T、 100 nM睾酮。
接下来，Gα问被BIM-46187阻止。我们发现氧化应激源的显著影响(F类1,23= 303.1,P（P）<0.05），激素(F类1,23= 70.8,P（P）<0.05），以及氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,23= 65.4,P（P）< 0.05) (). 同样，没有观察到睾酮单独的影响。H（H）2哦2显著诱导～20%的细胞丢失，睾酮使H恶化2哦2的破坏性影响。与GDP类似，Gα问该抑制剂并没有阻止睾酮在OS环境中的有害影响。这些结果表明，睾酮通过mAR的破坏作用不是通过Gα问蛋白质途径，尽管AR45与G复合α问.
最后，我们研究了InsP的影响三抑制睾酮对细胞活力的负面影响。我们发现氧化应激源的显著影响(F类1,48= 314.10,P（P）<0.05），激素(F类1,48= 58.8,P（P）<0.05），抑制剂(F类1,48=35.1，P（P）<0.05），氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,23= 65.4,P（P）<0.05），以及氧化应激源、激素和InsP之间的相互作用三R抑制剂(F类1,48= 27,P（P）< 0.05) (). 与我们之前的研究一致，睾酮本身并不影响细胞活力，而H2哦2做。睾酮加重H2哦2对细胞的有害影响。InsP公司三单独使用2-APB抑制R对细胞没有影响，与OS环境无关。与之前对GDP的观察相比βS三锂和BIM-46187，2-APB能够在OS环境中保护细胞免受睾酮的负面影响。InsP的这一发现三R信号传导，介导细胞内钙2+释放，扩展了我们之前的工作，表明mAR对OS的负面影响和N27细胞的细胞活力受到钙的影响2+流入线粒体(58).
NOX抑制剂对OS生成和细胞丢失的影响
为了确定NOX是否参与mAR诱导的OS，我们使用了常用的NOX抑制剂，罗布青素和DPI，根据其IC50（分别为10μM和39 nM）的不同浓度(90,91). 无论使用何种浓度（10至80 nM），DPI对细胞都是有毒的。然而，在所研究的任何剂量（3至20μM）中，罗布青素都不会影响细胞活力(). 因此，在随后的实验中，罗布青素被用作NOX抑制剂。
非特异性NOX抑制剂对OS生成和细胞丢失的影响。（A） 无论使用何种浓度，DPI对N27细胞都有毒性。Apocynin没有显示毒性。（B） 睾酮单独增加了OS生成，减少了硫醇。Apocynin阻断了睾酮对OS生成的影响。（C） 睾酮单独使用对细胞活力没有影响。罗布麻素不能保护细胞免受H的侵害2哦2的效果。在OS环境中，罗布青素阻止睾酮诱导的细胞丢失。（D） 同样，罗布青素阻断DHT-BSA加重H2哦2-诱导细胞丢失。结果以平均值±扫描电镜（SEM）的形式报告。结果通过方差分析（ANOVA）确定，然后是Fisher最小显著差异事后（post-hoc）测试*P（P）与所有组相比≤0.05；#P（P）≤0.05 vs对照组；+P（P）与HT组相比≤0.05。A、 罗布麻素；C、 车辆控制；H、 H（H）2哦2; HT，治疗后睾酮；T、 100 nM睾酮，500 nM DHT-BSA。
通过定量还原硫醇（OS的反向测量）来测量OS。氧化应激源的显著影响(F类1,16= 124.2,P（P）<0.05），激素(F类1,16= 28.7,P（P）<0.05），抑制剂(F类1,16= 19.3,P（P）<0.05），氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,16=3.7，P（P）<0.05），以及氧化应激源、激素和抑制剂之间的相互作用(F类1,16= 2.3,P（P）<0.05）(). 与我们之前的出版物一致(58–60,63)睾酮是一种氧化应激源。睾酮和H2哦2显著降低还原硫醇水平，表明OS增加。此外，睾酮加剧了H2哦2-通过进一步减少还原硫醇诱导OS。氮氧化物抑制剂罗布麻素不会改变H2哦2-诱导细胞丢失，表明H2哦2通过非NOX机制增加OS。然而，罗布青素阻断了睾酮诱导的OS，表明NOX介导睾酮诱导OS的生成。
细胞活力测定也观察到类似的范例，只是睾酮单独对细胞活力没有影响。氧化应激源的显著影响(F类1,23= 13.4,P（P）<0.05），氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,23= 21.4,P（P）<0.05），以及氧化应激源、激素和抑制剂之间的相互作用(F类1,23= 10.3,P（P）<0.05）(). 具体来说，H2哦2细胞活力降低，导致约20%的细胞丢失。睾酮加重H2哦2-诱导细胞死亡，并被罗布青素阻断。无论暴露于OS中，Apocynin对细胞活力均无影响。使用DHT-BSA观察到类似的模式，我们显示了氧化应激源的显著影响(F类1,21= 513.9,P（P）<0.05），激素(F类1,21=81.8，P（P）<0.05），抑制剂(F类1,21= 57.8,P（P）<0.05），以及氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,21= 17,P（P）< 0.05). H（H）2哦2诱导～20%的细胞丢失，DHT-BSA进一步增加H2哦2-诱导细胞丢失。Apocynin没有改变H2哦2对细胞活力的影响。然而，在OS存在的情况下，apocynin阻断了DHT-BSA的有害影响，这意味着mAR和NOX参与了OS环境中雄激素的负面影响。
因为罗布麻素是一种非特异性氮氧化物抑制剂(92,93)，检测NOX1和NOX2在睾酮介导的细胞丢失中的作用。用选择性NOX1抑制剂ML171预处理细胞(94,95)，后跟H2哦2和睾丸激素。氧化应激源的显著影响(F类1,47= 321.5,P（P）<0.05），激素(F类1,47= 60.9,P（P）<0.05），抑制剂(F类1,47= 8.9,P（P）<0.05），氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,47= 64.1,P（P）<0.05），以及氧化应激源、激素和抑制剂之间的相互作用(F类1,47= 9.3,P（P）<0.05）。与之前的观察结果类似，H2哦2细胞活力降低，睾酮进一步加剧H2哦2-诱导细胞丢失。然而，ML171本身或在睾酮存在的情况下并没有改变细胞的活性。此外，ML171不能保护细胞免受H的侵害2哦2与罗布麻素的观察结果相反，ML171在OS环境中对睾酮诱导的细胞损失具有部分保护作用().
选择性NOX抑制剂对睾酮诱导的细胞丢失的影响。（A） 选择性NOX1抑制剂ML171对细胞活力没有影响。H（H）2哦2-ML171未阻断诱导的细胞丢失。ML171部分阻断了OS存在下睾酮诱导的细胞丢失。（B） 选择性NOX2抑制剂GSK2795039对细胞活力没有影响。H（H）2哦2-GSK2795039未阻断诱导的细胞丢失。GSK2795039部分阻断了OS存在下睾酮诱导的细胞丢失。结果以平均值±扫描电镜（SEM）的形式报告。结果通过方差分析（ANOVA）确定，然后是Fisher最小显著差异事后（post-hoc）测试*P（P）与所有组相比≤0.05；#P（P）≤0.05 vs对照组；+P（P）与HT组相比≤0.05。C、 车辆控制；H、 H（H）2哦2; HT，后处理T；N、 ML 171；N2，GSK2795039；T、 100 nM睾酮，500 nM DHT-BSA。
使用选择性NOX2抑制剂GSK2795039进一步检测NOX2在睾酮诱导的神经变性中的作用。再次，H2哦2细胞活力降低，睾酮进一步加剧H2哦2-诱导细胞丢失。然而，GSK2795039单独或在睾酮的存在下，并没有改变细胞活力。GSK2795039不能保护细胞免受H2哦2表明GSK2795039在该浓度下不具有一般抗氧化性能。与ML171的观察结果类似，GSK2795039部分阻断了H存在时睾酮诱导的细胞丢失2哦2.氧化应激源的显著影响(F类1,28= 233.5,P（P）<0.05），激素(F类1,28=34.6，P（P）<0.05），抑制剂(F类1,28= 4.3,P（P）<0.05），氧化应激源和激素之间的相互作用(F类1,28= 24.5,P（P）<0.05），以及氧化应激源、激素和抑制剂之间的相互作用(F类1,28= 4.6,P（P）<0.05）(). 基于使用ML171和GSK2795039的这些发现，细胞暴露于NOX1和NOX2抑制剂，目的是在OS环境中实现对睾酮神经毒性效应的完全保护。有趣的是，H中的抗氧化作用2哦2观察组显示出非特异性抗氧化特性。这种普遍的抗氧化作用可能是由于这些抑制剂的酚类结构所致，它们可以在较高水平上发挥抗氧化作用(96–98). 因此，我们无法检测这些抑制剂在OS环境中对睾酮诱导的细胞丢失的联合作用。
AR降解对NOX1和NOX2蛋白表达的影响
因为mAR(即，AR45）与NOX1和NOX2复合，我们希望确保mAR蛋白降解不会改变NOX1与NOX2蛋白的表达。使用AR降解剂ASC J9对N27细胞进行两小时预处理，无论OS或睾酮暴露如何，都不会改变NOX1或NOX2的表达(). 尽管ASC J9的mAR降解似乎影响NOX2的表达，但所有治疗组均无统计学意义(F类1,24= 3.95,P（P）= 0.059) ().
AR降解对NOX1和NOX2蛋白表达的影响。（A和B）使用ASC J9降解AR45不会影响NOX1或NOX2的表达。数据表示为（a）NOX1和（B）NOX2的蛋白带密度与GAPDH的归一化比率，并表示为平均值±SD。结果由ANOVA确定，然后是Fisher最小显著差异事后（post-hoc）测试。C、 车辆控制；H、 H（H）2哦2; HT，后处理T；J9，ASC J9；T、 100 nM睾酮。
讨论
无论年龄大小，患PD的男性多于女性(35,40,69,99). 性激素被认为与这种差异有关。有趣的是，AR以配体依赖的方式可以诱导TH基因的转录活性(100)增加TH活性(101). 因此，雄激素可以调节多巴胺能神经元和多巴胺合成，并最终通过多巴胺的自氧化作用调节OS的生成(13,14). 此途径可能是通过OS预处理实现雄激素神经保护的基础(58)男性帕金森病发病率增加。值得注意的是，AR在受PD影响的黑质致密部表达，而在黑质网状部不表达(102). 众所周知，AR可以调节重要的生理和生物活动，包括情绪和性欲(103–105)，性生殖功能(106)、学习和记忆(107,108). 事实上，在患有帕金森病的男性中，睾酮水平下降与认知能力低下有关(109)性欲下降和勃起功能障碍(110–112). 帕金森病患者的睾酮替代治疗显著改善了运动和非运动症状(113,114). 然而，根据报道，雌激素通过雌激素受体α还可以上调TH活性(115,116)雄激素诱导的TH转录调控不能完全解释男性与女性相比发病后PD症状增加的原因(117–119). 因此，在本研究中，其他可被雄激素调节的OS信号级联，如NOX1、NOX2和Gα问/InsP公司三R进行检查。
通过非基因组机制低水平的雄激素（1 nmol/L）可加剧OS诱导的多巴胺能神经元损伤(58,60)支持mAR在睾酮在OS环境中的负面影响中的作用。mAR的功能尚不清楚，但有人建议它可以调节雄激素的快速非基因组作用(120–122)并且不受经典AR拮抗剂的影响(58). 此外，尚不清楚mAR是全长AR、截断AR还是定位于质膜的未知AR。最近，我们的实验室发现存在AR剪接变异体AR45，定位于黑质致密部和多巴胺能N27细胞内的脂筏(70). AR45缺乏N-末端调控结构域，导致分子量为45 kDa，与分子量为110 kDa的全长AR不同(84,106). 年龄和睾酮均不影响AR45的表达(70). 在本研究中，与经典AR拮抗剂不同，使用ASC J9降解AR45确实阻止了mAR加重OS诱导的损伤，支持AR45作为mAR的作用。这很有趣，因为目前还没有已知的mAR拮抗剂。据我们所知，这是第一项在中枢神经系统中显示mAR抑制作用的工作。
根据以前的出版物显示AR45与G相互作用α问脂筏内的蛋白质(70)睾酮增加细胞内钙2+N27电池中的释放(58)G的角色α问/InsP公司三R/Ca公司2+确定了mAR AR45诱导的神经退行性变的途径。尽管AR45与G复合α问蛋白质，Gα问不影响mAR诱导的神经退行性变，Gα问蛋白质抑制剂或GDP类似物。有趣的是，抑制InsP三R、 调节细胞内钙2+释放，确实阻断了mAR诱导的神经退行性变。临床研究发现阻断钙的治疗益处2+.二氢吡啶Ca2+研究表明，通道阻滞剂可以降低PD的风险、进展甚至死亡率(123–128). 此外，目前正在进行伊拉地平（二氢吡啶钙2+通道阻滞剂），可以更好地了解钙2+通路与PD及其治疗潜力(129).
除了规范的GPCR Gα问InsP的通路调节三R代表细胞内Ca2+从内质网释放(30–33)，NOX会影响InsP三R介导的钙2+释放(24–33,130). NOX系列有七个成员：NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox 1和Duox 2。众所周知，NOX酶与多巴胺能神经元有关(131,132)在正常细胞生理学中起着重要作用，包括分化、增殖和免疫反应(133–135). 事实上，一些研究报告称，NOX是脑细胞活性氧的主要来源(16,22)除线粒体外，NOX的失调可导致神经元功能障碍。NOX1、NOX2和NOX4在神经元中表达(136–139). 事实上，NOX1和NOX2已被证明在PD患者的多巴胺能神经元中表达(20,140). PD患者死后黑质组织中NOX2的表达高于非PD患者(131). 在几个PD实验模型中[例如、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶、鱼藤酮和6-羟基多巴胺（AR）毒素]，包括N27多巴胺能细胞系，NOX1和NOX2可以介导多巴胺能神经元死亡(20,22,141–147).
N27细胞系表达NOX的NOX1、NOX2、NOX4、Duox 1和Duox 2同源物(20)本研究证实了N27细胞中存在NOX1和NOX2。本研究通过显示NOX1和NOX2与AR45的复合物扩展了这些发现。为了确定NOX在mAR神经退行性变中的作用，使用了两种广泛使用的非特异性小分子NOX抑制剂，即罗布青素和DPI(91,142,148,149)，因为两者都显示了神经退行性疾病的神经保护益处(150–155). 虽然先前使用DPI的研究观察到N27细胞对6-OHDA诱导的OS具有保护作用(20)，这不适合我们的研究，因为DPI对N27细胞有毒。已在其他细胞中观察到DPI毒性，如N11胶质细胞和从大鼠心脏分离的培养细胞，DPI阻断了主要的抗氧化途径，导致OS增加和细胞凋亡(156,157). 相反，事实证明，该细胞系中的罗布青素无毒，是理想的NOX抑制剂。这与文献报道的罗布青素在两种药物中的有效性和低毒性一致在体外和体内模型(91,158). 先前的研究表明，在帕金森病的实验模型中，apocynin降低了NOX激活、炎症和凋亡(132,159). 事实上，在这项研究中，罗布青素阻断了睾酮在OS环境中的神经损伤作用，表明NOX1和NOX2都参与其中。Apocynin对H无影响2哦2-诱导细胞丢失。这种效果并不意外，因为第三种-丁基H2哦2通过两条途径对OS产生影响：细胞色素P450产生过氧自由基和烷氧自由基，谷胱甘肽过氧化物酶产生脂质过氧化(160). 重要的是，注意第三种-丁基H2哦2本研究中使用了不影响NOX蛋白表达的。
Apocynin的作用机制存在争议。它可以作用于NOX1和NOX2(21)以及其他黄素蛋白酶(92,161,162). 因为在N27细胞中，随着6-OHDA和鱼藤酮PD毒素的作用，NOX1而非NOX2的表达增加(20,147)，本研究检测了NOX1和NOX2。使用不影响NOX2活性的NOX1特异性抑制剂ML171检测NOX1(94,163). ML171是一种未经取代的吩噻嗪，在阻断NOX1依赖性活性氧生成方面表现出非常高的效力(94). 与对罗布青素的观察相反，这种选择性NOX1抑制剂仅部分抑制了N27细胞在OS环境中睾酮的负作用。这些结果表明，涉及另一个NOX亚基，如NOX2，其也与AR45复合。事实上，GSK2795039选择性抑制NOX2部分阻断了OS环境中睾酮诱导的细胞丢失。虽然NOX2通常与星形胶质细胞和小胶质细胞有关(16,131,164,165)，NOX2在多巴胺能神经元中表达(20,140)并可能影响操作系统(144). 与经口生物利用的apocynin不同(166–168),体内由于口服生物利用度低和需要静脉注射，NOX2抑制剂的使用受到限制(163).
因为在临床试验中缓解线粒体相关OS缺乏成功(169)NOX抑制剂可能是治疗PD的潜在药物。NOX1、NOX4和NOX5抑制剂GKT137831经口生物利用，在人类中耐受性良好。此外，这是唯一一种NOX抑制剂，已在170多名患者中进行临床试验(170,171). 罗布青素也被认为是一种可能的治疗方法。使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶PD模型，发现罗布青素可以保护非人类灵长类动物的多巴胺能神经元并改善运动功能(172). 虽然还没有在神经退行性变患者中测试过罗布青素，但它降低了哮喘患者的OS生成(173). 这些临床前和临床研究似乎很有希望。由于NOX1和NOX2与AR45复合，与绝经前女性相比，抑制NOX可能是减缓男性或绝经后女性PD进展的潜在治疗方法(174,175).
总之，本研究提供了以下证据：（i）AR45位于与NOX1、NOX2和G的脂筏复合物中α问; （ii）Gα问与NOX1和NOX2不复杂；（iii）雄激素的负作用通过AR45和NOX介导；（iv）Gα问不介导睾酮的负面影响；和（v）InsP三R参与睾酮诱导的神经变性(). 这项研究的结果有助于确定关键参与者(例如mAR、NOX和InsP三R介导的钙2+)睾酮诱导的神经退行性变可能成为帕金森病的潜在治疗靶点。
工作模式。膜AR(即，AR45）存在于质膜内的脂筏中，并与NOX1、NOX2和G复合α问睾酮可以结合并激活AR45，从而刺激NOX1和NOX2，从而产生OS。或者，AR45–NOX复合物可以上调InsP三R活性增加细胞内钙释放，导致OS增加。该途径的失调可导致神经毒性，例如在PD期间。AR45–Gα问在OS环境中，该通路不参与睾酮诱导的细胞丢失。PLC，磷脂酶C。
致谢
我们感谢Brina Snyder博士、George Farmer博士、J.Thomas Cunningham博士和Nataliya Rybalchenko博士的技术援助。
财务支持： 这项工作得到了美国国立卫生研究院/美国国家神经疾病和中风研究所拨款R01 NS0091359（发给R.L.C）的支持。
作者贡献： M.A.A.T.完全可以访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性承担全部责任。
披露摘要：作者没有什么要透露的。
词汇表
缩写：
| 6-羟基多巴胺 | 6-羟基多巴胺 |
| 应收账 | 雄激素受体 |
| DHT-BSA公司 | DHT/3型-哦-羧甲基肟/BSA |
| 二甲基亚砜 | 二甲基亚砜 |
| DPI公司 | 二苯碘氯化铵 |
| FBS公司 | 胎牛血清 |
| 间隙 | 3-磷酸甘油醛脱氢酶 |
| 全球采购控制报告 | G蛋白偶联受体 |
| InsP公司三R（右） | 肌醇三磷酸受体 |
| 马尔代夫 | 膜相关雄激素受体 |
| MTT公司 | 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二甲四唑溴 |
| NADPH公司 | 还原型NAD磷酸盐 |
| 氮氧化物 | 还原型NAD磷酸氧化酶 |
| 操作系统 | 氧化应激 |
| PD公司 | 帕金森病 |
| TBST（待定） | 含吐温20的三缓冲盐水 |
| 真实航向 | 酪氨酸羟化酶 |
工具书类
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