PP2A-B55促进细胞有丝分裂后核膜重构果蝇属

PP2A-Tws和Lamin减少的鸡蛋和胚胎会导致NE缺陷和流产发育

我们假设tws公司和层粘连蛋白可能反映了PP2A-Tws在有丝分裂退出期间NER中的作用。为了确认tws公司和层粘连蛋白，我们测试了这两个基因的不同等位基因。三个低形态等位基因tws公司所有这些基因都增强了层粘连蛋白按以下强度顺序：行波管^aar1级>tws公司^P（P）>tws公司^{原子吸收率2}反过来，所有三个等位基因层粘连蛋白测试的增强等位基因tws公司按以下强度顺序：兰姆^K2（K2）≈兰姆^答25>兰姆⁰⁴⁶⁴³(图2 A). 为了探索观察到的致死性的细胞基础，我们检测了0至2小时龄的胚胎兰姆^K2（K2）/+；tws公司^P（P）/+母亲。蛋白质印迹证实，母亲对tws公司^P（P）和兰姆^K2（K2）突变产生的胚胎Tws和Lamin水平较低(图2 B). 免疫荧光显示，大多数正在进行有丝分裂发育的胚胎都有严重缺陷(图2 C). 细胞核通常位置错误，大小和形状异常。中心体经常与细胞核分离（在图2 D). 细胞质中可见游离的染色质团，通常附着在NE片段上，好像被切碎了一样。所有这些表型都可能是由于NE的弱点或缺陷所致兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+母亲也表达GFP-Polo作为有丝分裂结构的标记(Moutinho-Santos等人，1999年)揭示了细胞核/中心体单元的解体导致进一步的无序化，包括纺锤体融合和不均匀的细胞核间距（视频1和2）。胚胎由tws公司^P（P）/+或兰姆^K2（K2）/+突变体只表现出轻微的发育缺陷，例如偶尔中心体脱离细胞核(图2D和S2）。

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图2。

PP2A-Tws和Lamin之间的协作是合胞体胚胎发育所必需的。（A）不同等位基因之间的遗传相互作用tws公司和兰姆对所示基因型雌性胚胎的孵化率进行评分。误差条代表SEM。***，P<0.0001，双尾t吨测试。（B）胚胎的蛋白质印迹显示蛋白质水平如何受到母体基因型的影响。（C）通过对α-管蛋白（绿色）、γ-管蛋白和层粘连蛋白（红色）以及DNA（DAPI，蓝色）的免疫荧光显示胚胎中的表型。来自的胚胎兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+雌性，观察到几个缺陷：异常核分布（左）、形态和大小异常的间期核、中心体分离（黄色箭头）和断裂核（红色箭头）。比例尺，20µm。（D）所示基因型胚胎在不同细胞周期阶段观察到的游离中心体的定量。（E）所示基因型全球胚胎发育的量化。误差线代表SEM。*，P=0.0165；**，0.0021<P<0.0027；***，P<0.0001，双尾t吨测试。

尽管主要缺陷普遍存在于兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+在皮层检测到有丝分裂核的胚胎中，我们发现大多数卵子都没有达到这个阶段(图2 E). 因此，我们在减数分裂早期就研究了潜在的早期缺陷。正常情况下，卵母细胞在第一次减数分裂中期停滞，直到被母亲产卵。排卵触发了第一次减数分裂的完成，第二次减数分裂紧随其后，两个纺锤体在一个极点连接在一起。在第二次减数分裂结束时，四个单倍体细胞核在减数分裂间期的去凝聚染色质周围聚集一个NE。如果卵子已经受精，那么最里面的核通常会成为雌性原核，并且在第一次有丝分裂发生之前与雄性原核结合。其他三个细胞核最终聚集在一起并经历NE分解（NEB），染色质浓缩并与微管阵列结合为极体(图1A). 如果卵子没有受精，那么所有四个分裂后的细胞核都会聚集成一个极体。我们收集了0至20分钟龄的卵子/胚胎，并在固定后使用允许深度染色的方案进行免疫荧光分析。我们发现兰姆^K2（K2）/+；tws公司^P（P）/+减数分裂各阶段的卵，频率与单个突变卵相似(图3，A–I). 然而，在来自兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+母亲，我们发现拉明染色检测到的NE结构经常缺失或形状不规则(图3、F、G和J). 这些结果表明，当PP2A-Tws和Lamin水平减半时，成熟后间期细胞核的组装受到影响。使用针对X染色体的FISH，我们发现大多数来自兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+母亲形成一个包含至少一条X染色体的合子核，这表明女性原核有助于合子的形成（数据未显示）。因此，虽然NE形成受到影响，但原核并置仍然可能发生，这表明胚胎发育失败主要是由于早期有丝分裂减数分裂后发生的缺陷。

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图3。

PP2A-Tws和Lamin在减数分裂中为NER合作。收集鸡蛋0到20分钟，在甲醇中固定，并对α-管蛋白（蓝色）、DNA（绿色）和拉明（红色）进行染色。（A–D）来自的代表性图像兰姆^K2（K2）/+或tws公司^P（P）/+鸡蛋。（A）减数分裂后期纺锤体II。（B和C）减数分裂后间期；图中显示了三个核，每个核周围都有NE。（D）减数分裂完成后形成极体。（东-西）来自的代表性图像兰姆^K2（K2）/+;tws公司^P（P）/+双份鸡蛋。（E）减数分裂后期正常纺锤体II。（F和G）几个兰姆^K2（K2）/+;tws公司^P（P）/+减数分裂后间期的卵子要么有三个细胞核带有微弱且不规则的NE（与B和C相比，为F），要么三个细胞核没有NE（G）。（H）来自兰姆^K2（K2）/+;tws公司^P（P）/+母亲能够正常完成减数分裂，这表现为极体的形成。（一）鸡蛋来自兰姆^K2（K2）/+;tws公司^P（P）/+母亲完成减数分裂。观察到的表型分为减数分裂、减数分裂后间期（PMI）或完全减数分裂（以极体的形成为标志）。（J）用可检测的NE定量分析减数分裂后间期卵子的比例。对于I和J中的数据，数据来自两个单独的染色和打分，这两个染色和打评分是在多次收集后立即固定的鸡蛋进行的。比例尺，5µm。

为了探索拉明和PP2A-Tws之间遗传联系的特异性，我们测试了两者之间潜在的遗传相互作用兰姆^K2（K2）以及各种磷酸酶亚基的不同突变等位基因（表S2）。只有在兰姆^K2（K2）和tws公司或mts公司突变等位基因，表明PP2A-Tws在拉明蛋白中起着特别重要的作用。

拉明中CDK磷酸化共识位点控制其溶解度

基于这些结果，我们假设PP2A-Tws可以去磷酸化层粘连蛋白以促进其在NE的功能。磷酸化对层粘连的调控是复杂的，尚不完全清楚，但其在CDK位点的磷酸化已被证明可以促进不同系统中的层粘连层的分解(Heald和McKeon，1990年;Peter等人，1990年;Machowska等人，2015年). 在果蝇属到目前为止，七个最小CDK基序（S/T-P）中有六个被磷酸化(Machowska等人，2015年). 开始测试CDK位点是否需要磷酸化来传播果蝇属在有丝分裂中，我们将所有7个CDK位点突变为Ala（7A）或Asp（7D）残基(图4 A). 然后我们建立了稳定的细胞系，允许RFP-Lamin的诱导表达^重量、RFP-Lamin^第7章或RFP-Lamin^第7天和成像细胞分裂。而RFP Lamin^重量在间期定位于NE，在有丝分裂时分散于整个细胞(图4 B，顶部；和视频3）。相反，RFP-Lamin^第7章在有丝分裂过程中未能扩散，在假定的染色体周围形成一个伸长的肿块，随着细胞分裂，该肿块成功分裂成两个核仁状结构(图4 B，底部；和视频4）。这些结果表明，在CDK共有位点的拉明磷酸化是有丝分裂中拉明正常分散所必需的。然而，我们观察到RFP-Lamin^第7天也未能在有丝分裂中分散（数据未显示），可能是因为7个天冬氨酸取代并没有完全模拟磷酸化的效果。

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图4。

拉明CDK磷酸化共识位点的磷酸化可能促进其在有丝分裂中的分散。（A）所有七个最小的CDK磷酸化共有位点，如图Lamin结构所示(Lyakhovetsky和Gruenbaum，2014年)，突变为丙氨酸或天冬氨酸残基。星号（*）表示实验观察到的磷酸化位点(Machowska等人，2015年).（B）表达RFP-Lamin的细胞^重量或RFP-Lamin^第7章在旋转圆盘共聚焦显微镜上拍摄。T型₀被定义为细胞分裂时伸长的开始。而RFP-Lamin^重量在有丝分裂过程中变得分散，并在6分钟时开始被招募（箭头所示），RFP-Lamin^第7章细胞在有丝分裂过程中从不分散。比例尺，5μm。（C）所有CDK共识位点突变为Lamin中的Asp（Myc-Lamin^第7天)增加了其溶解度。表达所示蛋白质的稳定细胞系在裂解前按所示进行处理，并将不溶性物质制成颗粒（见材料和方法）。通过Western blot分析组分。（D）来自三个独立实验的可溶和不可溶部分的相对Western blot信号的量化，如B.误差条代表SD.*，P=0.0437，双尾t吨测试。（E）引入一个空等位基因CycB（循环B）(CycB（循环B）²)英寸林^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+女性拯救她们所生产的胚胎的发育。对指定基因型的雌性胚胎孵化率进行评分。误差条代表SD。**，0.0051<P<0.0095，双尾t吨测试。

为了从生物化学角度测试CDK位点的拉明磷酸化是否促进其在细胞中的扩散，我们制作了表达不同形式Myc-Lamin的细胞。细胞被溶解，提取物被离心，以从含有染色质的不溶性部分（颗粒）中分离出可溶性部分（上清液）。用Western blots分析裂解产物。而40%的Myc-Lamin^重量可溶，80%Myc-Lamin^第7天在这些条件下是可溶的(图4、C和D). Myc-胺^第7章行为类似于Myc-Lamin^重量在异步细胞的这些提取物中。这些结果表明，拉明CDK共识位点的磷酸化可能会破坏促进叶片组装的相互作用。用冈田酸（OA）处理细胞，该酸可抑制一系列磷酸酶，包括PP2A，增加Myc-Lamin的溶解度^重量与PP2A-Tws促进薄板组装的想法一致(图4、C和D). 然而，Myc-Lamin^第7章同样受到OA的影响，这表明Lamin上CDK位点外的磷酸化也可以破坏叶片（见下文）。

最后，我们利用遗传学测试细胞周期蛋白B-CDK1是否对抗PP2A-Tws和胚胎中拉明之间的协同作用。我们发现引入了CycB基因突变等位基因兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+女性部分地挽救了生育能力，这表明PP2A-Tws通过去磷酸化细胞周期蛋白B-CDK1位点（可能在拉明上）部分地促进了NER(图4 E).

PP2A-Tws在有丝分裂退出期间促进Lamin和Nup107向新生核的募集

上述遗传和生化结果表明，PP2A-Tws可能促进有丝分裂末期细胞核上的层粘连蛋白重组。为了测试这个想法，我们生成了一个果蝇属稳定表达GFP-Lamin和mCherry-α-Tubulin的D-Mel2细胞系，并通过RNAi检测Tws缺失对GFP-Lamin.重组的影响。Tws的沉默被Western blot证实(图5 A). 在对照细胞（转染了抗细菌卡那霉素抗性基因[KAN]的双链RNA[dsRNA]）中，GFP-拉明在后期纺锤体伸长5到10分钟后开始在重整细胞核上富集。相比之下，在Tws缺失细胞中，GFP-Lamin出现较晚，在纺锤体伸长后20至25分钟(图5、B和C). 我们得出结论，PP2A-Tws促进了NER期间拉明的招募。

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图5。

PP2A-Tws用于在有丝分裂退出期间及时招募Lamin和Nup107以重新组装细胞核。（A）Western blots显示Tws的RNAi缺失。（B和D）表达GFP-Lamin（B）或GFP-Nup107（D）和mCherry-Tubulin的细胞在转染抗Tws或细菌KAN基因的dsRNA后进行实时成像（非靶控）。红色框和黄色箭头表示GFP-Lamin或Nup107-GFP开始重新聚集细胞核。比例尺，5μm。（C和E）定量B和D实验中重组核的GFP-Lamin或GFP-Nup107募集。定量每个时间点重组核固定大小区域的荧光强度。在每种情况下，对29到45个细胞进行定量。阴影区域表示SD。P值来自双尾t吨测试。

我们想知道PP2A-Tws是否专门促进NER中拉明的招募，或者它是否也影响NE的其他成分。我们检测了Nup107，Nup107-Nup160亚复合物的一个成分，其在NE中的招募使核孔复合物组装成核，并不依赖人类细胞中的拉明(Clever等人，2012年;Schellhaus等人，2016年). 此外，人类Nup107在有丝分裂中被磷酸化，并被PP2A-B55有效地去磷酸化(Glavy等人，2007年;Cundell等人，2016年). 至于GFP-Lamin，GFP-Nup107的招募在Tws耗尽后延迟(图5、D和E). 我们还测试了努普107发现它们在基因上与tws公司，比如层粘连蛋白，具有相似的胚胎表型（图S3）。这些结果可以反映PP2A-Tws在Lamin和Nup107的去磷酸化中的作用，以促进其向NE的补充。或者，PP2A-Tws可以去磷酸化Lamin和Nup107上游的一个因子，以促进NER。

PP2A-Tws在有丝分裂退出过程中促进上游因子BAF向新生细胞核的募集

根据上述结果，我们寻找了一种可在NER期间由拉明和Nup107上游的PP2A-Tws调节的蛋白质。我们对BAF产生了兴趣，因为它的人类同源蛋白可能是NER级联中招募的第一个蛋白质(Schellhaus等人，2016年). BAF是一种保守蛋白，在间期与NE的DNA和LEM（LAP2-蛋白质MAN1）域蛋白相互作用(Margalit等人，2007年). 在人类细胞和秀丽线虫，BAF在早期有丝分裂时分散在细胞质中，并在末期重新聚集在DNA上，在DNA上将染色体结合在一起，从而在单个核周围形成NE(Haraguchi等人，2001年;Samwer等人，2017年). 此外，在末期BAF向染色质的募集已被证明依赖于PP2A秀丽线虫和HeLa细胞，尽管所涉及的PP2A的调节亚基的身份尚不清楚(Asencio等人，2012年).

为了检查果蝇属在细胞分裂过程中，我们建立了稳定表达GFP-BAF和mCherry-Tubulin的细胞系。我们发现了果蝇属BAF在间期为核，有丝分裂时分散在细胞内。在有丝分裂退出过程中，GFP-BAF很快被募集到染色质中，在纺锤体伸长4分钟后开始(图6，A[top]和B；和视频5）。我们测试了BAF的招募是否依赖于PP2A-Tws。在NER期间，Tws耗竭会导致GFP-BAF招募延迟。此外，招聘模式也发生了变化。在对照细胞中，GFP-BAF最初在染色体上强烈招募，但它们仍然出现浓缩（早期），然后GFP-BAF局限于核外周（晚期）。在人类细胞中观察到类似的动力学(Haraguchi等人，2001年,2008). 相反，在Tws缺失的细胞中，GFP-BAF募集立即局限于核外周，从未达到对照细胞中的峰值强度(图6，A【底部】和B；和视频6）。我们得出结论，PP2A-Tws促进了BAF在有丝分裂退出期间及时补充到染色体。此外，PP2A Tws似乎是NER开始时BAF向分离染色体强烈募集的早期阶段所需的。PP2A-Tws调节BAF在重组细胞核上的负荷的进一步证据来自我们的观察，Endos的耗竭选择性地抑制PP2A-Tws在早期有丝分裂中的表达(Rangone等人，2011年)，推进BAF招募（图S4）。

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图6。

PP2A-Tws是在有丝分裂退出期间及时募集BAF以重组细胞核所必需的。（A）在用针对Tws或细菌KAN基因的dsRNA转染后（非靶向对照），对表达GFP-BAF和mCherry-Tubulin的细胞进行实时成像。红色框和黄色箭头表示GFP-BAF募集的开始。比例尺，5μm。（B）定量A实验中重组核的GFP-BAF募集。定量每个时间点重组核固定大小区域的荧光强度。对于RNAi KAN和RNAi Tws，分别量化了26和25个细胞。阴影区域表示标准偏差。P值来自双尾t吨测试。

在秀丽线虫有丝分裂中染色质释放BAF是由VRK-1激酶磷酸化BAF触发的(Gorjánácz等人，2007年). 尽管果蝇属众所周知，BAF是体细胞正常细胞周期进展和NE组织所必需的，其在有丝分裂中的调控尚未被探索(Furukawa等人，2003年). 然而，在卵子发生过程中，BAF在前期被NHK-1激酶磷酸化，NHK-1是VRK-1的同源物(Lancaster等人，2007年). 因此，染色体在NE分解之前就与NE分离，形成一种称为核小体的紧密结构。BAF的NHK-1依赖性磷酸化的破坏导致染色体和NE之间持续结合，继而发生减数分裂缺陷和雌性不育(Lancaster等人，2007年). 我们假设NHK-1在磷酸化BAF以触发其在女性减数分裂中从染色质中释放的作用也可能在有丝分裂中起重要作用果蝇属为了测试这一点，我们突变了BAF中三个已知的NHK-1磷酸化位点(Lancaster等人，2007年)转化为丙氨酸残基（BAF^3A级; 图S5 A）。GFP-BAF公司^3A级与GFP-BAF不同的是，在有丝分裂中保留在染色体上^重量表明NHK-1对BAF的磷酸化是BAF在有丝分裂中扩散所必需的(图7，A和C，顶部；视频7和8；和图S5 B）。相比之下，磷酸化GFP-BAF^三维与GFP-BAF相比，在有丝分裂退出期间其向染色体的募集有缺陷^重量其动力学与GFP-BAF相似^重量Tws耗尽后（图S5 C；与图6 A). 这些结果表明，PP2A-Tws通过去磷酸化BAF上的NHK-1位点促进BAF在重组细胞核上的募集。

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图7。

BAF和层粘连蛋白向重组核的募集依赖于BAF去磷酸化。（A和C）表达RFP-Lamin和GFP-BAF细胞的实时成像^重量（A） 或GFP-BAF^3A级（C） 用dsRNA转染Tws或细菌KAN基因（非靶控）后进行。红色框和黄色箭头表示RFP-拉明开始向分离的染色体募集。白色箭头表示BAF^重量招聘。比例尺，5μm。（B和D）A和C实验中RFP-层蛋白募集的量化。在每个时间点对重组核的固定大小区域的荧光强度进行量化。在每种情况下，对20到35个细胞进行定量。阴影区域表示SD。（E）引进一个突变等位基因nhk-1型在里面兰姆^K2（K2）/+; 行波管^P（P）/+女性拯救她们所生产的胚胎的发育。对所示基因型雌性胚胎的孵化率进行评分。误差线代表SD.**，P=0.0012；***，P<0.0001双尾t吨测试。

接下来，我们测试了BAF在染色体上依赖Tws的募集是否足以募集拉明。在表达GFP-BAF的细胞中^重量和RFP-Lamin，我们发现，正如预期的那样，Tws的耗竭延迟了NER期间RFP-Lamins的补充(图7，A和B; 和视频9）。相反，在表达GFP-BAF的细胞中没有观察到拉明募集延迟^3A级耗尽Tws(图7、C和D; 和视频10）。这些结果表明，PP2A-Tws对BAF的去磷酸化促进了NER期间拉明的募集。然而，GFP-BAF^3A级在整个有丝分裂过程中没有在染色体上保留拉明，这表明拉明的募集不仅仅依赖于BAF去磷酸化，而且可能受到其他机制的调节。上述机制之一可能是PP2A-Tws对拉明的直接去磷酸化作用。

上述结果表明，观察到的行波管和层粘连蛋白在胚胎中，可能部分反映了PP2A-Tws在NHK-1位点BAF去磷酸化中的作用，并且这种去磷酸化是重组NE的层粘连蛋白补充所必需的兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+雌性可能会挽救它们的生育能力。有趣的是，引入两个突变等位基因中任一个的单一拷贝nhk-1型在里面兰姆^K2（K2）/+; tws公司^P（P）/+雌性挽救了它们所产胚胎的生存能力(图7 E). 这一结果表明PP2A-Tws在拮抗NHK-1促进女性减数分裂后的NER和合胞体有丝分裂中起着关键作用。

苍蝇培养、基因筛查和生育测试

根据标准程序进行苍蝇培养。在遗传筛查中，使用了417个包含大多数Drosdel缺陷的品系和一些额外的品系（从加拿大蒙特雷亚尔蒙特雷阿尔大学的马丁·勒夫兰索瓦和马克·塞里安获得），涵盖了大多数第二和第三染色体（完整列表见表S1）。每条线都交叉到y w；tws公司^P（P）/TM6B（TM6B）或mts公司^XE-2258型/青色线。苍蝇杂合子既有缺失也有tws公司^P（P）或百万吨^XE-2258型根据缺少平衡染色体的情况选择突变，并测试其生育能力（见下文）。表S3列出了本研究中使用的所有突变等位基因、其分子损伤及其起源。从布卢明顿获得了突变蝇系果蝇属Stock Center（印第安纳州布卢明顿）、Aldelaide Carpenter和David Glover（英国剑桥大学）、Hiroyuki Ohkura（苏格兰爱丁堡Wellcome细胞生物学信托中心）或Marc Therrien（加拿大魁北克省蒙特雷大学）。表达GFP-Polo的苍蝇取自Claudio Sunkel（葡萄牙波尔图Celular生物分子研究所）。

对于中所示的生育测试图4 E,7东经（左）、S1 B和表S2，每管将3至5只1至4天大的处女与3至5头俄勒冈州R雄性杂交，并在25°C下保存1天。然后将苍蝇转移到含有葡萄汁琼脂和酵母膏的试管中。1天后，苍蝇再次被转移到新的试管中。24h后，计数孵化胚胎的百分比。每次统计大约100个胚胎，这个评分至少重复三次。对于中所示的实验图2A,7东经（右），S1 A和S3，对5至10只单身处女与3至5只俄勒冈州R雄性杂交后代的生育能力进行评分。用于基因筛查(图1D和表S1），三到五只雌性（不一定是处女）与三到五只俄勒冈州R雄性杂交，在连续三天对其生育能力进行评分，并将数字汇总。

胚胎和卵子免疫染色

如图所示的免疫荧光图2 C雌鼠在25°C的葡萄汁琼脂上放置胚胎2小时。如前所述，胚胎立即脱绒毛并固定(Archambault等人，2007年). 以下一级抗体用于染色：来自小鼠的抗Lamin Dm0 ADL84.12（1:100；发育研究杂交瘤库），来自大鼠的抗-α-微管蛋白YL1/2（1:50，#6160；Abcam），以及来自小鼠的抗-γ-微管蛋白GTU-88（1:50，#T5326；Sigma）。在4°C下对一级抗体进行过夜培养后，在室温下用与Alexa Fluor 488（1:200；Invitrogen）或Cy3（1:200，Jackson）偶联的二级抗体培养胚胎2小时。DNA用DAPI标记。使用Vectashield（Vector Laboratories）安装胚胎。图像使用带有63倍油物镜的LSM 700共焦显微镜（蔡司）生成，并使用Photoshop进行处理。

用于检查减数分裂(图3)，雌性在琼脂平板上产卵20分钟，然后将卵子脱胆碱并在0.7%NaCl和0.05%Triton X-100的溶液中清洗。然后将鸡蛋固定在1:1的庚烷/甲醇溶液中，然后在100%甲醇中清洗；在90%、70%和50%甲醇中依次复水；并在PBS+0.2%吐温中洗涤。然后用1:100抗拉明ADL 67.10（来自小鼠）（发育研究杂交瘤库）、1:2000大鼠抗α-管蛋白YL1/2（Sigma）和Oligreen（Invitrogen）孵育卵子。使用二级Alexa缀合的抗体（1:1000）。然后使用1,2,3,4-四氢萘（Sigma）将鸡蛋装好。在Olympus FV1000扫描共聚焦显微镜上使用60×水物镜拍摄图像。

果蝇属细胞培养与药物治疗

D-Mel2细胞在添加谷氨酰胺、青霉素和链霉素的Express Five培养基（Invitrogen）中培养。在含有10µg/ml速溶菌素的选择培养基中生成稳定的细胞系。通过添加CuS0诱导铜诱导启动子下转基因的表达₄（300µM）置于培养基中至少8 h。对于磷酸酶抑制，细胞在被溶解进行免疫沉淀之前用100 nM OA（Bioshop）处理30 min。为了抑制CDK1，细胞在裂解前用10µM RO-3306（Tocris Bioscience）处理1 h和30 min。

瞬时转染

70%至80%的D-Mel2细胞在六孔板或25cm中汇合²按照制造商的指示，使用X-tremeGene HP DNA转染试剂（Roche）分别用2.5µg或5µg质粒转染烧瓶。在进行分析之前，细胞在25°C下培养24至72小时。对于RNAi，将60-70%融合的细胞置于六孔板中，并用25µg dsRNA转染Tws、NHK-1或Endos，以及Transfast试剂（Promega）。针对细菌耐药基因KAN的dsRNA被用作非目标对照。在分析之前，将细胞在25°C下培养72–96小时。

定时显微镜

使用63倍油物镜和Axiocam 506单相机（蔡司），在荧光显微镜（Axio Observer.Z1；Zeiss）上安装的旋转盘共焦系统（CSU-X1 5000；横河）上对培养细胞和胚胎进行时间荧光成像。

解放军

稳定表达GFP-Tws和Myc-BAF的D-Mel2细胞^重量用4%甲醛（Sigma）固定，然后在室温下用来自兔子的抗GFP（1:200；Invitrogen）和来自小鼠的抗Myc 9E10（1:200，Santa Cruz Biotechnology，Inc.）培养细胞1小时。PLA使用制造商描述的Duolink启动试剂盒（Sigma）进行。使用Duolink抗兔+和抗鼠-探针。在扩增步骤中，在室温下用与兔Alexa Fluor 488（1:200；Invitrogen）、小鼠Cy3（1:200，Jackson）和小鼠Alexa Fluor 566偶联的二级抗体培养细胞2小时。DAPI用于DNA染色。使用LSM 700共焦显微镜拍摄图像，并使用Photoshop进行处理。

免疫沉淀和蛋白质印迹

对于每个样本，采集400万到2000万个如上转染的细胞，并在含有蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF、10µg/ml抑肽酶和10µg/ml亮氨酸蛋白酶抑制剂）的PBS中清洗。细胞在75mM K-Hepes、pH 7.5、150mM NaCl、1mM DTT、2mM MgCl中裂解₂、2 mM EGTA和1%Triton X-100，含上述蛋白酶抑制剂。将裂解液在4°C下以14600 rpm离心10分钟。将澄清的裂解物与来自兔子的抗GFP（Invitrogen）在4°C的轮子上孵育1小时，然后与15至20µl蛋白a结合的Dynabeads悬浮液（Life Technologies）在4℃孵育45分钟。在1 ml裂解缓冲液中洗涤珠4×5 min，并在Laemmli样品缓冲液中直接洗脱，以进行SDS-PAGE。Western blotting中使用的抗体包括兔抗GFP（Invitrogen）、小鼠抗Myc 9E10（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、抗Lamin Dm0（DSHB杂交瘤产品ADL84.12）、鼠抗α-Tubulin DM1A（Sigma）、兔抗Tws（Thermo Fisher Scientific）、兔抗H3（NEB）、，兔抗内毒素（由Thermo Fisher Scientific定制）、小鼠抗Flag M2（Sigma）、过氧化物酶结合纯化兔IgG（Jackson）、过氧酶结合AffiniPure山羊抗小鼠IgG。用于分析突变胚胎的蛋白质水平图2如上所述，收集俄勒冈州R区和单、双突变雌性的胚胎，并用含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液清洗，然后在4°C下以14600 rpm离心10分钟进行粉碎和澄清。在SDS-PAGE之前，使用Bradford蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad）对上清液中的蛋白质水平进行定量。对所有样品装载相同质量的总蛋白，并通过免疫印迹分析蛋白质。

磷酸酶测定

收集大约2亿稳定表达Flag-Tws、Flag-Wdb或Flag-GFP的D-mel2细胞，并在4°C下以1500 rpm离心5分钟。将颗粒悬浮在含有蛋白酶抑制剂的TBS中（1 mM PMSF、10µg/ml抑肽酶和10µg/ml亮氨酸蛋白酶）。在含有20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM EGTA、0.5%NP-40、1 mM DTT和蛋白酶抑制剂（如上所述）的缓冲液中溶解细胞，并在4°C下在转轮上培养15分钟，然后在4℃下以4600 rpm离心15分钟。将上清液与反标记抗体在4°C的转轮上培养75分钟，再与蛋白G结合的Dynabeads（Life Technologies）培养45分钟。在用作磷酸酶分析的酶源之前，用裂解缓冲液清洗珠子4×5分钟。以下肽被用作底物：BAF-pS5、MSGTpSQKHRNFVAEPMGNK；PRC1-pT481，SKRRGLAPNpTPGKARKLNTTT；PRC1-pT602、LSKASKSDATSGILNSpTNIQS（均由Biobasic合成）。2×反应溶液包含400µM肽、20 mM Tris、pH 7.5、5 mM MgCl₂1 mM EGTA、20 mMβ-巯基乙醇和1.45 mg/ml BSA。对于磷酸酶反应，将等体积的2×反应溶液和洗涤珠悬浮液混合，并在室温下在96 well板中培养。通过添加90 mM HClO停止反应₄通过添加1体积的1 M孔雀石绿溶液，可以发现磷酸盐的释放。然后使用平板读取器（Tecan Infinite 200 PRO）在620 nm波长下测量吸光度。对于中显示的结果图9 B从Flag-Tws和Flag-Wdb获得的测量值中减去用Flag-GFP获得的每个时间点的比色测量值。T的值₀也从两个系列中减去。通过将获得的最高值固定为1（2小时后与PRC1-pT602肽上的Flag-Tws相关的活性），对所有值进行标准化。此外，通过将与Flag-Wdb相关的活性除以来自Flag-Wdb免疫沉淀/Flag-Tws免疫沉淀复合物的Mts带强度的比值，对反应中存在的PP2A催化亚单位（Mts）的数量进行归一化。

我们感谢马丁·勒弗兰索瓦、马克·塞里安、大卫·格洛弗、阿德莱德·卡彭特、大久拉、克劳迪奥·桑克尔和布卢明顿果蝇属航班库存中心。我们感谢V.Archambault实验室成员的评论和讨论。

这项工作得到了加拿大卫生研究院（向V.Archambault提供MOP-13558）和加拿大自然科学与工程研究委员会（向V.Archambault提供402217-2011 RGPIN，向A.Swan提供RGPIN-2017-05839）的支持。H.Mehsen、V.Boudreau、D.Garrido、M.Larouche和V.Archambault持有或持有魁北克省圣公会的奖学金。免疫与癌症研究所部分由加拿大创新基金会和魁北克-桑特费切基金会支持。

作者声明没有竞争性的经济利益。

作者贡献：V.Archambault、H.Mehsen和V.Boudreau设计了该项目。H.Mehsen、V.Boudreau、D.Garrido、M.Bourouh、M.Larouche和A.Swan进行了实验。V.Archambault、A.Swan和P.Maddox监督了这项工作。V.Archam bault，H.Mehsen，A.Swan，V.Boudreau和M.Bourouh撰写了这篇论文。