外科研究杂志。作者手稿；PMC 2020年2月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院1505682
硫化氢供体GYY4137通过内皮一氧化氮保护坏死性结肠炎和肠缺血小鼠模型的肠道
,1,三 ,1,三 ,三和1,2,三
娜塔莉·德鲁克
1印第安纳州印第安纳波利斯市儿科外科外科
三印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院
阿曼达·R·延森
1印第安纳州印第安纳波利斯市儿科外科外科
三印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院
扬·彼得·特温克尔（Jan Pieter te Winkel）
三印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院
特洛伊·A·马克尔
1印第安纳州印第安纳波利斯市儿科外科外科
2印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学莱利儿童医院
三印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院
1印第安纳州印第安纳波利斯市儿科外科外科
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三印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院
通信：Troy A.Markel，医学博士，印第安纳大学医学院外科助理教授，IU Health莱利儿童医院，705莱利医院医生，RI 2500，印第安纳波利斯，IN 46202，电话：317-437-2506，传真：317-274-4491
摘要
背景：
早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）通常是一种严重的外科疾病，预后较差。GYY4137是硫化氢（H）的长效供体2S） ，一种在实验NEC中保护肠道免受损伤的气体递质，可能通过保护肠道免受缺血引起的损伤。我们假设，在实验性NEC和缺血再灌注损伤中，给予GYY4137将改善肠系膜灌注，减少肠道损伤，并减少炎症反应，这些益处将通过内皮一氧化氮合酶依赖性途径介导。
方法：
C57BL/6野生型（WT）和内皮型一氧化氮合酶（eNOSKO）基因敲除（eNOSKO）幼鼠通过母体分离、配方喂养、肠内脂多糖和间歇性低氧和低温应激诱导NEC。幼犬每天腹膜内注射50mg/kg GYY4137或PBS载体。在单独的组中，成年雄性WT和eNOSKO小鼠接受肠系膜上动脉闭塞60分钟。在腹部闭合之前，将50mg/kg GYY4137或PBS载体注入腹腔。激光多普勒成像用于评估基线和P9时幼鼠以及基线和缺血后24小时成年小鼠的肠系膜灌注。安乐死后，将每只动物的末端回肠固定，石蜡包埋，切片，并用H&E染色。切片根据公布的损伤评分进行盲目分级。用ELISA法对肠组织进行均质化和细胞因子测定。使用Mann-Whitney比较数据，p值<0.05具有显著性。
结果：
与溶媒相比，NEC和I/R损伤后，GYY4137改善了WT小鼠的灌注，但在eNOSKO动物中这种作用消失了。组织学损伤遵循类似的模式，用GYY4137治疗的WT小鼠的肠道损伤减少，而eNOSKO组没有显著改善。NEC和I/R损伤组服用GYY4137后，eNOS的消融改变了细胞因子的表达，IL-6和VEGF存在显著差异。
结论：
GYY4137，H的长效供体2S、 具有作为NEC治疗化合物的潜力。它改善了实验性NEC和肠I/R损伤中的肠系膜灌注和肠损伤，这些益处似乎是通过eNOS依赖性途径介导的。
关键词：动物模型，坏死性小肠结肠炎，硫化氢，缺血再灌注，肠
简介：
坏死性小肠结肠炎（NEC）仍然是早产儿常见的一种疾病。目前可供选择的治疗方法很少，患者通常需要对病变肠道进行广泛的手术切除[1]. 其原因是多因素的，但缺血和肠坏死被认为是一种常见的最终途径。这些患者的死亡率估计高达40%[2]因此，迫切需要新的治疗方法。
越来越多的证据表明硫化氢（H2S） 作为一种在缺血期间具有潜在益处的化合物。两者都有体内和在体外研究表明，H可以挽救组织损伤，尤其是继发于缺血的组织损伤2S公司[三-6]. NEC的大多数实验动物模型涉及某种间歇性全身缺氧，再加上配方喂养和细菌抗原的肠道接种[7-9]. 虽然很明显，单纯的缺血损伤不会导致NEC，但进一步研究H2通过评估肠缺血再灌注（I/R）损伤的治疗，S可以得到支持，这是一个更加准确和可重复的模型。先前的研究表明，硫化钠（NaHS）、2S盐对成年小鼠肠道I/R损伤具有保护作用[10]，在与其他硫化氢供体的实验NEC中也证明了类似的益处[11].
在肠道I/R模型中，NaHS所带来的益处取决于内皮一氧化氮[10]. 内皮细胞组成性表达内皮一氧化氮合酶（eNOS），该酶产生气体传递物一氧化氮（NO）[12]. 这种分子起到血管扩张剂的作用，在围产期尤为重要[12,13]. 在我们之前的研究中，eNOS纯合敲除的动物在受伤后没有表现出与野生型小鼠在NaHS治疗下的改善相同的效果[10].
NaHS及其对应物硫化钠（Na2S） 均为室温下的盐，且具有短效性和高度挥发性。它们在水溶液中根本不稳定，其H2S生产在溶液中一经溶解就迅速下降。此外，它们有臭味，因此可能不太适合作为未来临床工作的治疗方法。合成选项包括AP39[10-氧代-10-（4-（3-硫氧代-3H-1,2-二硫基-5-基）苯氧基）癸基）三苯基溴化鏻]和GYY4137（吗啉-4-鎓4-甲氧基苯基（吗啉基）膦二硫代酸盐）。AP39被认为是直接靶向线粒体的，虽然目前可以在市场上买到，但一些实验室独立合成，其分子量因来源而异。因此，它可能不如久负盛名的GYY4137那么可靠。GYY4137之所以选择使用，是因为它是一种合成的长效H2S供体，在水溶液中24小时内提供稳定的气体浓度，并且比盐型供体更可预测[14]. GYY4137具有良好的特征性、稳定性、悠久的历史，在坏死性小肠结肠炎的临床应用中具有潜力。
在广泛临床应用之前，必须阐明GYY4137保护肠道的机制。除了组织损伤外，NEC还经常引起肠道组织中炎症反应和细胞因子级联的改变[15]. 白细胞介素6（IL-6）具有炎症和抗炎特性，在某些组织中受NO调节，并可能保护肠道免受损伤[16,17]. 白细胞介素10（IL-10）是一种抑制炎症传播的反调节细胞因子，但在NEC模型中通常升高[18]. 干扰素γ诱导蛋白10（IP-10，也被称为CXCL10）是一种趋化因子，在损伤期间对免疫细胞起化学吸引作用[10,19]. VEGF是一种内皮特异性血管生成因子，在内皮细胞损伤中释放[20]. 这些信号分子和许多其他分子在肠道损伤和恢复过程中发生改变，对于评估任何潜在的治疗都很重要。
我们假设GYY4137作为硫化氢供体通过eNOS依赖性途径保护实验NEC中的肠道。此外，我们假设这种益处是由于对间歇性I/R损伤相关损伤的保护，类似于我们的成人模型。
材料和方法
动物使用
印第安纳大学动物护理和使用委员会批准了实验方案和动物使用。本研究中使用的雄性成年野生型（WT）小鼠（C57BL/6J，库存编号：00664，8-12周/20-30g，Jackson Labs，Bar Harbor，ME）和eNOS基因敲除（eNOSKO）小鼠（B6.129P20Nos3tm1Unc/J，库存号：002684，8-12星期/20-30g；Jackson实验室，Bar Harbor，ME）在到达后48小时内进行习服，然后再参与实验。向动物提供正常的食物和水。
WT和eNOSKO小鼠幼崽是在家中从这些动物和同型雌性动物中繁殖的。实验幼崽与母亲分离，而对照幼崽则由母亲哺乳。实验期间，实验幼崽被保存在批准的卫星房内，在湿度40%、温度32°C的新生儿培养箱中。
实验NEC模型：
使用了先前验证过的实验NEC模型[8,11,21]. 简言之，实验组，WT和eNOSKO（n=10），在出生后第5天（P5）至第9天（P9）方案结束时与母亲永久分离。两个对照组（n=10）都与母亲一起随意喂奶。实验组用2根法国导管灌胃喂养，每天三次，其中300 kcal/kg/天的高渗配方奶粉含有8 mg/kg的脂多糖（脂多糖来源于大肠杆菌O111:B4，Sigma-Aldrich Company LLC，英国多塞特）。配方奶粉使用4g Esbilac犬补充剂和6g Similac与20mL纳米纯净过滤水配制而成（Barnstead nanopure，APS water Services Inc.，Van Nuys，CA）。在每次喂食之前，将幼崽放在含5%O的小室中2和95%N2持续10分钟。早晚喂食后，将幼崽置于4°C的冰箱中10分钟。
每天早上，实验组接受腹腔注射磷酸盐缓冲盐水（PBS）载体或50 mg/kg GYY4137（PBS中）。每次注射的总体积为10µL。对照组未接受任何注射。GYY4137剂量基于我们之前的工作和其他缺血和再灌注损伤动物模型[22]. 如果幼犬在研究开始后24小时内死亡，则将其排除在外，因为死亡很可能是由喂食技术错误而非NEC本身造成的。如果他们在24小时后死亡并立即被确认，他们仍然被纳入所有数据点的分析，包括组织评估。
临床评估：
对照组每天进行评估，而实验组则对每种饲料进行评估。以系统的方式对小学生进行临床评估评分，以确保一致性[8]. 这是以半盲的方式进行的，因为观察者在给幼崽打分之前不知道幼崽的治疗情况，但必须在记录数据之前找出各组。报告的临床评估分数是小狗在死亡或安乐死前的最后分数。
缺血再灌注损伤模型
I/R模型在单独的成年小鼠上进行，如前所述[10,23,24]. 成年小鼠（每组6只）用3%异氟醚麻醉，并用1.5%异氟醚氧气麻醉。脱掉头发，以无菌的方式准备腹部。术前皮下注射0.9%生理盐水（1mL）以补偿液体损失。术前皮下注射1mg/kg丁丙诺啡和5mg/kg卡普洛芬进行镇痛。
进行中线剖腹手术，并取出肠内容物。肠系膜的底部被一个非创伤性血管夹暂时封闭。肠被替换，腹部被丝线暂时缝合，以防止液体流失。60分钟后，重新打开腹部，取出微血管夹。然后用丝绸缝合的双层技术闭合腹部。在腹部闭合之前，动物接受了PBS（溶媒对照）的腹腔注射，或PBS中50 mg/kg GYY4137。每次注射的总体积为250µL。将动物从麻醉中唤醒，让其恢复，然后返回动物收容所。
灌注分析：
如前所述，使用激光多普勒灌注成像仪（LDI；Moor Instruments，Wilmington，DE）对NEC幼崽的肠道灌注进行经皮分析[11]. 这是在P5和P9上进行的，灌注量表示为P5上基线灌注量的百分比。对于成年小鼠，在基线、初始夹持（以确保成功封堵）和恢复24小时后剖腹手术期间获取灌注图像[10]. 灌注量表示为基线的百分比。
组织损伤评分：
实验组在安乐死后切除末端回肠，并在4°C的4%多聚甲醛中固定24小时。随后用70%乙醇脱水组织，石蜡包埋，切片，并用苏木精和伊红染色。组织学评分由两名盲法观察者使用上述方法进行[10,11].
对于幼崽组织，分数从0到4不等[11]. 0=正常肠道；1=绒毛肠上皮细胞的某些排列紊乱，绒毛核分离；2=绒毛肠上皮细胞明显排列紊乱，绒毛核沿绒毛两侧分离，绒毛变钝；3=绒毛上皮脱落，绒毛脱落；4=坏死。得分为2分或以上表示存在NEC，3分或以上则表示严重NEC。
使用成熟的成年评分系统对成年小鼠组织进行评分，如下所示[10]：0=无损坏；1=绒毛尖端的上皮下间隙；2=绒毛尖端粘膜衬里缺失；3=绒毛结构损失不到一半；4=失去一半以上的绒毛结构。
肠道细胞因子分析：
如前所述，获取并处理回肠末端的蛋白质[10,11,24,25]. 组织在液氮中快速冷冻并储存在−80°C。用Bullet Blender（Next Advance，Averill Park，NY）在RIPA缓冲液（Sigma，St.Louis，MO）中用磷酸酶和蛋白酶抑制剂的1:100稀释液解冻组织并使其均质。均化后，将样品以12000rpm离心，并收集上清液进行进一步分析。使用分光光度计（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司VersaMax微孔板阅读器）通过Bradford分析法对总蛋白进行定量。
使用ELISA（明尼苏达州明尼阿波利斯市生物技术公司研发系统）对NEC幼鼠样品和成年小鼠组织的Bio-Plex多重串珠分析系统（加州大力士市Bio-Rad）对小鼠IL-6、IL-10、IP-10和VEGF进行测量。重复所有ELISA和多重分析。ELISA以1:20稀释度进行，以1:25稀释度进行多重分析。为了解释个别平板和分析的差异，将WT和eNOSKO肠道样品的细胞因子归一化为各自的载体对照。
统计分析：
使用中位数和四分位间距报告顺序数据。连续变量报告为平均值±标准平均误差（SEM）。使用Mann-Whitney U检验比较所有非参数数据。所有统计分析和数据均使用GraphPad Prism 7（GraphPad-Software，La Jolla，CA）。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
GYY4137通过内皮一氧化氮依赖机制降低实验性NEC的临床严重程度。
在WT幼崽中，使用GYY4137治疗的幼崽在方案中的体重增加（4.0%±1.2）显著高于溶媒组（0.6%±0.7，p=0.0280），而在eNOSKO组，使用GYY4137（0.8%±1.7）和溶媒（2.7±1.17，p=0.3657）治疗的幼仔之间没有差异。临床疾病评分也显示出类似的结果。服用GYY4137的WT组的中位数得分为1（95%CI=0-2），而溶媒组的中数得分为3（2.75-5.25，p=0.0002）。在eNOSKO小鼠中，GYY4137组（4.5，3-5.25）和溶媒组（5，3-5.26，p=0.8259，).
GYY4137可改善WT动物的体重增加和临床状况，但对eNOSKO动物没有改善。A） WT-NEC组的体重增加百分比明显高于其溶媒对照组，而eNOSKO小鼠未观察到这种影响。B） 经GYY4137治疗的WT-NEC组的临床疾病评分有所改善，但eNOS消融后未观察到这种效果（*：与溶媒组相比p<0.05）。
GYY4137通过实验NEC中的内皮氧化依赖机制改善肠道灌注并减少组织损伤。
GYY4137治疗的WT幼崽的平均灌注为38.69%±2.02，而溶媒组为24.16%±4.45（p=0.0079）。eNOSKO小鼠没有出现同样的改善，因为GYY4137治疗组（21.77%±5.89）和溶媒组（28.26%±4.60）的灌流情况相似（p=0.6409）().
使用GYY4137治疗后，WT动物的肠道灌注得到改善，但eNOSKO组没有这种效果。A） 用GYY4137治疗的WT组P9灌注（以基线灌注百分比表示）有所改善，但eNOS组无差异（*：与溶媒组相比p<0.05）。B） LDI获得的代表性图像–每个图像的左侧是骨盆，右侧是隔膜。红色表示灌注较好的区域，蓝色表示灌注较差。
在组织学损伤评分中发现了互补模式，与溶媒（2.5，IQR 1.5-3.0，p=0.0011）相比，使用GYY4137（1，IQR1-1.625）治疗后，WT幼崽的损伤评分显著改善。eNOSKO组没有相同的结果，溶媒组和GYY4137组的中位数得分均为2.25（IQR溶媒：1.0-3.0，GYY317:1.9-3.0，p=0.7494）。就NEC严重程度而言，GYY4137将WT组中严重NEC的比例从30%降至0%，但eNOSKO组中40%的严重NEC发生率没有变化().
用GYY4137治疗的WT-NEC动物的肠道损伤不太严重，但在eNOSKO动物中用GYY4137治疗没有变化。A） 服用GYY 4137的WT-NEC组的组织损伤评分有所改善（*：与溶媒组相比p<0.05）。B） GYY4137治疗的WT动物中严重NEC的比例从30%提高到0%，而eNOSKO动物没有变化。C） 典型的组织学图像显示，GYY4137治疗的溶媒组和eNOSKO组绒毛脱落和结构破坏，仅GYY4107治疗的WT组绒毛结构相对正常。
GYY4137改善成人肠I/R损伤模型中的肠灌注并减少组织损伤。
I/R损伤后用GYY4137治疗的WT成年小鼠的平均灌注为79.74%±15.07，而车用治疗组为25.59%±6.05（p=0.0221）。在eNOSKO小鼠中，GYY4137组（51.62%±13.41）和溶媒组（32.48%±8.08，p=0.2403，).
GYY4137治疗后，I/R后WT成年小鼠的肠系膜灌注得到改善，但在eNOSKO小鼠中未观察到这种效果。A） 与溶媒相比，GYY4137治疗的WT小鼠的灌注（以基线灌注的百分比表示）显著改善，但eNOS消融后这种效果消失（*：与溶媒组相比p<0.05）。B） LDI的代表性图像显示，仅使用GYY4137治疗的WT组的灌注改善。在这些照片中，肠道被掏空，并在肠环周围创建了一个感兴趣的区域。红色表示灌注良好，蓝色表示灌注不良。
肠组织学损伤也有类似结果。与溶媒（4，IQR 2.0-5.0，p=0.0214）相比，经GYY4137治疗后，WT小鼠的粘膜损伤评分显著改善（2，IQR1.0-2.8）。eNOSKO动物没有发现这种益处，GYY4137组得分为3分（IQR 2.0-4.0），车辆治疗组得分为4分（IQL 3.3-4.6，p=0.0591，).
GYY4137可减少I/R后使用GYY41 37治疗的WT动物的肠道损伤，但不影响eNOSKO动物的损伤。A） 使用GYY4137治疗的WT I/R组的组织损伤评分显著改善，但eNOSKO动物没有发现类似的效果（*：与溶媒组相比p<0.05）。B） 4组的代表性组织学切片，显示载体组和用GYY4137治疗的eNOSKO组的绒毛结构都非常紊乱。只有接受GYY4137治疗的WT动物保留了正常肠道结构的外观。
GYY4137改变实验性NEC和肠I/R损伤模型中的炎症级联反应。
在GYY4137治疗的NEC组中，WT动物的IL-6显著高于eNOSKO动物（1.254±0.083倍于对照组）（0.839±0.047倍，p<0.0001）。与eNOSKO动物相比，WT幼崽的VEGF显著降低（0.733±0.053倍对照组）（1.488±0.140倍对照组，p<0.0001）。NEC组之间的IL-10（WT：1.084±0.083倍的对照，eNOSKO：0.884±0.080倍的对照，p=0.0859）和IP-10（WT：0.985±0.073倍的对照，eNOSKO：0.837±0.134倍的对照，p=0.3306）均无显著差异。
对于I/R模型，GYY4137治疗组的WT动物的IL-6水平显著低于eNOSKO动物（0.115±0.022倍于对照组）（1.089±0.428倍于对照）。与eNOSKO动物相比，WT动物的IP-10也显著降低（0.4231±0.066倍对照）（1.419±0.254倍对照，p<0.0001）。与eNOSKO组（对照组的1.334±0.180倍，p=0.0090）相比，WT组的VEGF同样减少（对照组0.807±0.065倍）。IL-10在各组之间无显著差异().
GYY4137治疗实验性NEC和I/R损伤模型后，细胞因子和生长因子畸变受到影响。GYY4137治疗实验性NEC（A）和缺血再灌注损伤模型（B）时，细胞因子和生长因子随着eNOS消融而变化。黑色条代表WT小鼠，灰色条代表eNOSKO小鼠。数值表示为溶媒治疗组的折叠变化，以便在不同的平板和动物菌株之间正常化，以进行比较。
讨论
GYY4137等硫化氢供体已被证明有助于防止组织缺血损伤[5,10,22,26,27]. 这种益处有多种理论机制，包括H2S通过硫水合和可能的其他作用修饰eNOS蛋白[28]. eNOS活性的增加将导致一氧化氮生成增加、血管舒张和防止组织缺血继发损伤。在此，我们已经证明GYY4137在eNOSKO小鼠中失去了有益作用，表明该化合物通过eNOS途径发挥作用。
在NEC模型中，GYY4137传递了临床益处，WT动物的体重增加和疾病评分降低证明了这一点，但eNOSKO小鼠失去了这一作用。GYY4137有可能减少肠道损伤，使野生动物能够更好地吸收营养。eNOSKO动物的体重增加减少，表明该蛋白在NEC期间对动物整体健康起着关键作用。车辆组的临床疾病评分相似，这证实了我们之前的工作[29]但GYY4137治疗后的改善仅见于WT组。
我们注意到，经GYY4137治疗的WT-NEC组肠系膜灌注得到改善，而eNOSKO组则没有这种效果。根据之前的研究，我们认为GYY4137可能通过eNOS减少缺血组织损伤[10,26,27,30]. GYY4137，充当H2S供体，可能是硫化eNOS，导致NO生成上调，血管舒张，并改善受威胁组织的血流[31]. 先前的研究表明，H的血管舒张作用需要内源性NO2这可能解释了为什么在eNOSKO小鼠中没有看到这种益处。[32]
NEC是一种复杂的病理学，有许多因素起作用，包括但不限于肠道不成熟、细菌定植和移位以及低温损伤。由于这种复杂性，我们使用肠I/R模型来评估GYY4137，从而隔离肠缺血方面。我们注意到，在WT小鼠中使用GYY4137治疗后，灌注改善的结果与eNOSKO小鼠相同。这些发现支持了我们的理论，即GYY4137在NEC期间通过eNOS依赖性血管舒张和改善肠道灌注来保护肠道，至少部分是这样[32,33].
除了改善灌注外，接受GYY4137治疗的WT幼崽和成年幼崽的肠粘膜损伤也有限。eNOS基因消融后，这种有益效果消失了。改善灌注可能在改善粘膜损伤方面发挥作用。然而，H2S供体，如GYY4137，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性[10,34,35]. 因此，GYY4137也可能通过限制粘膜水平的氧化应激和组织损伤提供二级保护。
有趣的是，在实验NEC和I/R模型中，细胞因子和生长因子对GYY4137的反应并不相同。在I/R模型中，与eNOSKO动物相比，经GYY4137治疗的WT动物的IL-6、IP-10和VEGF水平显著降低。相反，NEC模型有不同的结果，eNOSKO组的IL-6显著低于WT组，VEGF显著高于WT组。
IL-6总体上被认为是促炎性的，但在NEC期间确实有一些值得注意的保护和抗炎作用[15,16]. 事实上，我们之前在NEC中的研究表明，实验性NEC中IL-6降低，治疗后恢复到较高水平，表明IL-6可能在NEC期间起保护作用[11]. 在I/R模型中，我们之前已经显示了损伤后IL-6的增加以及H2S供体治疗，表明IL-6在I/R模型中可能有害。这些先前的发现与我们在这里给出的结果一致[10]. 这种自相矛盾的反应强化了一个事实，即NEC的发展还涉及其他因素；肠I/R损伤不能完全引起病理改变。此外，两种模型中WT和eNOSKO动物之间的显著差异支持eNOS参与GYY4137作用的理论。
经GYY4137治疗后，NEC模型和I/R模型中的IL-10均无差异。这可能是因为IL-10起到了抗炎细胞因子的作用，事实上，它已被用于动物模型中，以减少肠道损伤[36]. 而NEC和其他形式的肠道炎症通常会增加[37]与两种车型中的车辆相比，GYY4137似乎都没有对其施加任何应变。这可能是因为GYY4137通过内皮一氧化氮调节肠系膜灌注而起作用，并且其抗炎和抗氧化作用在这些模型中不太重要。
IP-10是巨噬细胞和其他免疫细胞的化学引诱剂，因此可以理解肠损伤状态下的水平会增加[38]. 在I/R模型中，GYY4137治疗导致WT小鼠的IP-10浓度远低于eNOSKO小鼠，但在NEC模型中，这些组之间没有差异。这些发现加强了这样一个观点，即尽管I/R损伤模型是干净和精确的，但新生儿实验性NEC具有更复杂的病理生理学。在以前的动物NEC实验中，巨噬细胞已被证明主导新生鼠肠道浸润，而在成熟小鼠中，招募的白细胞变化更大[39]. 这可能是IP-10在实验NEC中不降低GYY4137的原因之一。
最后，VEGF与肠道炎症和eNOS密切相关。这种生长因子在炎症反应中诱导血管通透性和血管生成，但其作用依赖于内皮一氧化氮的存在[20]. 我们注意到GYY4137治疗后eNOS消融术中VEGF显著升高，这可能是由于在无eNOS损伤的情况下VEGF上调所致。这也支持了我们的理论，即GYY4137主要通过eNOS发挥作用，支持血管舒张和改善肠系膜灌注，而不是通过该化合物的直接抗炎和抗氧化作用。
GYY4137有望成为稳定、长效的H2S供体通过eNOS保护肠道免受损伤。它可能至少部分通过直接保护缺血和再灌注损伤发挥作用，但也涉及其他因素，如炎症反应的不同异常所示。虽然eNOS的参与是明确的，但这些物质相互作用的确切性质需要进一步调查。
限制
我们之前的工作已经证明了WT和eNOSKO小鼠的一些基线差异，这可能会影响结果[29]. 因此，应尽可能将数值归一化为各自的控制值，以减少菌株之间的变异性。此外，NEC模型近似于人类NEC，但肯定不是人类复杂疾病过程的真实代表。该模型特别困难，因为直到安乐死后才能确定诊断。正如我们之前的工作所示，我们的NEC发病率约为70%，这与我们正在模拟的已发布模型一致[8]. 尽管存在这些不足，但它是NEC研究可用的最佳研究动物模型。
结论
GYY4137是实验性NEC的一种有益治疗选择，它通过eNOS依赖性途径发挥作用。鉴于GYY4137在NEC幼鼠模型和成年I/R模型中均能改善肠道灌注，因此该化合物可能通过eNOS促进肠系膜血管舒张。灌注改善可能会减少粘膜损伤，并改善损伤后的肠道炎症。在广泛临床应用之前，需要进一步研究以确定GYY4137和eNOS的特定分子相互作用。
脚注
NAD和ARJ负责动物护理和实验，NAD起草手稿，NAD、ARJ和JTW负责组织学分级和统计分析，NAD，ARJ和JTW负责蛋白质分离和组织分析，TAM提供了批判性意见、协助和手稿建议。所有作者都对手稿进行了批判性修订，并协助完成了最后的准备工作。
无需报告的披露。
这项工作在2018年的美国外科大会上发表。
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参考文献
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