医学Primatol杂志。作者手稿；PMC 2020年2月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院987237
猕猴颈阴道微生物组采样方法的比较
,1 ,1 ,2 ,三和1,4,5
马修·罗尔斯通
2加利福尼亚大学戴维斯分校宿主微生物系统生物学核心
丽本·雷曼
三宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系
Smita S.Iyer博士
1加州大学戴维斯分校比较医学中心
4加州大学戴维斯分校加州国家灵长类动物研究中心
5加州大学戴维斯分校兽医学院病理学、微生物学和免疫学系
1加州大学戴维斯分校比较医学中心
2加利福尼亚大学戴维斯分校宿主微生物系统生物学核心
三宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系
4加州大学戴维斯分校加州国家灵长类动物研究中心
5加州大学戴维斯分校兽医学院病理学、微生物学和免疫学系
通信地址：Smita S.Iyer，博士，兽医学院病理学、微生物学和免疫学系，核心科学家，ID单元，加利福尼亚州国家灵长类动物研究中心，比较医学中心，加州大学戴维斯分校，2005室，CCM，County Rd 98&Hutchinson Drive，Davis，CA 95616，电话：530-752-4376，ude.sivadcu@reyims 摘要
宫颈阴道细菌引起炎症，从而增加艾滋病毒感染风险。因此，分析宫颈阴道微生物组有助于疫苗开发。我们表明，通过宫颈阴道灌洗获得的微生物群特征与通过阴道拭子获得的样本具有可比性。因此，灌洗可作为NHP疫苗研究的抽样策略。
关键词：16S rRNA、HIV、拭子、灌洗
简介
女性下生殖道（FGT）的微生物影响女性感染HIV的风险，并可能影响HIV疫苗的效力(1–三). 因此，在临床前HIV疫苗研究中，特别是在阴道挑战模型中，FGT微生物组分析是必要的，以严格解释疫苗的疗效。
常规FGT微生物组分分析的一个障碍是难以通过抽吸获得足够数量的阴道分泌物，以便准确评估粘膜微生物组和疫苗合法抗体滴度，尤其是在老年动物中。因此，宫颈阴道灌洗（CVL）是首选技术。虽然在恒河猴中的一些研究已经使用CVL来分析FGT微生物组成，但确定CVL捕获的细菌群落是否与拭子捕获的细菌群足够相似对于支持CVL的常规掺入以更有效地进行微生物组分分析非常重要(4,5).
我们的数据表明，CVL的粘膜相关微生物组图谱代表了通过拭子获得的微生物组图谱，允许拭子优先用于体液分析，CVL优先用于微生物组分析。这些发现支持在NHP疫苗研究中采用CVL进行有效的FGT微生物群采样。
材料和方法
动物和采样
加州国家灵长类动物研究中心（CNPRC）从室内恒河猴群体中挑选了四只成年月经期雌性恒河猴(). 选定的动物在取样前至少4周没有接受口服抗生素治疗或药物治疗。在麻醉下对动物进行取样，收集配对阴道拭子和宫颈阴道灌洗液。简单地说，用Weck-Cel眼针海绵收集阴道拭子，海绵预先与50μL生理盐水混合，插入5分钟收集分泌物。随后，用盐水浸泡的纱布垫彻底清洁会阴区。使用无菌1 cc注射器将1 ml PBS滴入阴道。然后将液体抽吸并轻轻地再静置几次。将拭子放在干冰上，将CVL放在冰上，直到采集后三小时内进行处理。简单地说，CVL样品在4°C下以1500 rpm离心5分钟，以从上清液中分离细胞部分，如我们之前所述(6). 分离细胞颗粒和上清液，立即在干冰上快速冷冻，并在−80°C下储存，直到提取DNA。CNRPC（保证号18747）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准了所有动物研究。
猕猴阴道微生物组采样方法的比较。（A） 取样动物的年龄、（B）末次月经后的天数和（C）通过阴道拭子（绿色）、CVL上清液（蓝色）和CVL颗粒（红色）的16S rRNA V3-V4序列确定的样本计数。（D） 细菌属的相对丰度和（E）显示了使用加权UniFrac距离度量的主坐标分析。
阴道微生物群落序列测定
使用Qiagen DNeasy PowerSoil试剂盒分离DNA(马里兰州Germantown Qiagen)和引物对319F/806R使用两步PCR程序扩增16S rRNA的V3-V4结构域。在第一步中，正向和反向引物都包含Illumina标签序列、可变长度间隔子、连接子序列和16S靶序列，以增加多样性并提高测序和运行质量。每个25μl PCR反应包含1个单位的Kapa2G稳健热启动聚合酶（马萨诸塞州威明顿市Kapa Biosystems）、1.5 mM MgCl20.2 mM dNTP混合物，每个引物0.2μM，每个样品1μl DNA。
在第二步中，使用唯一的正向和反向条形码组合对每个样品进行条形码编码，其中包含Illumina P5适配器序列、唯一的8 nt条形码、步骤1中使用的正向适配器的部分匹配序列，以及具有Illuminia P7适配器序列、独特的8 nt条码、，以及步骤1中使用的反向适配器的部分匹配序列。第二步中的PCR反应包含每个唯一条形码引物的0.2μM最终浓度和第一步中PCR反应的1μl产物。
使用Qubit宽范围DNA试剂盒在Qubit仪器上对最终产物进行定量（Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)单个扩增子以相同的浓度混合。使用Ampure XP珠清洁池库(加利福尼亚州布雷亚市贝克曼·库尔特)在1.5%的凝胶上通过凝胶电泳分离出感兴趣的条带(Sage Science，马萨诸塞州贝弗利). 在加州大学戴维斯分校基因组中心DNA技术核心的Illumina MiSeq仪器中，通过qPCR和300-bp配对测序对文库进行量化。
结果
本研究的目的是确定CVL捕获的细菌群落代表性是否与阴道拭子获得的细菌群落相似。如中所示，每个样本的平均样本数为17427个（范围：10435–30821），不同采样方法之间的样本数没有显著差异(). FGT下部最丰富的十个细菌属是卟啉单胞菌、梭杆菌、无胆浆菌、嗜肽菌、卡通氏菌、普氏菌、弯曲杆菌、摩比伦菌、梭状芽孢杆菌、和拨号器(). 使用加权UniFrac距离度量的主坐标分析（PCoA）表明，动物体内不同采样方法的细菌类群相对丰度具有可比性(). 年轻女性相对于年长女性的细菌分类群组成差异增加了微生物多样性随年龄变化的可能性，这应该在更大的研究中进行调查。
讨论
在这里，我们报告CVL在提供阴道微生物群的全面概述方面与拭子一样有效。这些发现与最近在人类身上进行的一项研究相一致，该研究表明，用植绒拭子、塑料抹刀和宫颈刷进行取样后，阴道微生物群的组成具有可比性(8).
然而，与人类不同的是，恒河猴微生物组是高度多菌的，每种动物平均有12个细菌属。拭子和CVL样本都能捕获这种多微生物组成的观察结果对NHP研究具有重要的实际意义。数据表明，拭子可以优先用于体液分析，CVL采样提供了类似的微生物组成概况。值得注意的是，尽管宿主DNA高度富集，但细胞CVL组分也适用于测定FGT的微生物。该信息支持在HIV疫苗/预防研究中通过CVL进行FGT采样。
鸣谢
作者感谢中国人民共和国灵长类服务部的工作人员，包括Miles Christensen和Wilhelm Von Morgenland，他们为本报告做出了贡献。本研究得到了加利福尼亚州国家灵长类动物研究中心基地拨款P51 OD011107的支持，并得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏和传染病研究所的支持，授予编号为K01OD023034和R03 AI13879（发给SSI）以及NIH国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所，授予编号为K01DK110264（至RR）。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
工具书类
1Gosmann C、Anahtar MN、Handley SA、Farcasanu M、Abu-Ali G、Bowman BA、Padavatan N、Desai C、Droit L、Moodley A、Dong M、Chen Y、Ismail N、Ndung'u T、Ghebremichael MS、Wesemann DR、Mitchell C、Dong KL、Huttenhower C、Walker BD、Virgin HW、Kwon DS。乳杆菌缺乏的宫颈阴道细菌群落与南非年轻女性HIV感染增加相关。免疫. 2017;46(1):29–37. 10.1016/j.immuni.2016.12.013公共医疗PMID:；PMCID:PMC5270628。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Petrova MI、van den Broek M、Balzarini J、Vanderleyden J、Lebeer S。阴道微生物群及其在HIV传播和感染中的作用。FEMS微生物版2013;37(5):762–92. doi:10.1111/1574-6976.12029公共医疗PMID:。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Anahtar MN、Byrne EH、Doherty KE、Bowman BA、Yamamoto HS、Soumillon M、Padavatan N、Ismail N、Moodley A、Sabatini ME、Ghebremichael MS、Nusbaum C、Huttenhower C、Virgin HW、Ndung'u T、Dong KL、Walker BD、Fichorova RN、Kwon DS。宫颈阴道细菌是女性生殖道宿主炎症反应的主要调节剂。免疫. 2015;42(5):965–76. 10.1016/j.immuni.2015.04.019公共医疗PMID:；PMCID:PMC4461369。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Spear G、Rothaeulser K、Fritts L、Gillevet PM、Miller CJ。在圈养恒河猴中，颈阴道炎症很常见，但与稳定的多微生物微生物组无关。公共科学图书馆一号. 2012;7(12)：e52992。doi:10.1371/journal.pone.0052992公共医疗PMID:；PMCID:pmc35322444。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Spear GT、Gilbert D、Sikaroodi M、Doyle L、Green L、Gillevet PM、Landay AL、Veazey RS。16S焦磷酸测序鉴定恒河猴生殖器微生物群与人类细菌性阴道病相似：作为HIV阴道感染动物模型的意义。艾滋病Res-Hum逆转录病毒. 2010;26(2):193–200. doi:10.1089/aid.2009.0166公共医疗PMID:；PMCID:PMC2835387。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Iyer SS、Sabula MJ、Mehta CC、Haddad LB、Brown NL、Amara RR、Ofotokun I、Sheth AN。不同采样方法采集的HIV抗体阴性女性生殖道HIV靶向CD4 T细胞的特征。公共科学图书馆一号. 2017;12(6)：e0178193。doi:10.1371/journal.pone.0178193公共医疗PMID:；PMCID:PMC5453484。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Lozupone C，Knight R。UniFrac：一种比较微生物群落的新系统发育方法。应用环境微生物. 2005;71(12):8228–35. 10.1128/AEM.71.12.8228-8235.2005公共医疗PMID:；PMCID:PMC1317376。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Virtanen S、Kalliala I、Nieminen P、Salonen A。16S rRNA基因分析用于阴道微生物群采样的比较分析。公共科学图书馆一号. 2017;12(7)：e018147710.1371/journal.pone.0181477公共医疗PMID:；PMCID:PMC5517051。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
